胚胎干细胞的特点及应用前景

发育生物学论文

姓名：陈金龙

班级：生工03班 学号：20126562

胚胎干细胞的特点及应用前景

摘要：

胚胎干细胞又称ES细胞, 是指胚泡期的内细胞团中分离出的尚未分化、能在体外培养、具有发育全能性的早期胚胎细胞。ES细胞具有胚胎细胞和体细胞的某些特性, 既可进行体外培养、扩增、转化和制作基因突变模型等操作,又保留了分化成包括生殖细胞在内的各种组织细胞的能力。因此, 具有无限增殖、自我更新和多向分化的潜能。

ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构,细胞核大,有一个或几个核仁,胞核中多为常染色体质,胞质胞浆少,结构简单,胚胎干细胞具有正常的、完整及稳定的染色体核型。体外培养时,细胞排列紧密,呈集落状生长。用碱性磷酸酶染色,ES细胞呈棕红色,而周围的成纤维细胞呈淡黄色。细胞克隆和周围存在明显界限,形成的克隆细胞彼此界限不清,细胞表面有折光较强的脂状小滴。细胞克隆形态多样,多数呈岛状或巢状。

胚胎干细胞广泛应用于克隆动物的生产、遗传育种、人类遗传病动物模型的构建、人类器官移植材料的生产、细胞分化机制的研究等领域。胚胎干细胞主要来源于两种组织: 早期胚胎内细胞团分离的ECS和胚胎生殖岭分离的胚胎生殖细胞。由于这些细胞具有高度复制能力及多向分化潜能, 已被用于生命科学的各个领域。

关键词：胚胎干细胞 特性 无限 应用前景 1、胚胎干细胞的主要特点

1.1 全能性或多能性

ES 细胞具有发育的多潜能性, 在体外可诱导分化出属于三个胚层的分化细胞。若注射至同种同基因小鼠体内, 可分化产生由多种不同组织组成的畸胎瘤。

1.2 种系传递性

ES 细胞具有种系传递功能。若把十几个ES 细胞在体外注射至另一胚泡内, 使之与受体胚胎细胞混合, 再植入假孕受体鼠子宫,可发育获得嵌合体胚或鼠。ES细胞可参与受体胚胎的各种器官组织并形成生殖细胞, 后者称为种系传递(germ line transmission), 因为通过育种交配可以分离出带有ES 细胞遗传性状的小鼠。这是ES 细胞具有种系传递能力(发育全能性)的一种证明。细胞发育全能性的本质现在还很少了解, 近年有研究证明一种属于POU 结构域的转录因子Oct-4 基因所表达的蛋白是一个细胞全能性的标志, Oct-4 基因缺失的胚胎不能形成真正的全能胚胎细胞, 只能发育到囊胚期为止。

1.3 体外遗传的可操作性

ES 细胞在体外可以进行遗传操作, 包括： (1) 导入报告或标志基因, 或一个异源基因;

(2) 加入额外的原有基因使之过表达(增加功能);

(3) 通过质粒DNA 与染色体上有关基因序列发生同源重组剔除该基因, 即基因打靶(失去功能) 以及(4) 诱导某个基因的突变。ES 细胞经遗传操作后一般认为仍能保持其扩增和发育多潜能性, 因此可通过它的第二个特性制备转基因鼠或基因有缺失、突变或过表达的杂合或纯合小鼠进行各种功能分析。

1.4 无限增殖性

ES 细胞具有无限增殖性。胚胎干细胞在体外适宜条件下, 能在未分化状态下无限增殖。在所有从骨髓抽取的人类干细胞中,人类胚胎干细胞是唯一可以分化成身体上不同种类细胞,当中包括脑细胞和心脏细胞等高度分化、并缺乏再生能力的细胞。

2、胚胎干细胞的研究状况

2.1 胚胎干细胞的研究历史

ES细胞研究，首先源于畸胎瘤干细胞或胚胎瘤细胞。

1958年，Steven通过把小鼠早期胚胎移植到129小鼠精巢或肾脏被膜下得到了EC细胞。

1981年，英国剑桥大学的Evans和Kaufman用延缓着床的胚泡和美国加州大学旧金山分校的Martin用条件培养基分别成功地分离、体外培养了小鼠的ES，从此进入了胚胎干细胞培养建系的新纪元。此后，人们建立了许多动物的ES细胞系。

1990年，Evans、Strojek及Piedrahila各自成功地建立了猪类ES细胞系。 1992年，Matsui等用小鼠原始生殖细胞首先建成EC细胞系，又开创了一种新的建立全能性(或多能性)细胞系的材料。

