基因工程实验手册

总 论

基因是遗传的基本单位，所以基因工程有时称遗传工程(genetic engineering),有时还称为基因克隆(gene cloning)、分子克隆(molecular cloning)。基因工程的基本技术是DNA重组技术(recombinant DNA technigue)，其定义是在分子水平上，用人工方法提取(或合成)不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合，然后将体外重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达。按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。了解这个概念要注意两个问题，第一就是必须有体外DNA的切割、连接、重组过程。第二，DNA重组必须是有目的的，按事先设计的过程进行，随意的切割、连接、重组过程不是基因工程。 一、DNA体外重组的主要步骤

DNA体外重组可分五个步骤。 (一)目的基因和载体基因的制备

制备带有目的基因的DNA片段和载体基因。 1．带有目的基因的DNA片段的获得

带有目的基因的DNA片段的获得，主要有两个途径：一是从已有的生物基因组中分离；二是用酶学或化学的方法合成。

从生物基因组中分离DNA片段主要是提取基因组DNA，对其进行酶切，获得特定的酶切片段。酶学合成目的基因DNA片段通常是以mRNA为模板，用反转录酶合成其cDNA作为克隆的片段。化学合成是对目的基因DNA片段在体外进行设计，并用化学方法进行合成，较大的基因一般分多段进行合成，并在体外连接成目的基因的片段。

目前，用聚合酶链反应(PCR)对目的基因进行扩增或对目的基因转录产物RNA进行RT-PCR扩增，也是获得带有目的基因DNA片段的最常用方法之一。 2．载体的选择

DNA体外重组所用的载体是可以克隆DNA片段的DNA分子。目前常用的载体类型有质粒、噬菌体和动物病毒等。其中以质粒载体最常用。

质粒(plasmid)是某些细菌中独立于染色体外的DNA，它有自主复制的能力，在细菌分裂时可伴随染色体分配到子细胞。它的存在与否，一般说来，对细胞的生存并没有决定性的影响。

根据复制是否受染色体复制功能所控制，质粒可分为严紧型质粒----即每个细菌细胞是可含1～3个拷贝和松驰型质粒----每个细菌细胞一般含10个以上拷贝。

质粒具有不相容性，即在没有选择压力的条件下，两种不同的质粒不能稳定地共存于同一宿主细胞内。相互不相容的质粒属于同一不相容群；而属于不同的不相容群的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。

许多质粒本身除作为一个复制子具有复制和调控系统外，还携带一些功能各异并赋予其

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宿主以不同表型特征的基因，如具有抗生素抗性等。作为一种克隆载体，能提供某种特殊表型，为其作为载体进行基因操作带来很大方便。

由于天然质粒的这些基本特性，使其可用作克隆的载体，但并不一定是理想的载体。作为理想载体，它应该具备如下条件：

(1)应该具有能自主复制的复制子，并且有能使所携带的外源DNA忠实复制、高效表达所需的调控系统。

(2)对多种限制性核酸内切酶有单一切点，而且酶切点最好位于易于被检测的表型基因上。 (3)能够赋予宿主细胞易于检测的表型。 (4)分子量小，多拷贝。 (5)携带外源DNA的幅度较宽。

(6)从生物防护的角度考虑，应当是安全的。 (二)目的DNA片段与载体DNA体外重组。

将载体DNA与目的DNA片段剪切，并在体外进行连接，得到重组子。 1．DNA分子的剪切

对DNA分子的剪切，通常采用限制性内切酶进行酶解。除了酶解外，还可用化学降解和机械剪切法等方法对DNA分子进行剪切，不过这些方法因对DNA的剪切缺乏特异性，较少使用。

2DNA分子的连接

带有目的基因的DNA片段与载体DNA，由限制性内切酶作用产生的末端相结合形成结合体时，在接头处需要DNA连接酶把缺口修复，形成一完整的双链。大肠杆菌产生的和T4噬菌体感染的大肠杆菌产生的DNA连接酶，均能封闭双链DNA上相邻核苷酸之间的单链缺口。它们催化的反应十分类似，但它们所需要的辅助因子不同。T4 DNA连接酶需要ATP，而大肠杆菌DNA连接酶则需要NAD。这两种辅助因子在反应中分别释放出焦磷酸(PPi)和烟酰胺单核苷酸(NMN)的同时，均形成酶-AMP复合物。这种复合物同时表现出一个5′-磷酸和3′-OH基团的缺口结合，并在磷酸二酯链上形成一个共价键。连接DNA缺口的最适温度是37℃，但在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此，连接粘性末端的最适温度是介于酶作用速率与末端结合速率之间，大约15℃。 将DNA片段连接成为人工重组体的方法有四种。 (1)粘末端法

用限制性内切酶产生单股粘末端。两种DNA片段都用同一种限制酶降解，产生相同的粘末端。在退火条件下，末端单股间碱基配对，在DNA连接酶作用下，共价连接封闭成新的DNA分子。 (2)接尾法

用末端核苷酸转移酶在DNA片段上制造一个粘末端，如在外来DNA片段3′-端加一小段单股的poly(dA)或(dG)，在载体DNA的3′-端加上一段Poly(dT)或(dC)，利用

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Poly(dA)·Poly(dT)或Poly(dG)·Poly(dC)形成碱基配对，两片段用连接酶连接起来。 (3)平末端法

有些限制酶(如EcoRⅤ)切割产生的DNA片段不具有粘末端，而是平末端。如用其他方式产生的片段，用对单股DNA特异的核酸酶S1修平，或DNA聚合酶Ⅰ补平而形成的平末端，亦可通过T4DNA连接酶作用，连成新的DNA分子，但效率低，只有粘末端的1%。 (4)人工接头法

有时我们所需要的DNA片段不含有适于产生粘末端的限制酶识别序列，可通过人工合成的或利用现有的DNA片段上的限制酶识别序列，加在外源基因片段或分子载体上，使它们具有限制酶的新切点。由于此法的应用，几乎可使所有的DNA片段插入现有的载体分子中去进行无性繁殖。这种化学合成的具有限制酶末端的片段称为人工接头，用它可以把平末端的片段连接起来。用平末端连接法将人工接头接在待克隆的基因的两端，然后用限制酶(如EcoRⅠ)处理，产生具有粘性末端的片段，这些片段便能连到已用相同限制酶处理过的载体分子上。借助这种人工接头，产生了位于外源DNA两端的限制酶识别序列，使得外源DNA在宿主菌中克隆化和扩增之后，能恢复原状。

DNA分子连接反应在高浓度DNA溶液中进行，可增加重组体的产率比例。在稀溶液中，由于分子间反应频率下降，有利于线性片段发生环化。用碱性磷酸酶处理线性化的质粒载体DNA去掉5′-磷酸，便阻止了环化作用和质粒二聚体的形成。只有插入未经磷酸酶处理的外源DNA片段提供5′磷酸，才能使载体环化。 (三)重组体转入受体细胞。

外源基因DNA片段与载体组成的重组体，需先转化入受体细胞，才能进行增殖与表达。把重组质粒DNA转入受体细胞叫转化，把重组噬菌体或重组病毒DNA引入受体细胞叫转染。转化的成功与否，首先要使受体细胞处于感受态。大肠杆菌被广泛采用作为受体细菌。使受体细胞呈感受态最简便的方法是用0.01～0.05mol/L氯化钙处理，加入重组体DNA，置低温温育后，在42℃短时间热冲击来提高转化率，然后缓慢加入培养基，生长后在培养基平板上筛选转化子。

(四)重组体克隆的筛选与鉴定

重组DNA分子上如含有的基因是由纯化的mRNA合成的cDNA或PCR产物，只需作少量筛选即可获得所需克隆。但若要从基因库中选出某一特定基因，那么筛选工作就比较复杂。

