盐生杜氏藻软胶囊中β, β-胡萝卜素几何异构体组成的测定

盐生杜氏藻软胶囊中β, β-胡萝卜素几何异构体组成的测定

284 2008, Vol. 29, No. 06

食品科学※分析检测

盐生杜氏藻软胶囊中β　，β－胡萝卜素

几何异构体组成的测定

惠伯棣１，张　艳２，叶　珊１

（１．北京联合大学应用文理学院，北京　　　　　　１０００８３；２．首都师范大学生命科学学院，北京　　　　　　１０００３７）

摘　　　要：采用Ｃ３０－ＨＰＬＣ－ＰＤＡ－ＥＬＳＤ系统，参照已公布的全反式异构体的吸光系数（Ａ１％　β，β－胡萝卜１ｃ＝２５００），根据ｍ素顺式异相体电子吸收光谱峰面积与ＥＬＳＤ质量峰面积之比，估算出９－和１３－顺式异构体的吸光系数分别为２０１８和１９９０。根据其色谱峰面积，可以准确测量出盐生杜氏藻软胶囊中β，β－胡萝卜素几何异构体的组成。关键词：β，β－胡萝卜素；几何异构体组成；吸光系数

Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌ　Ｉｓｏｍｅｒ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　β，β－ｃａｒｏｔｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ　ｓａｌｉｎａ

ＨＵＩ　Ｂｏ－ｄｉ１，ＺＨＡＮＧ　Ｙａｎ２，ＹＥ　Ｓｈａｎ１

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ａｒｔｓ　ａｎｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｕｎｉｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｂｅｉｊｉｎｇ　　　　　　１０００８３，　Ｃｈｉｎａ；

２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｃａｐｉｔａｌ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｂｅｉｊｉｎｇ　　　　　　１０００３７，　Ｃｈｉｎａ）

１％　　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，　ｒｅｆｅｒｒｉｎｇ　ｔｏ　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　（Ａ１ｃｍ＝２５００　ａｔ　４５０　ｎｍ）　ｏｆ　ａｌｌ　Ｅ－ｉｓｏｍｅｒ，　ｔｈｅ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ

ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ　ｏｆ　　９－，　ａｎｄ　１３－ｉｓｏｍｅｒｓ　ａｒｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｓ　２０１８　ａｎｄ　１９９０，　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ　ａｎｄｍａｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　（ｅｇ．　ｐｅａｋ　ａｒｅａｓ　）　ｏｎ　Ｃ３０－ＨＰＬＣ－ＰＤＡ－ＥＬＳＤ．　Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅｉｒ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｐｅａｋ　ａｒｅａｓ，　ｔｈｅ　ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌ　ｉｓｏｍｅｒｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　β，β－ｃａｒｏｔｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ　ｓａｌｉｎａ　ｃａｎ　ｂｅ　ａｃｔｕａｌｌｙ　ａｓｓｅｓｓｅｄ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：β，β－ｃａｒｏｔｅｎｅ；ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌ　ｉｓｏｍｅｒ；Ｃ３０　ｃｏｌｕｍｎ

中图分类号：ＴＳ２０１．２４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文献标识码：Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文章编号：１００２－６６３０（２００８）０６－０２８４－０４β，β－胡萝卜素（β，β－ｃａｒｏｔｅｎｅ）是一种类胡萝卜素（ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ）。其习惯命名为β－胡萝卜素（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ），分子式为Ｃ４０Ｈ５６。β，β－胡萝卜素分子由中央多聚烯链和两端的六元环末端基团组成，为双环结构，整个分子呈几何中心对称。由于中央共轭多烯链的存在使整个分子具有高度的不饱和性，可形成多种几何异构体。虽然在自然界中它经常以全反式（ａｌｌ　Ｅ－ｉｓｏｍｅｒ）的形式存在，但也常见其１３－和９－顺式异构体（Ｚ－ｉｓｏｍｅｒ，图１）的存在。

