（修订）植物呼吸酶的测定

植物呼吸酶的测定

植物体内的呼吸酶，是催化植物在呼吸过程中，进行氧化还原的一些酶类。植物体内的末端氧化酶是将从基质传递来的电子，直接交给氧并产生H2O或H2O2。植物体内的末端氧化酶有抗坏血酸氧化酶、多酚氧化酶等。这个复杂的氧化酶系统，有助于植物对不良外界环境条件的适应。

通过本实验，掌握一个简便快速测定抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的方法---滴定法测定抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性。 [实验原理]

1.抗坏血酸氧化酶活性的测定

抗坏血酸在抗坏血酸氧化酶的作用下，可以氧化为脱氢抗坏血酸。

抗坏血酸每抗坏血酸?1/2O2?????脱氢抗坏血酸

以抗坏血酸为底物，加入酶的提取液，酶与底物充分反应，此时抗坏血酸氧化酶将抗坏血酸消耗掉一部分，根据消耗的多少来计算酶的活性。抗坏血酸消耗的多，说明酶的活性强。

抗坏血酸的消耗量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来测定。 I2的产生：KIO3+5KI+6HPO3→3I2+6KPO3+3H2O 用碘液滴定剩余的抗坏血酸：

抗坏血酸氧化酶抗坏血酸?I2???????脱氢抗坏血酸

2.多酚氧化酶活性的测定

多酚氧化酶在有氧存在的条件下，可以将酚氧化成醌，其反应如

下：

邻苯二酚?1/2O2?多酚氧化酶????邻醌

邻醌再与抗坏血酸作用，将它氧化成脱氢抗坏血酸。

抗坏血酸?邻醌?脱氢抗坏血酸?邻苯二酚

上述反应，由于醌类物质的氧化还原电位比抗坏血酸的高（邻醌△E=0.696，抗坏血酸△E=0.166）。所以邻醌能夺取抗坏血酸上的氢，生成邻苯二酚。因此，多酚氧化活性的测定，参加反应的底物有两种：即邻苯二酚和抗坏血酸。多酚氧化酶的活性，也用抗坏血酸的消耗量求得。

[实验材料、试剂与仪器设备]

（一）实验材料：马铃薯芽 （二）试剂

1．pH6.0的磷酸盐缓冲液：A液为1/15mol/L磷酸氢二钠溶液，B液为1/15mol/L磷酸二氢钾溶液，取A液10mL与B液90mL混均即可。

2．0.1％抗坏血酸，试验当天配制。

3．0.02mol/L焦儿茶酚（邻苯二酚）：称取0.22g焦儿茶酚溶于100mL水中,试验当天配制。

4．10％偏磷酸（HPO3）。 5．1％淀粉溶液。

6．0.005mol/L碘液：碘化钾2.5g溶于200mL蒸馏水中，加冰醋酸1mL，再加0.1mol/L碘酸钾（0.3567g碘酸钾溶于水，定容至100mL）12.5mL，最后加蒸馏水成250mL。

（三）仪器设备

（1）研钵1个；（2）容量瓶50mL1个；（3）三角瓶50mL6个；（4）微量滴定管及滴定架；（5）移液管5mL1支、2mL2支、1mL1支；（6）恒温水浴；（7）刀片、剪子。 [实验步骤]

1.酶液的提取：取马铃薯2g，放入研钵中，加少量石英砂，加pH6.0的磷酸盐缓冲液约5mL，迅速研成匀浆，研碎后迅速放入50mL容量瓶中，把全部材料都用蒸馏水洗入50mL容量瓶中，最后用缓冲液定容至刻度。

在室温下，每隔3min摇动一次，共摇5次，共计15min，再静止20min，其上清液即为酶的提取液。

2.酶活性的测定：取6个50mL干净干燥的三角烧瓶，标上号码，除酶液外，按下表准确加入各试剂：

表酶活性测定加入的各试剂量

瓶缓冲抗坏血焦儿茶偏磷酶偏磷备注 号 液 1 2 3 4 4 4 酸 2 2 2 酚 - - - 酸 液 酸 - - 1 2 2 2 1 1 - 测抗坏血酸氧化酶 测抗坏血酸氧化酶 空白测定 测抗坏血酸氧化酶及多4 4 2 1 - 2 1 酚氧化酶 测抗坏血酸氧化酶及多5 6

先在各瓶中加缓冲液、抗坏血酸及焦儿茶酚，并向（3）及（6）号瓶加入1mL偏磷酸，准确记录加入酶液的时间。反应3min后立即按原次序向（1）、（2）、（3）、（4）号烧瓶中加入偏磷酸1mL，停止酶的活动。然后加入3滴淀粉溶液做指示剂，用0.005mol/L碘液滴定。滴定到出现浅兰色为止。记录消耗碘液的数值。

四、结果计算

酶活性以每克鲜组织，每分钟氧化抗坏血酸的毫克数表示。计算方法如下：

（1）抗坏血酸氧化酶活性： 4 4 2 2 1 1 - 1 2 2 1 酚氧化酶 空白测定

式中：0.44——每毫升0.005mol/L碘液氧化抗坏血酸毫克数。 （2）多酚氧化酶活性：

由于多酚氧化酶提取液中有两种酶，（4）瓶与（5）号瓶中又有两种底物，所以（4）号瓶与（5）号瓶中包括两种酶的活性，在求多酚氧化酶的活性时必须减去抗坏血酸氧化酶的活性。

多酚氧化酶活性=

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