重组体的选择主要有以下几种方法：

(1)通过表型直接筛选(利用载体的遗传标志：抗生素抗性、噬菌斑形成等)； (2)菌落或噬菌斑原位分子杂交； (3)免疫化学法； (4)遗传互补法。

筛选出重组体后，还必须对重组体DNA进一步鉴定。一般作凝胶电泳鉴定，酶切图谱分析及PCR分析等。除此之外还可采用基因产物分析或对核苷酸序列分析等方法进行鉴定。

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(五)外源基因表达产物的分离纯化

由于表达载体不同，外源基因表达产物存在形式不同，有的以融合蛋白形式存在，有的以包涵体形式存在，有的分泌到细胞外，具体分离纯化方法应根据表达产物的性质及表达产物在细菌培养物中的存在形式设计分离纯化方法。

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实验一 PCR技术

总 论

一、基本原理

PCR的原理与体内DNA复制的过程相似，是由三个基本反应组成的循环性过程。 1．变性：加热将所要扩增的双链DNA解链成单链DNA，

2．退火：使温度下降，寡聚核苷酸引物与所要扩增基因两侧DNA按碱基配对原则结合。 3．延伸；在适当的缓冲液中，Mg2+及4种dNTP存在下，DNA聚合酶能忠实地按模板的碱基顺序合成互补链，即从引物的3′-OH延伸，方向为5′ 3′。可合成与模板顺序完全相同的DNA。

变性、退火、延伸三步反应反复循环，每循环一次所生产的DNA均能成为下一次循环的模板。n为循环次数，因此20次PCR循环将产生约一百万倍(2)的扩增产物。 二、影响PCR的因素 1．耐热DNA聚合酶

(1)背景：耐热DNA聚合酶是从水生栖热菌(Thermusqauaticun,Taq)中分离出的热稳定性DNA聚合酶。Taq酶是从水生栖热菌菌株YT中分同的DNA聚合酶，该菌能在70～75℃的环境中生长，1969年从美国黄石国家公园的一个温泉中分离出了这个菌侏。

由于采用了耐热DNA聚合酶，才必变了PCR的命运，使PCR广泛应用成为可能。一开始PCR所用的酶是大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow片，由于该酶不耐热，在一个循环中，变性之后都要加酶，20次循环要加20次酶，这样PCR反应成本很高，一般实验室无法开展工作。每次都加酶，也使反应复杂。

自1987后,TaqDNA聚合酶被纯化和使用后，PCR技术就在分子生物学的各个领域等于到了非常广泛的应用。从这个意义上讲，是TaqDNA聚合酶给PCR技术注入了新生命力。当然，PCR技术也促进了TaqDNA聚合酶 的研究，使TaqDNA聚合酶的因很快被克隆并在大肠杆菌中表达，酶的产率存了很大提高，使重酶成本大大降低。 (2)性质：(以TaqDNA聚合酶为例) ①温度与酶活性 最适温度75～80℃ 70℃延伸率 60NT/S 55℃ 24NT/S 37℃ 1.5NT/S 22℃ 0.25NT/S 〉90℃无DNA合成

虽然90℃以上不能合成DNA，但较稳定。92.5℃作用130min,活力保持50%，95℃可耐受40min，97.5℃可耐受5 ～ 6min。PCR中，变性温度95℃30秒，50次循环之后，Taq聚合酶活性仍可保持75%。

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②离子与活性

对Mg敏感，Mg浓度适中直激活作用，浓度太高抑制酶活性。 ③核酸外切酶活性

没有3′→5′酸外切酶活性。

有依赖于DNA合成作用的，链置换的5′→ 3′核酸外切酶活性。 ④其他：

适当浓度(50mmol/L)KCl激活50～60%，高于此浓度抑制活性。 ⑤错误率(碱基配对不忠实)

每80，000碱基对中错一个，25轮循环之后，400个碱基对中错一个，dNTP与Mg增高，错误率加大。 (3)用量：

反应总体积为100μl时，酶用量为1～2.5U然而，由于DNA的不同和引物不同，以及其他条件的差别，Taq酶用量亦有差异。Taq酶的试验用在0.5～5IU之间，根据电泳结果决定酶的最佳用量。若酶的用量偏高，有非特异性产物出现。若酶的用量偏低，则合成产物量少。 2．模板：

(1)DNA模板(基因组DNA) ①样品处理

血液、血斑、精液、精斑、羊水、口腔上皮细胞 、尿样、毛发、石蜡包埋组织等都可以提取DNA进行PCR。 ②模板量：10～10目的分子

1μg人基因组DNA单拷贝基因约含3×10目的分子 10ng酵母细胞约含3×10目的分子 1ng大肠杆菌细胞约含3×10目的分子 1/100 M13噬菌斑约含10目的分子 ③模板量与循环次数的关系

目的分子数 循环次数 3×10 25～30 1．5×10 30～35 1×10 35～40 50 45～50

若模板来源困难，以合适模板量及最小循环数为宜。 3．引物的条件： ①长度

与模板顺序互补的分应为15～30个核苷酸(NT)常用20NT左右。近年来，由于引物合成

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3

45

6

55

6

5

6

2+

2+

2+

成本的降低，为了增加特异性，引物长度有增加的趋势。 ②跨度

常扩增2Kb以下的片段，但长片段扩增试剂盒也可扩增10kb以上，有的达数10kb。 ③顺序

要求特异的顺序。可通过基因数据库检测与相关基因的同源性。 ④碱基

GC为40～60%，GC太少扩增效果不佳，GC过多易出现非特异性条带，ATGC最好随机 分配，避免成串的嘌呤和嘧啶，任一碱基的百分含量都在10%～40%之间，不出现5个以上同一核苷酸的寡聚体。 ⑤Tm值

PCR引物的Tm值应为55～80℃。

对于PCR引物，Tm值计算一般以每个G或C 4℃，每个A或T2℃计算，即： Tm=4×(G+C)+2×(A+T) ⑥二级结构

避免引物内部出现明显的二级结构。 ⑦引物间互补

一对引物的顺序不应互补，尤其是避免3′端的互补，以免形成引物二聚体。 ⑧引物二端

3′端：3′端的碱基要求严格配对，特别是最末及倒数第二个碱基要求绝对配对。如果不知扩增序列，而是从氨基酸推测DNA的顺序，引物的3′端最好选择只有一个密码子的甲硫氨酸或色氨酸，如果3′端最末的碱基不肯定，可用次黄嘌呤取代，因为次黄嘌呤(Ⅰ)可与ATGC配对，这样可避免因3′末端碱基不配对而造成PCR失败。

5′端：引物5′端要求不严格，5′可附加一段与模板非互补的序列，可长至45NT，而不影响扩增。 ⑨cDNA引物

除了上述条件外，还应注意：

二个引物应跨越一个或二个内含子，或选择二个外显子剪接处的顺序，这样可以避免基因组DNA的污染而影响结果。引物退火时就不五基因组DNA结合，而只与cDNA结合。 (2)引物量

每条引物的浓度为0.1～1μmol或100pmol～1000pmol转换成μg必须乘以分子量。如0.1μmol 引物转变为μg则为0.1×引物分子量。

引物的精确分子量可用下列公式计算：

引物分子量＝An×312.2 + Gn×328.2 + Cn×288.2 + Tn×303.2 – 61（ An、Gn、Cn和Tn分别为A、G、C和T的数量）。

合成引物时，含量单位常用A260或OD260表示。

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1A260单位指溶于1ml pH7.0磷酸缓冲液在1.0cm光路中测定260nm的光密度值为1.0的冻干寡聚核苷酸量

