2012临微输血实验课讲稿

《临床微生物学和微生物检验》

适用专业：医学检验专业（临床输血）本科 实验课讲稿

蚌埠医学院 微生物学教研室

徐志本 20012、2

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实验一、病原性球菌

一、目的要求：

1． 掌握葡萄球菌、链球菌、肠球菌的生物学特性和鉴定要点 2． 熟悉脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌的生物学特性 二、实验内容（板书）： Ⅰ 1． 示教：

（1）金葡、表葡、甲链、乙链、肠球菌、肺炎链球菌在BAP上菌落 （2）金葡菌、表皮葡萄球菌甘露醇发酵试验 （3）肺炎链球菌、甲链菊糖发酵试验

（4）肠球菌、甲链65g/L NaCl血清肉汤生长试验；胆汁七叶苷试验 2．操作：

（1）金葡、乙链、肺炎链球菌接种BAP （2）肺炎链球菌、甲链接种菊糖发酵管 （3）金葡菌、表皮葡萄球菌接种甘露醇发酵管 3. 电教：球菌 三、讲解：

常见的病原性球菌，根据革兰染色性不同，可分为G+球菌（如葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、肠球菌）和G-球菌（如脑膜炎球菌、淋球菌等）。这些细菌在形态、菌落特点及生化反应上各不相同，可作为鉴别依据。上学期的实验课我们已经学习过了形态结构部分。下面我们着重来认识病原性球菌菌落特点和生化反应等特性。

菌落观察：

大小（以mm表示。菌落的大小随细菌种类、培养基及培养时间等条件而不同。同一种细菌在同一平板上，在密集处的菌落比疏散处小。因此，表示菌落大小时应注明培养基名称一般以培养18～24小时后选散在处的菌落判其大小。lmm左右为小菌落；2-3mm为中等大；3mm以上为大菌落）、形态、颜色、气味、透明度、表面光滑或粗糙、湿润或干燥、边缘整齐或不规则、血平板上是否溶血等。 BAP上菌落特点：

? 金葡菌：中等大小、圆形凸起、金黄色/灰白色、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明，“油漆状”，菌落周围有透明溶血环（β-溶血）

? 表葡菌：形态同金葡菌，但为白色，菌落周围无溶血环。

? 甲链菌：细小、针尖样、圆形凸起、灰白色、半透明/不透明、表面光滑、边缘整齐、菌落周围形成草绿色溶血环（α-溶血）

? 乙链菌：形态同甲链。但菌落周围形成2-4mm宽，完全透明的溶血环（β-溶血）

? 肺炎链球菌：菌落与甲型链球菌极其相似，稍扁平，培养2~3d后，因菌体发生自溶，菌落中心凹陷呈“脐状”。 ? 肠球菌：灰白色、不透明、表面光滑的小菌落（大小介于葡萄球菌和链球菌之间）、菌落周围有草绿色

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溶血环或无溶血环。 生化反应：

不同的细菌含有不同的分解代谢酶，对培养基中各种基质的代谢作用和代谢产物均不相同。通过检测细菌对各种基质的代谢作用和代谢产物, 借以区别和鉴别细菌种类的试验，称为生化反应。常用的生化反应主要观察细菌对糖类、蛋白质类及其它物质的利用。生化反应在细菌的鉴定中起着重要的作用，因而为临床细菌检验所常用。 △甘露醇发酵试验： *原理：

致病性葡萄球菌（金葡菌）发酵甘露醇产酸，使培养基中的溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，表皮葡萄球菌不能发酵甘露醇产酸，培养基颜色仍为紫色，本试验可用于金葡/非金葡的区别。 *方法：

将金葡/表葡分别接种于甘露醇发酵管，35℃孵育18~24h观察结果。*试验判断：（+）培养基浑浊，由紫色变为黄色；（—）培养基混浊，仍为紫色。若培养基为澄清，说明接种细菌不合格。 *结果：金葡（+）；表葡（—）。 △菊糖发酵试验：

*原理：链球菌一般不分解菊糖，不被胆汁溶解。大多数肺炎链球菌可以分解菊糖，菊糖发酵产酸，指示剂呈酸性反应，发酵管由紫红色变为黄色。 *方法：

将肺炎链球菌/链球菌分别接种于菊糖发酵管，35℃孵育18~24h观察结果。

*试验判断：（+）培养基浑浊，由紫色变为黄色；（—）培养基混浊，仍为紫色。若培养基为澄清，说明接种细菌不合格。

*结果：肺炎（+）；甲链（—）。 △6.5%NaCL血清肉汤生长试验： *原理：

肠球菌具有较强的耐盐能力，能在6.5%NaCL血清肉汤生长，而其它链球菌（甲链）的耐盐能力较弱，在此培养基中无法生长，本试验可用于肠球菌/非肠球菌的区别，主要测定细菌在高盐中的生长能力，如细菌能耐受高盐，在培养基中生长后可分解培养基中的葡萄糖使指示剂呈酸性改变。 *方法：