1994年，Robert用牛原始生殖细胞建成EC细胞系，证明了原始生殖细胞可以作为建立全能性(或多能性)细胞系的新型材料。

1995年Thomson等从恒河猴的胚囊中分离、建立了ES细胞株，这是第一个建株的灵长类动物的ES。近年来，美国Wiscosin 大学的Thomson 和Hopkins大学的Gearhart分别用不同的方法成功的得到了几个人的ES细胞系，这一工作奠定了对人ES实验研究的基础。

1997年，Shims用猪原始生殖细胞建成EC细胞系，但是日前对猪全能性(或多能性)细胞系的研究，仍集中在ES细胞系的建立及传代问题上。

2.2 胚胎干细胞的分化和定向分化研究

目前ES 细胞体外分化研究倾向于从细胞谱系分化出发, 去寻找多潜能的祖细胞(progenitorcells), 研究从多能祖细胞如何转向限能的定型(committed) 谱系细胞, 研究细胞定型的分子机制。在造血系统这个至少有8 个细胞谱系的发育系统方面所做的工作比较多, 也较为突出。近年应用极为敏感的单个细胞RT—PCR 分析法以及谱系限定的转录因子基因共表达的分析, 已证明定型以前的多能造血祖细胞的基因表达型式是一个供多方面选择的杂合型式, 而当细胞定型时则通过强化某些基因的表达并抑制另一些基因的表达来形成某个单一谱系所特有的基因表达型式。现在ES/EBs 系统已不但能分化出红系、髓系和淋巴

系前体细胞(precursor), 也可得到天然杀伤细胞的前体细胞。

又如在哺乳动物胚胎发育的卵黄囊时期血细胞生成(hematopoiesis) 和血管生成( vasculogenesis)是同时发生的, 一直怀疑两者有共同的祖细胞———hemangioblasts。最近, Choi 等在EBs 的体外培养中找到了一种能生成红细胞和血管的相当于hemangioblasts的共同祖细胞

在神经细胞和心肌细胞等的体外分化研究中,人们也在努力寻找从ES 细胞分化的前体细胞以便进一步研究谱系分化。ES 细胞在体外分化中同时产生不同类型的分化细胞反映了多能干细胞的一种不受约制的自我无序发育。

ES 细胞的定向分化则意味着要控制它们的分化, 导向产生一个单一类型的分化细胞, 这是一个探索性很强的课题。但是随着人们对细胞分化的分子机制有更多的了解, 必将发现在基因表达调控方面许多细胞类型专一的转录因子、细胞专一蛋白或细胞因子在细胞决定、定型和分化中起作用。将这些因子或专一蛋白的调控元件转染ES 细胞再进行体外分化, 有可能会驱动一些专一标志基因的表达而产生定向分化的效果。最近SOX 家族基因被发现为脊椎动物神经组织的决定和分化的重要因子后, Li 等在ES/ EBs 分化的早期分散细胞, 并采用无血清培液等措施可富集神经上皮细胞的比例, 减少非神经细胞的出现。在此基础上将神经元专一转录因子SOX2 基因与报告基因β geo 结合后转杂ES 细胞, 重做EBs 分化实验, 再结合RA 诱导和G418 筛选, 可获得90%以上β-半乳搪苷酶染色阳性的表达神经元标志的神经细胞。又如,KIug 等利用心肌细胞α-肌球蛋白重链的启动子与选择性标志基因结合后转染ES 细胞, 用EBs 方式诱导分化, 再结合物理方法选择, 可获得99%纯的心肌细胞。在我们实验室前几年曾用细胞因子TGF-β1 基因转染ES 细胞, 建立该基因过表达的ES细胞克隆, 用RA 诱导做EBs 分化实验, 可使95 %以上EBs 都产生大量内皮细胞前体细胞, 以后迁移分化形成血管样结构, 这是一个适于研究内皮细胞发生及血管形成的模型, 提示TGF-β 蛋白的增加会改变ES 细胞分化的微环境, 从而导向内皮细胞和血管样结构的产生。

ES 和EG 细胞定向分化研究还处于起步阶段,但由于人体ES 细胞和EG 细胞的建系成功所带来的诱人应用前景, 必然会推动定向分化, 甚至整个胚胎干细胞生物学的研究。