1A260单位单链DNA=33μg (3)引物应用样品的制备与保存。

引物可直接溶于水或pH7.0(或溶于接近pH7.0)的缓冲液 保存：冻干粉－20℃数年 溶液：－20℃数月 (4)改变引物产生的新型PCR ①反向PCR

典型的PCR是对两个已知序列之间DNA片段扩增。然而反向PCR则将位于已知序列两侧的末知序列进行扩增。用适当的限制性内切酶在已知序列外侧目的基因两端切开DNA链，使酶切片段自身连接形成环状分子，从而将外侧区域化为内侧区域，设计与已知序列末端同源引物，并使其3′端朝向未知区域 ，则可以用PCR扩增环中的未知区域。 ②锚定PCR

如果待扩增的序列只有一端是已知的，别一端是未知的，则可以用锚定PCR进行扩增。例如，要扩增一个感兴趣的mRNA，已知3′端序列，5′端序列不清楚。通过反转录酶将mRNA转录成cDNA,然后在DNA末端转移酶的作用下，在cDNA3'末端加入Poly(dG)尾巴。根据已知一端的特异序列合成第一个引物、带在Poly(dc)尾的“锚顺序”作为第 二个引物，用PCR可扩增出感兴趣的cDNA。 ③不对称PCR

标准的PCR产生靶序列的双链DNA拷贝。不对称PCR可产生单链DNA。主要方法是在PCR反应中加放不等量的一对引物(比例一般为50∶1或100∶1)，经过若干循环后，其中一种引物消耗完，在随后的循环中，只有一种引物参加反应，结果形成了单链DNA。此方法可用于DNA序列分析和制备单链DNA探针。 ④引物标记PCR

对PCR引物5′端进行标记，使得PCR扩增产物5′端带有相应的标记物(如荧光素、同位素和生物素等)。用P ATP直接将一个PCR引物磷酸化，然后在标准PCR反应中直接使用标记引物，扩增出一端带有标记的片段。这种末端标记法对产物直接测序，不影响PCR反应。这种方法标记后，可用杂交检测PCR产物。它也可以对PCR产物进行定量。用不同颜色的荧光染料标记寡苷酸引物，同时使2个或2个以上的DNA区段扩增，终止扩增后除去未延伸的引物，用紫外光照射扩增产物，就能显示某一种荧光染料的颜色或几种荧光染料的颜色组合，例如单呈红色或绿色，则说明缺失了其中一个DNA区段，若显示黄色(由红色和绿色互补形成)则说明这两个区段均存在。 ⑤多重PCR

多重PCR技术就是在一个反应体系中同时混入多对不同的引物，从而扩增出多段PCR产

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物。多重PCR是一种实用可靠的检测DNA缺失方法。 ⑥加端PCR

加端PCR是使扩增产物的末端加上一段DNA顺序的PCR。加端PCR的引物被设计成除与模板配的一部分以外再加上若干碱基这样便能使增产物的末端加上额外的一段DNA。1986年Scharf等利用加端PCR技术在扩增产物末端加上一个限制酶的识别顺序。以后，有人发现引物足够长时扩增产物的末端甚至可加上多至数十个碱基。应用这一方法可以在扩增产物的末端加上特定功能的DNA片段。 ⑦重组PCR

含两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。分子遗传学研究工作中要求引入的点突变、插入或缺失往往并不处于DNA链的末端，所以加端PCR有它的局限性。1986年Mullis等报道了由PCR扩增的两个DNA分子。这一技术可应用于在DNA片段的任何位置引入位点专一性突变、插入、缺失等以及两个不相邻片段的连接。 4．dNTP

四种脱氧核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP的浓度通每种用20～200μmol/L，过高的浓度导致聚合酶将其错误掺入，影响扩增产物；dNTP用量控制在循环50次后，dDNTP仍保留50%，采用等浓度的dNTP可减少误掺入错误，用低浓度的dNTP比用高浓度dNTP有更好的特异性、准确性，dNTP用量与目标序列组成长度有关。值得注意的是dNTP与Mg2+结合影响游离的Mg2+含量、dNTP改变，Mg2+改变。中性的dNTP可直接从试剂公司购得(pharmacia、Sigma、华美)如果购买冷冻干燥的粉剂，可以自配溶液，但自配的溶液必须用NaOH中和，用前用紫外吸收法测定浓度。一般应将dNTP应保存在-20℃ 5．Mg2+

Mg2+浓度对扩增作用的专一性和扩增量有重大影响，通常最适浓度为1.5mmol/L左右(每种dNTP 200μmol/L)。Mg过高，导致非特异性扩增产物。过低则降低扩增产物量。 6．循环参数

各步温度、时间与引物长度及GC含量有关。升、降温度速度快则减少扩增时间，复性效果好。如果变性温度高，则酶活性损失大，变性温度低，则不能全变性，扩增产物产量降低。

退火温度可采用引物Tm-5。

退火与延伸温度合二为一则成为二温循环PCR，其优点是增加特异性和减少反应时间。7．PCR仪 8．产物 (1)凝胶电泳分析

1.5～4%琼脂糖凝胶，分离100～1000bp小片段。 6～10%聚丙烯酰胺凝胶分离小于100bp片段

产物回收：用2～3%低融点脂糖糖凝泳分离。加等体积的苯酚、氯仿，65℃溶化，混匀、

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2+

振荡、速冻、高速离心、上清液加NaCl至0.3mmol/L,用两体积无水乙醇沉淀。 (2)特异性的分析 ①大小与预计一致 ②酶切、切点与设计一致 ③探针杂交 ④顺序分析 (3)不出现扩增条带 ①酶失活，调换新酶

②模板中含有杂质，特别是甲醛固定石蜡包埋的组织，往往常含有甲酸，造成DNA脱嘌呤而 影响PCR结果。

③模板变性不彻底模板先在沸水浴中加热5分钟，后立即冰浴中速冷。 ④引物变质失效

⑤反应体积改变为20μl～100μl温度平衡慢。 (4)非特异条带的出现

①非特异小片段：引物二聚体，引物过量，3′重叠。

②非特异大片段：引物过量，引物顺序特异性不高，循环次数多，酶质量不好，酶量多。 改进：降低酶量或调换酶，增加模板量，降低引物量，减少循环次数，提高退火温度，重新设计较长一点的引物。 (5)出现整个涂沫条带

原因：酶过量，质量差，dNTP过量，循环数过多，退火温度过低MgCl2，浓度过高。 改进办法： ①减少酶量，换酶。 ②减少dNTP。

③增加模板量，减少循环数。 ④改用二温度PCR循环。 ⑤MgCl2过高，降低。 9．污染问题 (1)污染源：PCR产物

(2)防止污染措施，PCR反应前后所用试剂、器材分开存放，设计阴性对照。

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PCR实验方法

一、实验目的

通过扩增特异DNA片段，掌握PCR原理和方法及DNA扩增仪的使用方法。了解PCR引物的设计和PCR产物克隆载体。 二、实验方法

1.取一0.2ml微离心管，标上组号，依次加入：

成分

10×PCR Buffer ddH2O

引物1（10pmol/μl） 引物2（10pmol/μl） 质粒DNA

dNTPMixture（10mmol/leach）

用量

5μl 37.5μl 1μl 1μl 1μl 4μl 0.5μl 50μl

Taq DNA聚合酶

Total

2.12000r/min离心2S。 3.按下列步骤，在DNA扩增仪。 预变性94℃ 5-10分钟 (1)94℃ 30秒 (2)55℃ 30秒 (3)72℃ 1分钟 30次循环 置72℃ 10分钟 三、试剂 1.10×PCR Buffer 2.ddH2O

3.引物1（10pmol/μl） 4.引物2（10pmol/μl） 5.质粒DNA

6.dNTPMixture（10mmol/leach） 7.Taq DNA聚合酶 四、器材 1.0.2ml微离心管

2.微量可调移液器(10μl、40μl、200μl、1000μl)