随着生命科学的发展，有许多证据证明β，β－胡萝卜素与人类的健康有着密切的关系。早在半个世纪前，人类就知道类胡萝卜素中的β，β－胡萝卜素可在哺乳动物的小肠中水解生成ＶＡ，进而参与视觉生理代谢。因此，它被称为ＶＡ原，是重要的营养物质。β，β－胡萝卜素类是良好的自由基猝灭剂，具有良好的抗氧化作用。它可有效地阻断细胞内的链式自由基反应，因而被认为是治疗和预防由此引起的许多顽疾的理想药物。经过上世纪９０年代的研究后，９－顺式异构体独特的保健功能已渐被人知，成为人们研究的重点［１］。β，β－胡萝

收稿日期：２００７－０６－２６

基金项目：北京市教育委员会科技发展计划面上项目（２００４１１４１７００３）

卜素已被广泛地应用于功能性食品和食品添加剂中，制

成了多种产品，如软胶囊等。

杜氏藻（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ　ｓａｌｉｎａ）属于绿藻纲，团藻目，杜氏藻属，为单细胞绿藻。杜氏藻体内含有丰富的类胡萝卜素，主要为β，β－胡萝卜素。其中的β，β－胡萝卜素包括多种几何异构体，有大量顺式异构体存在。鉴于上述顺式异构体的特殊功能，作为天然β，β－胡萝卜素资源的杜氏藻倍受关注。显然，测定杜氏藻产品中β，β－胡萝卜素几何异构体的组成无论是对产品的质量控制还是对其生物学功能的研究均有重要意义。

在Ｃ３０－ＨＰＬＣ上，β，β－胡萝卜素的几何异构体可以获得良好的分离［２－３］。由于参比样品的匮乏，β，β－胡萝卜素顺式异构体的定量需基于其电子吸收光谱范围内的吸光系数。在本研究中使用了蒸发光散射检测器（ＥＬＳＤ）。在ＥＬＳＤ上收集番茄红素全反式异构体信号的条件已由惠伯棣等建立完成［４］。在本项研究中将这一条件应用于β，β－胡萝卜素的信号收集中。在实验中，使用Ｃ３０－ＨＰＬＣ－ＰＤＡ－ＥＬＳＤ串联系统，同步收集每个β，β－

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※分析检测食品科学

2008, Vol. 29, No. 06285

ｔｅｎｏｉｄ　Ｓ－５（４．６×２５０ｍｍ）；流动相Ａ：乙腈－甲醇（７５：２５，Ｖ／Ｖ），流动相Ｂ：ＭＴＢＥ，流动相Ａ与Ｂ中分别加入

ａ

０．０５％（Ｖ／Ｖ）三乙胺；线性梯度洗脱：Ｂ在２０ｍｉｎ内由０％增加至８０％，２０～２５ｍｉｎ内Ｂ保持在８０％；流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；检测波长：４５０ｎｍ；ＰＤＡ光谱收集范围２６０～

ｂ

７００ｎｍ；ＥＬＳＤ信号收集条件：载气压力：０．２１ＭＰａ　（３０Ｐｓｉ），喷雾器温度：４０℃；飘移管温度：４５℃；进样量：２０μｌ。根据其色谱行为和光谱特征对各组分进行鉴定。１．２．４

β，β－胡萝卜素几何异构体的量与其色谱峰面积

的关系

配制不同浓度的几何异构体样品液，在上述色谱和

检测条件下测定各组分在ＰＤＡ和ＥＬＳＤ检测器上的峰面积。回归各异构体含量与其峰面积间的关系。回归同一异构体组分在不同检测器上峰面积间的关系。１．２．５

顺式异构体吸光系数的估算

一般情况下，用于定量分析的吸光系数是指该化合物在λｍａｘ处的吸光系数。β，β－胡萝卜素全反式异构体于４５０ｎｍ处的吸光系数已被报道，如Ａ１％一般在２５００左１ｃｍ右。

在ＰＤＡ检测器上，一种β，β－胡萝卜素顺式异构体的量与其在检测波长处的色谱峰面积呈正线性相关关系，符合朗伯－比尔定律。如果在ＥＬＳＤ检测器上，这种顺式异构体的量与其峰面积间亦存在正线性相关关系，则可回归其在ＰＤＡ和ＥＬＳＤ上峰面积之间的线性相关关系，并计算其斜率。最终，按下列方法估算这种顺式异构体的吸光系数［５］。