3、胚胎干细胞的应用前景 3.1细胞分化机制研究

利用ES细胞体外培养技术,可不受干扰地对单一影响胚胎细胞分化的因子进行系统研究。ES细胞在细胞分化研究中的主要作用是:(1)研究饲养层抑制ES细胞分化的生理机制, 这将有利于人们从基因转录、翻译等水平对细胞进行操作, 定向改变细胞分化的方向。(2)研究ES细胞的定向分化。培养的ES细胞在去除分化抑制因素或添加诱导分化因子后就会发生定向分化, 形成某种类型组织细Thomas研究发现, 体外培养的ES细胞能自行向内脏卵黄囊、血岛及心肌细胞定向分化。Smith等实验证明胚细胞在不含分化抑制物的培养基中能分化形成中胚层;当ES细胞在禽DIA和维生素A酸的培养基中, 则分化形成体壁内胚层。

3.2 育种和良种繁殖

首先,可以生产克隆动物, 大幅度提高良种家畜的繁殖效率, 加速动物良种化进程。其次,可以拯救濒危物种,保存稀有动物遗传资源。再次,利用异种动物细胞核移植和异种动物胚胎嵌合的方法可获得具有新性状的克隆动物或异种动物的嵌合体, 可以克服种间繁殖障碍, 创造新物种。另外, 利用细胞核移植技术可以同时克隆遗传基础完全相同的生物个体。这些生物个体可用于遗传参数的估测, 饲料营养价值的评定以及环境与动物关系的研究等领域。

3.3特异性分化细胞系的建立

胚胎干细胞的优势首先体现在它的多向性或全能性分化能力上。目前, 人们正致力于人类胚胎干细胞的识别、分离、体外培养扩增与分化诱导工作。包括对其它来源的干细胞, 如造血干细胞、间质干细胞以及神经干细胞等的研究。以期最终解决目前临床上难以解决的治疗问题。

3.4器官移植

在适度的控制条件下, 胚胎干细胞可在体外培养体系中形成各种人体组织,甚至人体器官。干细胞技术的理想阶段就是希望在体外进行\器官克隆\以供病人移植。

3.5 基因治疗研究

胚胎干细胞可用于基因治疗研究,或者说与基因治疗技术结合起来而为人类健康服务。

3.6在寻找新药方面的应用

在传统寻找新药时, 常用原代细胞、修饰过的肿瘤细胞或转基因细胞。与原代细胞或修饰过的细胞相比, 干细胞具有很多优点:基因正常, 有独特的生理反应, 可长期培养、扩增,因而哺乳动物干细胞技术的应用为在细胞水平评估药物作用的靶细胞及一些新的治疗方法效果提供了新的机会。

3.7新基因开发与基因功能分析

对小鼠ESC基因进行目的性操作, 实现了哺乳动物基因功能性研究的重大突破, 确定了许多基因在正常生长发育和生理过程中的功能及在疾病发生中的作用。通过与基因打靶技术相结合, 对hESC进行基因重组特定基因删除或突变有助于人类基因功能研究, 还可建立某些更为适宜的人类疾病模型进行药物筛选。

4、面临的问题 4.1 ESCs 细胞分化

从理论上讲，ESCs 细胞具全能性,可获得一种我们需要的细胞,但实际工作的进展却很慢。细胞分化是多种细胞因子相互作用引起细胞一系列的生理生化反应的过程， 必须了解各种因子的具体作用和作用时间， 才能得到产生某种特异类型的分化细胞， 且抑制分化因子的剂量需进一步研究。

4.2 ESCs 细胞移植后细胞存活和畸胎瘤的问题

小鼠ESCs 细胞注入成鼠皮下可形成畸胎瘤，目前对形成畸胎瘤所需ESCs 细胞的最少数量及最短时间还无定论。人ESCs 细胞也具有相似特性。为防止畸胎瘤，应对ESCs 进行细胞选择，排除多余多能干细胞的影响。

4.3社会伦理问题

由于胚胎干细胞的研究涉及生命的定义和来源， 因此受到宗教界等相关人士伦理道德方面的争议。然而，人类干细胞方面的研究进展及其与克隆技术结合在治疗人类某些疾病上的应用前景， 促使美国政府放松了对人类胚胎干细胞研究的限制。美国总统奥巴马在竞选中曾承诺，将取消目

前关于利用人类胚胎干细胞作研究的行政禁令。英国政府也在考虑放宽对人类克隆的限制， 允许治疗性克隆，禁止繁殖性克隆。

5、总结

总之，目前胚胎干细胞的研究已经取得了巨大的成就，但是，将胚胎干细胞应用于临床, 还需要人类的大量的工作, 这个领域的技术突破将推动生命科学的巨大前进, 只有一些关键性问题的解决才能使胚胎干细胞研究的价值真正得到体现。

参考文献：

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发育生物学论文

姓名：赵志强

班级：生工03班 学号：20126563

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