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3.微离心管架 4.微量可调移液器架 5.记号笔 6.冰盒 五、仪器 1.高速台式离心机 2.DNA扩增仪 六、说明 PCR产物克隆

在PCR进行之后，经常要对PCR产物进行克隆，即将PCR产物与载体(一般是质粒载体)连接，要使PCR产物与载体正确连接，可以在PCR引物中加入限制性酶切位点序列及适当的保护碱基，PCR之后，对PCR产物进行酶解，然后与用相同酶解的载体进行连接。由于采用TaqDNA聚合酶的PCR实验，其扩增产物3′-末端有一突出的核苷酸，且主要是腺嘌呤核苷酸(A)，因此不能简单地采用平齐末端连接法对PCR产物进行克隆。如果要用平齐末端连接法连接则应该用酶将PCR产物末端补平，然后进行连接。更常用的办法是用末端含T的载体进行克隆。此类载体有TaKaRa的pMD18T、Promega的pGEM T Vector System、Invitrogen的Original TA Cloning Kit、Eukaryotic TA Cloning Kit Unidirectional、Eukaryotic TA Cloning Kit Bidirectional、Baculovirus TA Cloning Kit, R&D Systmes的LigATor Kit,Amershan的pMOSBlue T Vector Kit等。但使用T载体要注意某些DNA聚合酶如Pwo不产生类似的末端。

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实验二 琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA

一、原理

用于DNA分离、纯化和鉴定的凝胶电泳有二类，一类是琼脂糖凝胶电泳，适用于1kb和大于1kb以上DNA；另一类是聚丙烯酰胺凝胶电泳，适用小于1kb的DNA。琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便，快速分离、纯化和鉴定DNA的方法，已广泛应用于核酸研究中。DNA在琼脂糖凝胶中迁移率和凝胶浓度、DNA分子大小、DNA分子的构象及电泳电压密切相关。染色采用溴化乙锭(EB)，EB在紫外线照射下的发射荧光。EB能插入DNA分子中形成荧光结合物，使发射的荧光增强几十倍。荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估计出待测样品的浓度。 琼脂糖浓度 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 二、方法

1．制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖0.15 g，溶解在15ml电泳缓冲液中，置微波炉中至琼脂糖溶化均匀。

2．灌胶：在电泳槽载胶板插好点样梳子。在凝胶溶液中加EB 3μl,摇匀,倒入电泳槽载胶板中，除掉气泡。

3．待凝胶冷却凝固后轻轻取出点样梳。

4．点样：提PCR扩增产物5μl+0.5μl溴酚蓝指示剂，混匀、点样。 记录点样次序及点样量

5．在电泳槽中加入电泳缓冲液，将点好样的载胶板轻轻放在电泳槽内。

6．电泳：接上电极线，点样侧接电泳仪负极， 另一侧接电泳仪正极，50V电泳45至60分钟。

7．将电泳槽载胶板拿到暗室，在紫外灯下直接观察结果。 三、试剂： 1．电泳缓冲液：

40mmol/L TrisHCl(pH8.0) 20mmol/L NaAC 2mmol/L EDTA

分离范围(kb) 560 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-4 0.1-3 -13-

配制方法：先配50倍电泳缓冲液，用时取5ml，重蒸水稀释至250ml。 50倍电泳缓冲配制方法： Tris 121.1 g 无水NaAC 41.0 g EDTA·Na2 18.6 g

先用400ml重蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调节pH至8.0(大约25毫升)然后加馏水定容至500ml。1.1kg/cm2灭菌20分钟。 2．EB：(10 mg/ml 溴化乙锭) 溴化乙锭 1g ddH2O 100 ml 3．琼脂糖 四、器材 1.0.2ml微离心管

2.微量可调移液器(10μl、40μl、200μl、1000μl) 3.微离心管架 4.微量可调移液器架 5.记号笔 6.冰盒 7.一次性手套 五、仪器 1．微波炉 2．电泳仪 3．紫外检测仪 4．电泳槽 六、说明

1．DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率与凝胶浓度、DNA分子大小、DNA分子构象及电泳电压有关。

(1)凝胶浓度 根据待分离DNA分子的大小，选择凝胶中琼脂糖的含量(凝胶浓度)。 (2)DNA分子大小 线状双链DNA分子在一定浓度凝胶上电泳的迁移率与线性双链DNA分子的分子量对数成反比。

(3)DNA分子的构象 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中泳动距离与DNA的分子量对数成反比。但当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动的距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。有相同分子量的线状、开环状(超螺旋为O)和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的。高度超螺旋的DNA移动速度最快，随着超螺旋程度降低，相应DNA的移动速度依次变慢，最慢者为线状双链DNA。了解这一点对分析DNA电泳图谱至关重要。

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当用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒纯度时，发现凝胶上有数条DNA带，难以确认是由于质粒本身存在着超螺旋引起的，还是因为含有其他DNA引起的可采用下述方法鉴定。从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶切，然后在琼脂糖凝胶上电泳，如果在凝胶上出现相同的DNA图谱，则说明它们是处于不同超螺旋状态的同一种DNA。

(4)电源电压 低压条件下，线状DNA在琼脂糖凝胶上泳动速度和电压成正比。随着电压升高，高分子量的DNA片段泳动速度和电压不成正比关系，分辩率下降了，因此为了得到良好的分离效果，电场电压不要超过5V/CM。

2．DNA琼脂糖凝胶电泳图谱分析离不开紫外分析灯，可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA供重组用时，避免紫外光切割是非常重要的，尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300～360nm)可减少紫外光切割DNA。

3．溴化乙锭(EB)染色：溴化乙淀是核酸的染色剂，在水平式琼脂凝佼电泳中，EB对DNA的染色，一般有三种做法。

(1)在制胶中与电泳缓冲液中同时加入0.5μg/ml的EB。

(2)只在胶中加入0.5μg/ml的EB，而在电泳缓冲液中不加EB，这就减少了操作时双手受EB污染的机会，而且DNA区带也清晰可见。这是目前绝大多数实验使用的方法。 (3)在电泳结束以后，取出琼脂糖产凝胶，放在含有0.5μg/mlEB的电泳缓冲液(或ddH2O)中染色40分钟。如果天气寒冷，琼脂糖浓度高凝胶板厚也可在37℃保温染色或轻微振荡染色。也可采用加大EB的剂量(1μg/ml)或延长染色时间。

比较3种使用EB方法，采用(1)与(2)可与实验过程中随时观察DNA的迁移情况，极为方便。但是(1)的操作更需小心，谨慎，防止实验用具及台面的EB污染。所以一般选用(2)。(3)的好处是电泳过程中DNA保持本来的状态，有利于凝胶图谱分析，更能准确地测定DNA分子量。因为在凝胶中有EB时，一定量EB插入DNA就会使双链线状DNA的迁移速度下降。

EB是强致癌剂，因此使用过程上要注意戴手套，及时用高锰酸钾处理污染物。具体的方法如下：

(1)加入足量的水使溴化乙锭的浓度降低至0.5mg/ml以下。

(2)加入1倍体积的0.5mol/L KMnO4，小心混匀后再加1倍体积的2. 5mol/L HCl。小心混匀，于室温放置数小时。

(3)加入1倍体积的2.5mol/L NaOH,小心混匀后可丢弃该溶液。 以前曾广泛采用的用次氯酸处理溴化乙锭稀溶液的方法，效果不好。 此外，溴化乙锭在262℃分解，在标准条件下焚化后也不再具有危害性。

4．溴酚蓝指示剂：常用的电泳上样缓冲液含溴酚蓝，有的还含有二甲苯青，这些指示剂可以指示电泳的速度，也可以利用其迁移率大致估计DNA的分子量。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关，以0.5×TBE作电泳缓冲液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5～1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶

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成分 10×连接Buffer

回收的PCR产物（100ng/μl）

T载体（50ng/μl） T4DNA连接酶（6WeissU/μl）

ddH2O 总体积

10 000r/min离心5s混匀。

用量 1 5 1 1 7.0 15.0

放在调好16℃的保温瓶内，并将保温瓶装盖严，置4℃冰箱冷藏式放置过夜。 三、试剂

1．10×T4DNA连接酶缓冲液 660mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 55mmol/L MgCl2 50mmol/L DTT 10mmol/L ATP 2．无菌水 3．T4DNA连接酶 四、说明 1．连接缓冲液

现使用的缓冲液多数是随商品连接酶由厂家同时提供的。也可自己配制。常用的缓冲液为Tris-HCl溶液，pH7.5,使用时需加含-SH的化合物如疏基乙醇和二硫苏糖醇，还应有一定浓度的Mg2+及新鲜未降解的ATP。除此之外，还常加入一定量的牛血清白蛋白。为了保证ATP不被降解，每次要用新鲜的，也可直接配制在连接缓冲液中，因为在连接缓冲液中ATP比较稳定。连接缓冲液应在-20℃冰箱中保存，储备液不可反复冻融，最好配制后分装保存。 2．DNA连接酶用量

T4DNA连接酶的量以Weiss单位度量。1Weiss单位是20分钟37℃催化1nmol［P］焦磷酸转化到［P］ATP的酶量。连接酶用量与DNA片段的性质有关，如果需要连接平齐末端，必须加大酶量，一般用连接粘性末端酶量的10～100倍。连接平齐末端时，还可加入T4RNA连接酶，在T4RNA连接酶存在下，可使平齐末端的连接效率提高数十倍，但对粘性末的连接并无影响。

3．连接带有粘性末的DNA片段时，DNA浓度一般为2～10μl/ml,连接平齐末端时，需加大DNA浓度至100～200μg/ml(这里浓度的计算以假定DNA片段长度为200～5000bp对为前提)。提高DNA浓度将促进分子间的连接，降低浓度对分子本身环化有利。

4．连接反应后，反应液可在0℃储存数天，-8℃储存2个月。但是，在-20℃冰冻保存将会

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降低转化效率。

5．粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定。所以，尽管T4DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，温度以15～２０℃为宜。

6．5mmol/L ATP将完全抑制T4DNA连接酶连接平齐末端，而181mmol/L ATP才能抑制粘性末端的连接。连接反应液中ATP浓度一般在0.5-1mmol/L范围内。

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实验五 重组DNA的转化

一、原理 1．转化的概念

外源基因DNA片段与载体组成的重组，需先进入受体细胞，才能进行增殖与表达。以质粒为载体得到的重组体或重组子是重组质粒。把重组质粒DNA转入受体细胞(菌)称为转化。把重组噬菌体或重组病毒DNA引入受体细胞(菌)叫转染。 2．感受态

感受态就是细菌吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。所以要转化成功，首先要使受体菌处于感受态。刺激细菌使之成为感受态的方法很多，如CaCl2处理、电激等。 3．DNA转化的过程

受体菌以Ca2+处理，在低温中与外来DNA分子相混合，DNA分子转化的复杂过程包括4步：

(1)吸附—完整的双链DNA分子汲附在受体菌的表面；

(2)转化—双链DNA分子解链，单链DNA入受体菌，另一链降解； (3)自稳—外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环装DNA； (4)表达—供体基因随同复制子同时复制并被转录、转译。 二、方法 

(一)受体菌的培养与CaCl2处理

1.从固体培养基平板上吊菌接种到2mlLB试管中，37℃振荡培养过夜。 2.取0.4ml菌液转接到30ml/150ml三角烧瓶中，振荡培养2小时30分钟以上， 3.取9ml菌液于灭菌有盖离心管4000 r/min离心5分钟，收集菌体。

4.把菌体悬浮在75mmol/L CaCl2中(约10毫升左右)，冰浴25分钟，4000r/min离心5分钟，收集菌体。

5.再把菌体悬浮在0.6毫升的75mmol/L冷CaCl2中，使菌液浓缩15倍(9毫升～0.6毫升)，冰上作为转化用的受体菌菌液。 (二)转化反应

1．在灭菌的1.5ml离心管中加入50μl新鲜制备的DH5α感受态菌及5μl的连接产物，混匀后冰浴30min。

2．将离心管移入42℃水浴中，恰好停留90sec（切忌振荡）。使受体菌极短暂热刺激，以利于DNA的吸收，提高转化效率。

3．立即将离心管置于冰浴中，120sec后再移入37℃水浴中孵育5min。

4．向离心管中加入200μlLB液体培养基，在37℃恒温振荡器上以110r/min培养1h。以利转化后的受体菌，在良好的环境(通气、新鲜的LB液体培养基)中繁殖生长。 (三)涂板

1取反应物在平板上涂布。

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2涂布菌液的平板置室温下干燥，然后倒置在37℃温箱中培养过夜。 三、试剂

75mmol/L CaCl2溶液 无水氯化钙4.16克 ddH2O 至500毫升 1.1kg/cm灭菌20min 四、材料 1．菌种 大肠杆菌 DH5α 2．培养基 (1)LB液体培养基 LB液体培养基 精解蛋白胨 3 g 酵母浸出粉 1.5 g 氯化钠 3 g 葡萄糖 0.6 g

按上述配方用重蒸水(ddH2O或dH2O表示，下同)溶解至300 ml。用10mol/L NaOH调pH至7.2～7.4。分装于15 ml 试管中，每支5ml。然后置高压蒸汽消毒锅以1.1kg/cm灭菌20 min。

(2)LB固体培养基：取500ml三烧瓶，加入 琼脂 4克 LB液体培养基 200ml 1.1kg/cm灭菌20分钟 3．抗菌素 Amp(100mg/ml) 五、仪器 1．恒温培养箱 2．恒温振荡器 3．普通离心机 六、说明

1．连接后的DNA溶液与细胞混合后，一定要在冰浴条件下操作。如果温度时高时低，转化率极差。

2．DNA连接液的盐浓度较高，与细胞混合时要加以稀释，因为高盐浓度会影响转化率。 3．外源DNA的大小和结构对转化效率有很大影响，一般说来，分子越小，转化效率越高；环形分子的转化效率比线形分子的转化效率要高等于多。共价闭环的超螺旋的质粒DNA比同

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种线形DNA分子的转化效率高上千倍，因此，在转化前要尽量保证重组DNA为完整的环状分子。

4．用于转化的细菌细胞在对数生长期的转化能力最高，静止生长期以后，转化能力逐渐丧失。

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部应该没有浓缩条带。根据所用的限制性内切酶，你还可能在成片DNA中看到卫星条带，这些条带是分开的。)

1.3 用乙醇沉淀消化物：加50ul 3mol/L NaAc,混匀。后加1ml乙醇并混匀。在-20℃至少放置30min；离心20min,14000rpm。去上清。

1.4 用70％乙醇清洗一次：加1ml 70％乙醇，14000rpm 5min。去上清。离心5s使残余液体流到管底。吸掉液体。空气中干燥15min。

1.5 用TE（PH8.0）重悬沉淀。（TE的体积取决于凝胶孔的大小，样品包括染料，应加满约3/4孔的体积。时间允许可室温放置30min-1h 以使沉淀完全溶解）

1.6 缓慢电泳：0.7%琼脂糖凝胶（4－5mm厚）电泳，跑过夜或一整天（2.5V/cm凝胶长度） 1.7 切掉凝胶四周多余部分，并在凝胶的一角作一记号，拍照，记录电泳结果(拍照时，凝胶旁放一尺子)。 2 凝胶变性与转膜

