定量PCR Taqman探针设计要领

定量PCR+Taqman探针设计要领

自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。

一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。

第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DN***段重叠的情况）内。

第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则： 总体原则

* 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。

* 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。 * 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。

* 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。

* 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G） * 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。

引物设计原则

* 序列选取应在基因的保守区段

* 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构

* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

* Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60% * 引物之间的TM相差避免超过2℃

* 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 * 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。 * Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp

* 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

探针设计原则

* 探针位置尽可能地靠近上游引物

* 探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性 * 检测探针的DNA折叠和二级结构

* Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%

* 探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。 * 整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。

* 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。

Taqman MGB 探针设计

* 探针的5’端避免出现G，即使探针水解为单个碱基，与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。

* Tm值应为65-67℃。

* 尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于13bp。

* 尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现4个或4个以上的G重复出现。

* 原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检测到(MGB探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号)。因此，在进行SNP检测时，为了检测到突变子，即Taqman MGB不与目的片段杂交，不产生荧光信号，探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。

注意：为了满足上述要求的4个条件，探针的突变位点可向3’端移动，但突变位点至少在离3’端2个碱基的前方(即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守)，以进行SNP检测。反过来，若要进行同类检测，找的是保守片段区，探针中不应有突变位点。若探针即便是只有13个bp，探针仍不完全保守。有几个突变，突变位点也应靠近探针的5’端，这样，即便是突变，探针也可与目的片段杂交，产生荧光信号。另一种方法是设计简并探针，也可达到即使是突变，仍可检测到突变。

第三步：寻找一家信赖的公司合成引物和探针，一般引物合成大家比较熟悉，而且价格也比较便宜（特别是这两年便宜了许多），而探针则相对来说贵了许多，一般Taqman探针合成在1000到5000元不等（不同的合成要求价钱不同）——而这只是标记价钱，序列合成基本上和引物合成价钱相似。

第四、五、六步：一般的定量PCR反应体系与普通PCR其实也差不了多少，只是要加入Taqman探针，另外不同就是分步法的不同。其中需要注意的是：

* 扩增酶最好选用热启动酶

* 引物和探针的浓度需要进行优化，有人建议从50nM开始，在50nM—900nM之间优化，一般为200nM（注意探针需要避光保存。

* 同样Mg+和酶量也需要进行优化，酶的推荐反应浓度是1.25-1.5U（50ul）

* DNA模板的添加量通常在100 ng以下，因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。如果欲进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。

另外循环参数虽然在引物和探针设计完之后也就确定了，但是有时也需要进行优化。

第七步：在进行数据分析的时候，通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。方程式的斜

度可以用来检查PCR的效率，对于100%PCR效率来说，一个理想的斜率是3.32。最佳的标准曲线是建立在PCR的扩增效率为90%-100 %(100%意味着在每个循环之后，模板的总数将增加为前一次的2倍)的基础上。所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数(R2≥0.99) ，这样才能认为实验的过程和数据是可信的。使用这个方程式我们可以计算出未知样本的初始模板量。大多数定量PCR仪都有这样一个软件，它可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。

这其中有两种基本的方法：绝对定量和相对定量，研究人员需要根据自己的实验目的来选择。绝对定量是指将未知样品与标准曲线相比较进行分析，一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA样品，要注意得是绝对定量分析的准确性是相对标准品的准确性而言的。相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较，其结果是一个比率，没有确切的数字被检测道。

另外由于不同的样品在反应过程中存在着一定的差异，因此除了要制作标准曲线来进行定量外，还需要设计表达水平相对较为稳定的内参基因来对结果进行标准化。β-actin 和三磷酸甘油醛脱氢酶( Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH) 是两种较常用的管家基因，另外还有cyclophilin，18sr RNA ，phosphoglyserokinase，beta-microglobulin，beta-glucronidase，hypoxanthine ribosyl transferase，transferring receptor 等。要注意这些基因可以被反应条件所影响，在设计定量表达研究时，保证初始对照基因的质量是必要的一步，而且严谨的研究人员会通过对一系列内参基因定量结果取几何平均数来对定量数据进行标准化。

还有一个问题就是如何判断所得到数据的好坏，关于扩增曲线，经验总结认为：

“1. 总体看曲线拐点清楚，指数期明显，扩增曲线整体平行性极好，基线平无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。

2. 曲线指数期斜率，反应了扩增效率，越大说明扩增效率越高。扩增效率越高，试剂灵敏度表现会越好。

3. 基线，图上的基线也就是阴性样本的扩增曲线，平直或略微下降是好试剂的表现，阴阳性清楚，不易误判。如果有上扬趋势，有可能造成阴性标本误判。

4. 曲线与曲线间平行性非常好，说明各反应管扩增效率相近，外标准定量建立在每管扩增效率一样的假定基础上，所以扩增效率越相近，定量的重复性和准确性就越好。而扩增效率相近与否，反应在扩增曲线图上就是曲线的平行性。

一、实时荧光Taqman 探针设计

总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。

在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上

设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。

若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时；2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。

另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。

二、 探针的设计 探针设计的基本原则：

1． 保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。 2． 探针长度

Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。现在有Taqman MGB探针，在TAMER之后再标记一个MGB，可使探针的Tm值较高,即使探针片段较短，也可达到Taqman探针的Tm值要求(68-70℃)。

3． 探针的名称

应标记探针在基因组的位置及长度。 4． 探针Tm值计算

用oligo或primer preiemer软件即可计算Tm值。确保探针中GC含量在30-80%。应避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。

5． 探针的评价

用DNAstar软件中的Primerselect软件，点击“log”菜单中的“create primer catalog”，在“name”中输入探针的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的探针序列。选中整个序列后，在“report”菜单下“primer self dimer”,分析探针的二聚体。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个dimer，并对此探针用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。在“report”菜单下“primer hairpins”,分析探针的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个hairpins，并对此探针的hairpins进行评价。多重荧光PCR时，要对多条探针进行“pair dimer”进行分析。

6． 探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。

7． Taqman探针与引物之间的位置

Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠，要保证Taqman探针的5’端离上游引物的5’端至少有4bp。 如：

forward primer Taqman probe

5’ → 3’ 5’ FAM→3’染料

NNNNNNN NNNNNNN

发表序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

互补发表序列 3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’ NNNNNNN

3’ ←5’ reverse primer 或：

reverse primer

5’ → 3’

NNNNNNN

发表序列： 5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 互补发表序列 3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’ NNNNNNN NNNNNNN

料染3’ ← MAF5’ 3 ’← 5’ Taqman probe forward primer Taqman probe forward primer 三 引物的设计

1． 上下游引物要保守

为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行PCR扩增。所以引物的选取也要非常的保守，最好不要有不同的碱基，若不得不有时，也必须保证引物的3’端至少有4个碱基是完全保守才可。

在设计保守引物时，要在发表序列上分别找保守一致的区域，即在发表序列的5’端引物位置找的是3’端至少有5个bp保守，在即在发表序列的3’端引物位置找的是5’端至少有5个bp保守。

5’NNNNNNN 3’

发表序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

3’NNNNNNNNN 5’

2． 上下游引物的长度和Tm值

上下游引物的长度一般为18-25bp之间，且Tm值在58-60℃之间。确保引物中GC含量在

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