将肠球菌/甲链分别接种6.5%NaCL血清肉汤，35℃孵育18~24h观察结果。

*结果判断：（+）细菌生长培养基混浊；（—）细菌不生长，培养基澄清。肠球菌（+）；甲链（—）。 △七叶苷斜面生长试验： *原理：

培养基的胆汁对某些细菌有抑制作用，只有既能在胆汁中生长，又能水解七叶苷的细菌才能表现出对七叶苷的水解活性。肠球菌能水解七叶苷生成七叶素，七叶素能与培养基中的枸橼酸铁反应生成黑色沉淀，使培养基变黑，甲链不水解七叶苷，培养基不变黑，本试验可用于肠球菌/非肠球菌区别。 *方法：

将肠球菌/甲链分别接种七叶苷斜面，35℃孵育18~24h观察结果。

*试验判断：（＋）细菌生长，培养基变为黑色；（—）细菌生长，培养基不变色。 *结果：肠球菌（+）；甲链（—）。

二、操作：（4人/组）

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1、金葡、乙链、肺炎链球菌接种BAP

方法：用接种环从示教板上挑取金葡，表葡，肺链菌苔分区划线法接种BAP，35度孵育18~24h，观察结果。

分区划线法（图4-5）

1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。

2）同上法将平板盖打开约30~45°角，将已挑取细菌的接种环在平板一端（1区）内作来回划线，再在2、3、4区依次划线，每区的划线须有数条线与上区交叉接触，每划完一区是否需要烧灼接种环依标本中的菌量多少而定，每区线间需保持一定距离，线条要密而不重复。

3）划线完毕，将平板扣入平板盖，接种环烧灼灭菌后放回原处。 4）在平板底上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。

肺炎要用烛缸法：取一有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨口处上涂上凡士林。将接种后的培养基放入缸中，并在缸内放一支点燃的蜡烛，加盖密封。随着缸内蜡烛燃烧产生的CO2增加，蜡烛逐渐自行熄灭，此时缸内的CO2浓度约为5~10%，置35℃培养箱孵育18~24h后观察结果。（见图4-7）

2、金葡、表葡接种甘露醇发酵管

方法：用接种针从示教板上挑取少许金葡，表葡菌苔用半固体接种法接种，35℃培养箱孵育18~24h后观察结果。

半固体培养基的接种：该法可用于保存菌种、观察细菌的动力或进行细菌的生化反应。 半固体培养基的接种方法：（图4-3）

（1）先将接种针在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。

（2）左手拿试管，右手持接种针，将试管塞打开后，试管口通过火焰灭菌，将接种针从培养基的中心向下垂直穿刺接种至试管底上方约5mm处（勿穿至管底），然后由原穿刺线退出，

（3）将试管口灭菌后加塞，接种针烧灼灭菌后放回原处。 （4）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。

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3、肺炎链球菌、甲链接种血清肉汤

方法：用接种环从示教板上挑取少量肺炎，甲链菌苔用液体培养基接种法接种35℃培养18~24h后观察结果。

△菊糖发酵试验：

*原理：链球菌一般不分解菊糖，不被胆汁溶解。大多数肺炎链球菌可以分解菊糖，菊糖发酵产酸，指示剂呈酸性反应，发酵管由紫红色变为黄色。 *方法：

将肺炎链球菌/链球菌分别接种于菊糖发酵管，35℃孵育18~24h观察结果。

*试验判断：（+）培养基浑浊，由紫色变为黄色；（—）培养基混浊，仍为紫色。若培养基为澄清，说明接种细菌不合格。

*结果：肺炎（+）；甲链（—）。

△胆汁溶菌试验：

*原理：

胆汁或胆盐能激活肺炎链球菌的自溶酶，引起细菌细胞膜破裂或菌体裂解，导致细菌死亡，而甲链无自溶酶，胆汁无法导致细菌死亡，本试验可用于肺炎/甲链的区别。 *方法：

将肺炎/甲链的血清肉汤培养液1ml分别加入试管内，再于各管中加入10％的去氧胆酸钠0.1ml，摇匀后置37℃水裕30min后观察结果。*试验判断：（+）试管中液体由混浊变为透明；（—）液体仍为混浊。*结果：肺炎（＋）；甲链（—）。 1．液体培养基的接种： 该法主要用于细菌的增菌培养或进行细菌的生化反应。 方法：

（1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许细菌。

（2）左手拿试管，右手持接种环，右手其余手指将试管塞打开，试管口通过火焰烧灼灭菌。 （3）将接种环在贴近液面的管壁上上下碾磨数次，使细菌均匀分布于培养基中。 （4）将试管口灭菌后加塞，接种环烧灼灭菌后放回原处。 （5）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。

Ⅱ 1．

（1） （2） （3） （4）

操作：

观察试验结果 金葡菌、乙链触酶试验

金葡菌、表皮葡萄球菌凝固酶试验

金葡菌、乙链、肺炎链球菌涂片G染色镜检

1、观察试验结果

具体结果描述见前部分内容

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