2.1 凝胶在碱性变性溶液中进行DNA变性

2.1.1 室温下将凝胶浸于数倍体积（没过胶）的碱性变性缓冲液中15min并轻轻振荡； 2.1.2 换液一次继续浸泡凝胶20min，并轻轻振荡。

2.1.3 弃去变性缓冲液，水中清洗1遍，加入数倍体积（没过胶）的中和缓冲液。室温不断振摇30min（2×15min）。

2.2 组装转移装置及在碱性溶液中转膜 (注意：在拿尼龙膜时应戴无粉末的橡胶手套，用钝镊子夹膜的边缘。)

2.2.1准备DNA从凝胶向膜转移的平台，将1张待用尼龙膜和3张厚滤纸切成与待转移胶相同大小，并在尼龙膜一角做一标记。

另1张厚滤纸切成与凝胶相同宽度，长度(约18cm)足以达到转移液盒子的底部。 将待用尼龙膜用蒸馏水浸湿后，再浸入碱性转移缓冲液中。 安装毛细管转移装置

A．将长的滤纸放在转移平台的顶部，滤纸两端达到转移盒的底部，做成虹吸桥。 B．将8 0mL转移液倒入转移盒内，并湿润滤纸。

C．将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上，凝胶与滤纸间避免有气泡。 D．用保鲜纸封住凝胶四边。

E．将浸湿的转移膜置于凝胶的上部，凝胶与膜间避免有气泡。

F．将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面，并放一叠吸水纸搭在滤纸上，再放一 玻璃板，其上压一重物。

G．转移几小时或过夜(至少4小时) 注意：勿使转移液干枯。

2.2.2 DNA转移需要8－24小时，当纸巾湿润后更换新的纸巾。尽量避免整叠纸巾都被缓冲

液浸湿。

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2.2.3 除去凝胶上的纸巾及吸水纸。翻转凝胶以及与之接触的膜，凝胶向上平放与干燥的吸

水纸上。用笔标记加样孔的位置。

2.2.4 将凝胶从膜上剥离，弃去凝胶。采用紫外交联固定DNA： A．将膜放在浸有10 X SSC的厚滤纸上，有DNA的一面朝上。 B．将膜置于UV crosslinker 中，在紫外光下自动交联。

C．用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜，直接用于杂交或空气中干燥保存备用。 （此膜可在4℃长期保存。） 3 预杂交与杂交 3.1 预杂交

将适量（20ml/100cm）的预杂交液DIG Easy Hyb在42℃预热。放入印迹膜，在42 ℃

预杂交2-3h。 3.2 杂交 3.2.1准备探针

水煮地高辛标记的探针(5-25ng)10min使变性，并立即放在冰上2min。

3.2.2加适量(5-25ng)的探针到已预热的杂交液(2.5ml/100cm)中，混合均匀(避免形成泡

沫，影响杂交效果)。

3.2.3 倾倒预杂交液，将探针和杂交液的混合液加入膜中。 3.2.4 42℃杂交16小时。 3.3 洗膜

3.3.1将杂交液倒出，储存起来可再次使用。

3.3.2用25mL的2 X SSC，0.1% SDS 在室温摇动洗膜2次，每次5min 。

3.3.3用已预热的30mL 0.5XSSC,0.1%SDS 在68℃摇动洗膜2次，每次15min (用杂交炉)。 4 免疫检测

4.1用10mL冲洗液洗膜1-5min。(washing buffer)

4.2膜在100 mL封闭液（buffer 2）中孵育30-60min。(轻轻搅动，同时准备anti-DIG-AP。) 4.3 将anti-DIG-AP用buffer 2配成75mU/ml (1:10000稀释)。 4.4倒掉封闭液，将膜和20 mL抗体anti-DIG-AP孵育30min。

4.5倒掉anti-DIG-AP，在100 mLwashing buffer中洗膜2次，每次15min。 4.6在20ml detection-buffer 中平衡2－5min。

4.7将膜的有DNA的面朝上,放在保鲜纸上，滴数滴CSPD ready-to-use 覆盖膜，然后，立即用保鲜纸包裹，挤掉多余的CSPD ready-to-use，使其均匀平铺在膜上，没有气泡，但避免使膜干掉。室温孵育5min。

4.8在37℃孵育潮湿的膜10min（5-15min）。增强发光。

4.9用Lumi Film或X-光底片将杂交膜进行室温曝光15-30min。(发光性能至少可持续48小时)

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4.10 X-光底片的冲洗

Agfa 30显影液显影(1-5min)---冲水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水冲洗---晾干底片 三、试剂的配制： Lysis buffer:

100Mm Tris-HCL (PH 8.5) 5mM EDTA 0.2% SDS 200mM NaCL

100ug/ml Proteinase K (20mg/ml Proteinase K stock is stored at -20℃ andded

to the Lysis buffer prior to use.)

酚：氯仿：异戊醇 （25：24：1）

TE buffer (10Mm Tris-HCL PH8.0 , 1mM EDTA ) 3M NaAc PH 5.2

PBS (NaCL 8g/L, KCL 0.2g/L, Na2HPO4 1.44g/L, KH2PO4 0.2g/L) Trypsin/EDTA (0.25%Trypsin, 1mM EDTA 2Na)消化液 变性缓冲液：0.5mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCL

中和缓冲液：0.5mol/L Tris-cl (PH7.5), 3mol/L NaCL 碱性转移缓冲液：0.4mol/L NaOH, 1mol/L NaCL 四、仪器设备：

恒温水浴箱、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、紫外检测仪、暗盒、杂交炉、紫外交联仪等。

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实验九 真核细胞RNA的提取

一、原理

本方法利用将TRIzol一步法进行总RNA提取的实验方案。 二、方法

（一）样本制备和保存 1、组织样本的制备 1）动物组织

1) 首先准备好用于包装样本的铝箔或冷冻保存管，并且用油性记号笔在铝箔或冻存管外表多处写明样本编号。

2) 准确切除所需组织后，立即在冰上剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型。 3) 在RNase-free 的生理盐水中迅速漂洗样本，以去除血渍和污物。 4) 用准备好的铝箔或冷冻保存管装载包裹组织，迅速投入液氮冷却。

5) 做好实验记录，写明样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。 注意事项

（1) 包裹组织的铝箔或冷冻保存管转入样本袋时，按以下步骤进行：把样本袋（纱布袋等）放入液氮中冷冻一下，而后将液氮冷却的组织放入样本袋（每个样本袋只保存同样的组织，样本较多时应分装至多个小袋，不要在一只样本袋中放过多的样本以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出），袋口留一根编号绳，绳上粘标签纸（标签上注明：样本名称、编号、日期），迅速转入液氮罐。

（2) 不要用Eppendorf管保存组织样本，因为Eppendorf管从液氮中取出时极易发生管子爆裂而造成样本损失。

（3) 在采集临床标本时，如果时间不允许进行样本清理，就立即将样本投入液氮中以确保样本的质量。 2、细胞样本的制备 1）贴壁细胞

（1) 贴壁细胞培养诱导结束后，去除培养液。

（2) 按每10 cm细胞加2 mL TRIzol试剂的比例加入TRIzol试剂。 （3) 缓慢旋转培养瓶数次，使TRIzol试剂充分接触培养瓶表面进行消化。

（4) 转移到RNase-free的试管中用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，使之充分溶解于TRIzol中形成清亮不粘稠的液体。

（5) 进行后续的RNA提取实验或者是放入干冰或-80℃冰箱中保存。

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2

2）悬浮细胞

（1) 悬浮细胞培养诱导结束后，离心去除培养液。

（2) 按照每5×10个细胞加1 mL TRIzol的比例加入TRIzol试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，使之充分溶解于TRIzol中形成清亮不粘稠的液体。 （3) 进行后续的RNA提取实验或者是放入干冰或-80℃冰箱中保存。 3）全血样本的白细胞分离