　　ＫＺ

ＡＺ＝ＡＥ×　——　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（１）

ＫＥ

式中：ＡＺ为顺式异构体吸光系数；ＡＥ为全反式异构体吸光系数；ＫＺ为顺式异构体斜率，即ＰＤＡ峰面积／ＥＬＳＤ峰面积；ＫＥ为全反式异构体斜率，即ＰＤＡ峰面积／ＥＬＳＤ峰面积。１．２．６

几何异构体的定量检测

根据朗伯－比尔定律，按下列公式计算β，β－胡萝

ｃ

ａ．全反式异构体；ｂ．９－顺式异构体；ｃ．１３－顺式异构体。图１　　　β，β－胡萝卜素全反式和常见顺式异构体结构

Fig.1 Molecular structures of all E-β，β-carotene and the most

commonly encountered Z-isomers

胡萝卜素几何异构体组分的电子吸收光谱和质量信号，

由二者峰面积之比推算每个组分的吸光系数，最终实现在Ｃ３０－ＨＰＬＣ－ＰＤＡ系统上β，β－胡萝卜素各几何异构体的定量检测。最终根据其色谱峰面积，可以准确测量出盐生杜氏藻软胶囊中β，β－胡萝卜素几何异构体的组成。１１．１

材料与方法

材料、试剂与仪器

实验用β，β－胡萝卜素标准样品（纯度（９９．９％）　　　　Ｓｉｇｍａ

公司。所检盐生杜氏藻胶囊为（天光牌盐藻胶囊）　　　　天津天光高科技开发有限公司；碘和丙酮（均为分析纯试剂）北京化工厂；用于ＨＰＬＣ分离的乙腈、甲醇和甲基叔丁基醚（ＭＴＢＥ）（均为色谱纯试剂）　　　　迪马公司。

ＹＭＣ　Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　Ｓ－５　Ｃ３０柱、ＨＰＬＣ（含１５７５型溶剂输送系统、ＰＤＡ－２９９６型二极管阵列检测器、２４２０型蒸发光散射检测器）　　　　Ｗａｔｅｒｓ公司；ＭｕｌｔｉＳｐｅｃ－１５０１分光光度计　　　　岛津公司。１．２１．２．１

方法

顺式异构体的制备

配制相同浓度（ｍｇ／ｍｌ）的β，β－胡萝卜素－丙酮和碘－丙酮溶液。向β，β－胡萝卜素－丙酮溶液中滴加碘－丙

酮溶液，最终比例为：碘液：β，β－胡萝卜素液＝１：２０（Ｖ／Ｖ）。混合液在日光或距离４０Ｗ日光灯６０ｃｍ处照射１０ｍｉｎ，而后避光保存产物。１．２．２

盐生杜氏菌软胶囊内容物样品溶液的配制

将胶囊壁扎破，收集内容物，称取一定量的内容物溶于丙酮中用于ＨＰＬＣ分析。进样前用０．４５μｍ滤膜过滤。１．２．３

Ｃ３０－ＨＰＬＣ分离几何异构体

碘诱导的β，β－胡萝卜素异构体混合液用Ｃ３０－ＨＰＬＣ－ＰＤＡ－ＥＬＳＤ分离。色谱条件：色谱柱：Ｗａｔｅｒｓ　ＹＭＣ　Ｃａｒｏ－

卜素异构体的含量。

　　　　Ａｙ

ｘ＝—————　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（２）

１０００００Ａ１％

式中：ｘ为样品中所含的β，β－胡萝卜素异构体的量（ｇ）；ｙ为样品溶液的体积（ｍｌ）；Ａ为样品中各组分的峰面积（ｍＶ ｓ）；Ａ１％为吸光系数，为在１ｃｍ光程长的比色杯中１％（Ｗ／Ｖ）浓度溶质的理论吸收值，计算β，β－胡