（1) 在已加入抗凝剂的新鲜全血中加入等体积PBS（1×），充分混匀。

（2) 缓慢转入另一已加入淋巴细胞分离液的离心管中，并使上述混合液处于淋巴细胞分离液液面之上（即两种液体不要混合，保留清晰的界面），3000 g离心30 min。

（3) 用移液枪小心分离出白细胞层；用PBS（1×）清洗白细胞，离心回收白细胞，弃去上清。

（4) 加入白细胞20倍体积的TRIzol试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，使之充分溶解并形成清亮不粘稠的液体。

（5) 进行后续的RNA提取实验或者是放入干冰或-80℃冰箱中可以保存半周左右。 注意事项

（1) 未经TRIzol试剂处理的细胞样本不要保存。

（2) 如果样本是冻存可复苏的细胞株，应首先验证所用冻存方法用于RNA提取的可靠性，以便确保实验成功。

（3) 血液样本保存是不稳定的，新鲜血液必须立即分离出白细胞或者直接提取RNA进行保存。

（4) 白细胞样本保存也是不稳定的，白细胞样本务必按照上述过程进行保存。 （5) 不要在-20℃冰箱中保存RNA或者白细胞样本。 （二）总RNA提取 1. 试剂使用量

1） TRIzol的使用量： 2） 氯仿的使用量：

每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿。

3） 异丙醇的使用量： 每1 mL TRIzol加入0.5 mL异丙醇。 4） Milli-Q水的使用量：根据沉淀的大小确定。

2. 实验过程

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6

样本量

10 cm贴壁培养细胞 5×10悬浮培养细胞 1 mL 白细胞 50 mg普通组织样本

50 mg特殊组织样本（肝、脾、骨及软骨等等）

15 mg植物组织（多糖和多酚含量不高的）

2.1 细胞样本的分离和匀浆 2.1.1 全血中白细胞的分离

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TRIzol（mL）使用量

2 1 20 1 2 1

1) 将血液或骨髓样本中加入等体积的1×PBS缓冲液，混匀。 2) 在一体积足够大的离心管，加入淋巴细胞分离液。

3) 取与淋巴细胞分离液等体积的样本液，将其小心注入淋巴细胞分离液液面上。 4) 4℃条件下，3000 g离心30 min。

5) 小心吸取中间层悬浮的白细胞至一新的离心管中。 6) 4℃，8000 g离心5 min。

7) 弃上清，在沉淀（白细胞）中加入裂解液（TRIzol），体积比1:20。 8) 匀浆至沉淀清亮透明无粘稠感。 9) 在15~30℃放置5 min。 2.1.2 贴壁培养细胞

1) 倒出培养液，用1×PBS清洗一次。

2) 按每10 cm生长细胞加2 mL TRIzol，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，用移液枪吹打细胞使其脱落（对于贴壁牢固的细胞用细胞刮刮离表面）。 3) 将裂解液及细胞转移至一离心管中，用一次性注射器反复抽打直至裂解液清澈透明不粘稠。

4) 在15~30℃放置5 min。 2.1.3 悬浮培养细胞

1) 将悬浮培养的细胞连同培养液倒入一离心管中，2000g，4℃离心20min。 2) 弃上清，加入1×PBS 1mL轻轻吹打，1000g，4℃离心5min。 3) 弃上清，按每5×10个细胞加入1mL TRIzol。

4) 用一次性注射器反复抽打直至裂解液清澈透明不粘稠。 5) 在15~30℃放置5 min。 2.2 组织样本的碾磨及匀浆

1) 将超低温保存的样品除去样品袋，在电子天平上称重后，转移至用液氮预冷的碾钵中，

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6

2

用杵子碾磨组织，其间不断加入液氮，直至碾磨成粉末状（无可见的颗粒，如果没有碾磨彻底会严重的影响RNA的产量和质量）。

2) 将碾磨成粉末状的样品，转移至已经加入适量TRIzol试剂的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中，在组织匀浆粉碎机上进行匀浆。匀浆液较透明且无颗粒即可。 3) 小心吸取匀浆液转入新的离心管，在15~30℃放置5 min。 4) 将离心管于4℃，12000 g，10 min离心（加速度:减速度=9:1）。 5) 小心吸取上清液转入新的离心管（切勿吸取沉淀）。 2.3 总RNA的抽提

1) 向裂解液中加入氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），在15~30℃放置3 min（由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心）。

2) 于4℃，12000 g，离心15 min（加速度：减速度=9:1）。

3) 从离心机中小心地取出离心管，吸取体积约为TRIzol试剂起始加入量一半的上清至另一无RNA酶的离心管（切忌吸动白色中间相）。

4) 向上清加入异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，在15~30℃放置10 min（如何没有明显沉淀，可以-20度过夜）。

5) 于4℃，12000 g，离心10 min（加速度：减速度=9:1）。 2.4 总RNA沉淀的洗涤

1) 小心弃去上清，缓慢地沿管壁加入75%乙醇1mL（切勿触及沉淀），轻轻颠倒洗涤离心管管壁，小心弃去乙醇。

2) 再加入75%乙醇1 mL，在涡旋器上短暂涡旋（使沉淀悬浮于75%乙醇水中）；于4℃，8000 g离心10 min。

3) 小心弃上清，短暂离心，用枪吸去所有上清，在超净工作台中干燥沉淀5 min使乙醇挥发。 4) 加入适量的RNase-free Milli-Q，用枪吸取Milli-Q水轻轻吹打沉淀，使其悬浮于Milli-Q水中，50℃保温10 min，待RNA沉淀完全溶解后，-80℃保存。

5) 一般来说，总RNA沉淀应该快速地溶于Milli-Q水中（正常的现象是，沉淀在Milli-Q水中快速旋转并且同时溶解）。但是，某些RNA沉淀，可能在悬浮于Milli-Q水10 min后仍有固体物存在，则于4℃，12000 g，离心10 min（加速度：减速度=9:1）后，转移上清至另一1.5 mL离心管-80℃保存。剩余的固体物加入Milli-Q水后也保存于-80℃。

6) 一般说来，用TRIzol提取到的总RNA中盐含量是比较高的，因此沉淀的洗涤非常重要。上清和管壁上残留的液体要尽量除去干净。 三、常用试剂及器材

TRIzol Reagent、DEPC、乙醇、异丙醇、氯仿、PBS、 Milli-Q水 液氮、冰箱、玻璃匀浆机、电泳仪、离心机、电泳图象分析仪等

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还要注意，试剂配制或分装过程中使用的实验耗材以及容器等必须都是经过RNase-free处理的。 四、说明

提取RNA时，要特别注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均应用0.1%的二乙基焦碳酸盐(diethyl pyrocarbonate,DEPC)处理。塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处理，必要时，也可用0.1TPC处理。

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实验十 RNA Northern blot 分析

一、原理

Northern杂交是用子RNA定量和定性分析的常用技术，它是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进行核酸分子杂交的一种实验方法。这种方法可以鉴定总RNA或Poly(A)RNA样品中同源RNA的存在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度，是分子生物学中研究基因表达在转录水平上的调节以及cDNA合成的重要手段。

Northern杂交的基本原理与Southern杂交大致相同，但由于Northern杂交采用RNA作为实验树料，因而具有一些与DNAA分子杂交不同的特点。RNA是由A、U、G、C四种核糖核昔酸组成的线性多聚物，组成RNA的核苷酸同DNA一样是通过3’、5’磷酸二酯键彼此连接起来的，C2上的羟基并不参与磷酸二酯键的形成。由于C2羟基的存在，使得RNA的理化性质与DNA有较大差异。首先，RNA酶对RNA的降解作用是通过C2羟基直接进行的，这一过程不需要辅助因子，因此二价金属离子整合剂对RNA酶活性无任何影响。另外，RNA分子可以自发水解，特别是在强碱条件下很容易通过C2羟基参与形成2’，3’磷酸二酯键环而降解，因此RNA的变性方法与DNA不同，不能用碱变性。