萝卜素全反式异构体含量时采用值为ε＝２５００（４５０ｎｍ）。

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286 2008, Vol. 29, No. 06

２２．１

结果与分析

食品科学

１２．００

ｙ＝０．３１４９ｘ

１０．００峰面积（ＬＳ单位）

Ｒ２　＝０．９６７８

８．００６．００４．００２．０００．００

０．００

※分析检测

几何异构体在Ｃ３０－ＨＰＬＣ－ＰＤＡ－ＥＬＳＤ上的分离与鉴定

０．３５０．３００．２５０．２００．１５０．１００．０５０．００－０．０５

０．００

ⅠⅡ

吸光度

Ⅲ

１０．００２０．００浓度（ｍｇ／ｍｌ）

３０．００４０．００

４．００８．００１２．００１６．００２０．００２４．００保留时间（ｍｉｎ）

图４　　　全反式异构体量与其ＥＬＳＤ峰面积响应值的相关性Fig.4 Correlation of response from ELSD and amount of all

E-isomer

７００ＰＤＡ峰面积（ｋＶ ｓ）

６００５００４００３００２００１００００．００

２．００

４．００

６．００

８．００

ｙ＝７５．３１１ｘＲ２＝０．９１８

Ｉ．全反式异构体；ＩＩ．１３－顺式异构体；ＩＩＩ　．９－顺式异构体。图２　　β，β－胡萝卜素全反式异构体经碘诱导后C30-HPLC-PDA色谱图Fig.2 C30-HPLC-PDA chromatogram of iodine-induced all E-β，

β－carotene

１４００

Ⅰ

响应值（ＬＳ单位）

１０００

６００

Ⅱ

２００

Ⅲ

ＥＬＳＤ峰面积（ＭＬＳ单位 ｓ）

图５　　１３－顺式异构体ＰＤＡ与ＥＬＳＤ峰面积的相关

Fig.5 Correlation of PDA response and ELSD response of

13Z-isomer

１０００ＰＤＡ峰面积（ｋＶ ｓ）

８００６００４００２００００．００

５．００１０．００

ＥＬＳＤ峰面积（ＭＬＳ单位 ｓ）

－２００

０．００

５．００

１０．００

１５．００

２０．００

２５．００

保留时间（ｍｉｎ）

Ⅰ．全反式异构体；Ⅱ．１３－顺式异构体；Ⅲ．９－顺式异构体。图３　　　β，β－胡萝卜素全反式异构体经碘诱导后C30-HPLC-ELSD色谱图Fig.3 C30-HPLC-ELSD chromatogram of iodine-induced all

E-β，

β－carotene

ｙ＝７８．７５９ｘＲ２＝０．９５６

图２、３分别为全反式β，β－胡萝卜素异构体经碘诱导后Ｃ３０－ＨＰＬＣ－ＰＤＡ与Ｃ３０－ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ的色谱图。根据各组分的色谱行为和光谱特征结合参考文献所介绍的方法为其定性。２．２关性

据李京等的报道，在被测得类胡萝卜素物质浓度较低时，ＥＬＳＤ检测器的信号与其量间存在线性关

［５］

β，β－胡萝卜素几何异构体量与其ＥＬＳＤ峰面积的相

图６　　９－顺式异构体ＰＤＡ与ＥＬＳＤ峰面积的相关

Fig.6 Correlation of PDA response and ELSD response of

9Z-isomer

６００ＰＤＡ峰面积（ｋＶ ｓ）

５００４００３００２００１００００．００

２．００

４．００

６．００

ＥＬＳＤ峰面积（ＭＬＳ单位 ｓ）

图７　全反式异构体ＰＤＡ与ＥＬＳＤ峰面积的相关

Fig.7 Correlation of PDA response and ELSD response of all

E-isomer

ｙ＝９４．５７７ｘＲ２＝０．９０９２

系。如图４所示，当样品中全反式β，β－胡萝卜素浓度在５．６～３２．５ｍｇ／ｍｌ范围内时，其量与ＥＬＳＤ上的组分峰面积呈现良好的线性关系。２．３

几何异构ＰＤＡ和ＥＬＳＤ峰面积的相关

如图５～７所示，不同浓度的１３－顺式异构体、９－

顺式异构体和全反式异构体样品在ＰＤＡ和ＥＬＳＤ上的峰面积。之间显示出正线性关系。２．４

顺式异构体吸光系数的估算

以全反式异构体吸光系数为基准，根据式（１），可

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※分析检测

估算出顺式异构体的吸光系数（见表１）。

表１　　　β，β－胡萝卜素顺式异构体吸光系数的估算

食品科学

2008, Vol. 29, No. 06287

提的。本研究的结果表明：各β，β－胡萝卜素顺式异构体的吸光系数是不同的。根据各组分色谱的峰面积，经过吸光系数的换算，所得结果见图１０（ｂ）。显然，图１０（ｂ）所示结果更真实地反映了盐生杜氏藻软胶囊内容物中β，β－胡萝卜素几何异构体组成。

Table 1 Estimation results of absorptivity of　β，β-carotene E-isomer

异构体种类

ＫＺ＊吸光系数（Ａ１ｃ＊＊）ｍ

１％

全反式异构体９，９＇－顺式异构体１３，１３＇－顺式异构体

９４．５７７２５００

７８．７５９２０１８

７５．３１１１９９０

注：＊：见式（１）；＊＊：光程为１ｃｍ时浓度为１％（Ｗ／Ｖ）的溶液吸光系数。

３．５０００２．５０００吸光度

１．５００００．５０００－０．５０００

０．００

Ⅰ

２．５几何异构化对分子电子吸收光谱特征的影响

Ⅲ

当β，β－胡萝卜素全反式异构体发生异构化时，其光谱特征亦发生变化。所有顺式异构体与全反式异构体相比，在３４２ｎｍ处会出现一特征性吸收峰，亦称“顺式峰”。同时，当全反式异构体发生顺式构型变化时，其电子吸收光谱主吸收段发生明显“紫移”，λｍａｘ紫移可达９ｎｍ（图８）。从图８可以看出：顺式异构化位置越靠近分子中部，电子吸收光谱“紫移”越明显。

１．１０００

１３－顺式异构体

０．９００００．７０００吸光度

０．５００００．３００００．１０００－０．１０００

３００

３５０

４００４５０

波长（ｎｍ）

５００

５５０

Ⅱ

５．００１０．００１５．００２０．００２５．００

保留时间（ｍｉｎ）

Ｉ．全反式异构体；ＩＩ．１３－顺式异构体；ＩＩＩ．９－顺式异构体。图９　　盐生杜氏藻软胶囊内容物的C30-HPLC色谱图

Fig.9 C30-HPLC-PDA chromatogram of Dunaliella salina soft-gel

capsule containing５２．４０％

４４．０７％

３９．５２％

４５．９２％

图８　　　β，β－胡萝卜素几何异构体的电子吸收光谱图

Fig.8 Electronic absorption spectra ofβ，β－carotene geometrical

isomers

８．０８％

Ⅰ

ａⅡ

Ⅲ

１０．０１％

ⅠⅡ

ｂ

Ⅲ

ａ．色谱峰面积结果；ｂ．经过吸光系数换算的结果。Ⅰ．全反式异构体；Ⅱ．

实际上，β，β－胡萝卜素全反式异构体的顺式异构化除了导致光谱精细特征发生变化外，其光吸收强度也有所改变。与全反式异构体相比，顺式异构体在λｍａｘ处的吸光能力下降，同时，在３４２ｎｍ处的吸光能力上升，形成顺式特征峰。顺式异构位置越靠近分子中心，二者的变化值越大。这一消长规律在客观上反映了β，β－胡萝卜素全反式异构体分子顺式异构化所导致的在λｍａｘ处的吸光系数下降与顺式特征峰强度增加之间的关系［６］。２．６

盐生杜氏藻软胶囊内容物中β，β－胡萝卜素几何异构体组成

图９为盐生杜氏藻软胶囊内容物的Ｃ３０－ＨＰＬＣ色谱图。根据其色谱行为和光谱特征可对其中各β，β－胡萝卜素几何异构体组分进行定性。

由于β，β－胡萝卜素顺式异构体参比样品的缺乏，在一般的检测中只能根据其色谱的峰面积进行测定，其结果见图１０（ａ）。这样做是以各组分的吸光系数相同为前

１３－顺式异构体；Ⅲ．９－顺式异构体。

图１０　　盐生杜氏藻软胶囊内容物中β，β－胡萝卜素几何异构体的组成Fig.10 Geometrical isomer composition ofβ，β－carotene from

Dunaliella salina soft-gel capsule containing

参考文献：

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/nyw4.html