RNA的电泳分析与DNA电泳也有一些不同之处。首先，非变性胶电泳无法测定RNA分子的相对分子质量．这是因为单链RNA分子的某些区段含有互补区的双螺旋结构，使得在未变性的条件下，RNA的相对分子质量与活动度的相关性较差，只有在完全变性的条件下，RNA在凝胶中的泳动度才与相对分子质量的对数成线性比例关系。甲醛电泳是一种理想的RNA变性电泳方法。甲醛可以与碱基形成具有一定稳定性的化合物，同时也可以降低电泳系统的离子强度，这些有助于阻止RNA分子互补区的碱基配对，使RNA分子完全变性。其次，同其他有关RNA而操作一样，RNA电泳过程中应始终抑制RNA酶的活性，包括避免外源RNA酶的污染与和抑制内源性RNA酶的活力。

在Northern杂交中，由于细胞中mRNA在总RNA中含量很低，只占约1％-5％，而rRNA约占75％、tRNA约占15％一20％，这样高丰度的rRNA和tRNA易与探针部分配对或非特异结合，造成假阳性信号干扰，一种解决办法为预先分离mRNA，以去除rRNA和tRNA，用分离得到的mRNA进行杂交。另外，对于内源基因产物的检测，应选取与rRNA同源性低的探针来进行杂交。而对于外源基因转录水平的检测，可将检测物种自身的DNA用于预杂交液中以掩盖内源的RNA。当然，采取尽可能严紧的杂交条件，如高退火温度或高甲酰胺含量也有助于干扰信号的消除。

Noothern杂交中核酸探针的制备与southern杂交相同，可分为放射性标记和非放射性标记两种方式。放射性标记的探针灵敏度高，分辨率好，是目前较为常用的一种方法，但探针

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的非放射性标记方法由于具有安全、快速、无同位紊污染等优点被认为将会取代放射性标记方法。 二、方法 1. 用具的准备：

180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。

电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。 处理DEPC水(2 L)备用。

2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染

用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。 3．制胶：

3.1称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)

3.2在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。 注意尽量避免产生气泡。

3.3将熔胶倒入制胶板中，插上梳子

如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。注：胶的厚度不能超过0.5cm。

3.4胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。（配制250ml 1＊MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。） 3.5检查点样孔。 4.RNA样品的制备

在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB（终浓度为10ug/ml）。混匀后，65℃空气浴15min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。 5. 电泳：

5.1将RNA样品小心加到点样孔中。

5.2在5V/cm下跑胶（5ｘ14cm）。在电泳过程中，每隔30min短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝（500bp）接近胶的边缘时终止电泳。 5.3紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。 注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。 6. 转膜

6.1用3%双氧水浸泡真空转移仪后，用DEPC水冲洗。

6.2用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。

6.3连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5mm），膜在Transfer buffer浸湿5分钟后，放置在多孔渗水屏的适当位置。

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6.4盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。

6.5将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。

6.6将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。

6.7打开真空泵，使压强维持在50~58mbar；立即将transfer buffer加到胶面和四周。每隔10min在胶面加上1ml transfer buffer，真空转移2小时。

6.8转膜后，用镊子夹住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10秒，去除残余的胶和盐。

6.9用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV交联仪中自动交联。

6.10将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间) 6.11将膜在-20℃保存。 7. 探针的制备

7.1探针标记：(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ,boehringer Mannheim Cat.No.1585614)

7.2依据DNA浓度，在PCR管中加入1ug模板DNA（PCR回收产物），加水至16ul。 7.3沸水中，水浴10分钟，迅速放入冰无水乙醇中。 7.4加入4ul DIG-HIGH Prime,混匀，短暂离心。 7.5 37℃水浴孵育1－20小时（过夜）。

7.6加入2ul 0.2M EDTA(PH8.0),终止反应。（或65℃，10分钟） 8. 预杂交与杂交 8.1 预杂交

将适量（20ml/100cm）的预杂交液DIG Easy Hyb在42℃预热。放入印迹膜，在42 ℃ 预杂交2-3h。 8.2 杂交 8.2.1准备探针

水煮地高辛标记的探针(5-25ng)10min使变性，并立即放在冰上2min。

8.2.2加适量(5-25ng)的探针到已预热的杂交液(2.5ml/100cm)中，混合均匀(避免形成泡

沫，影响杂交效果)。

8.2.3 倾倒预杂交液，将探针和杂交液的混合液加入膜中。 8.2.4 42℃杂交16小时。 8.3 洗膜

8.3.1将杂交液倒出，储存起来可再次使用。

8.3.2用25mL的2 X SSC，0.1% SDS 在室温摇动洗膜2次，每次5min 。

8.3.3用已预热的30mL 0.5XSSC,0.1%SDS 在68℃摇动洗膜2次，每次15min (用杂交炉)。 9．免疫检测

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2

2

9.1用10mL冲洗液洗膜1-5min。(washing buffer)

9.2膜在100 mL封闭液（buffer 2）中孵育30-60min。(轻轻搅动，同时准备anti-DIG-AP。) 9.3 将anti-DIG-AP用buffer 2配成75mU/ml (1:10000稀释)。 9.4倒掉封闭液，将膜和20 mL抗体anti-DIG-AP孵育30min。

9.5倒掉anti-DIG-AP，在100 mLwashing buffer中洗膜2次，每次15min。 9.6在20ml detection-buffer 中平衡2－5min。

9.7将膜的有DNA的面朝上,放在保鲜纸上，滴数滴CSPD ready-to-use 覆盖膜，然后，立即用保鲜纸包裹，挤掉多余的CSPD ready-to-use，使其均匀平铺在膜上，没有气泡，但避免使膜干掉。室温孵育5min。

9.8在37℃孵育潮湿的膜10min（5-15min）。增强发光。

9.9用Lumi Film或X-光底片将杂交膜进行室温曝光15-30min。(发光性能至少可持续48小时)

9.10 X-光底片的冲洗

Agfa 30显影液显影(1-5min)---冲水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水冲洗---晾干底 三、材料及试剂

总RNA样品或mRNA样品，尼龙膜

NorthernMax Kit，琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，10 X Buffer, SDS，灭菌水等。 四、仪器设备：

恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。

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实验十一 实时定量PCR

一、原理

聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

实时荧光扩增曲线图

一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。

为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT

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值（threshold value ）。

实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。 1．SYBR Green I

SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm，发射波长最大约为 520nm。在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。

SYBR Green I 在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链 DNA 相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链 DNA 熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以、区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。此外，由于一个 PCR 产物可以与多分子的染料结合，因此 SYBR Green I 的灵敏度很高。但是，由于 SYBR Green I 与所有的双链 DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响 。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量结果。 2．分子信标（molecular beacon）

分子信标是一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递（ FRET ）。由于 \黑色 \淬灭剂的存在，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。分子信标的茎环结构中，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。

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3．TaqMan 探针

TaqMan 探针是多人拥有的专利技术。 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而淬灭剂则在 3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。 TaqMan 探针适合于各种耐热的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。 4. LUX Primers

LUX (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物 3’ 端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在没有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。与 Taqman 探针和分子信标相比， LUX 引物通过二级结构实现淬灭，不需要荧光淬灭基团，也不需要设计特异的探针序列。因为 LUX 引物是一个相对较新的技术，所以其应用还有待实践的检验。 实时荧光定量 PCR技术的应用

实时荧光定量 PCR 技术是 DNA 定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对 DNA 、 RNA 样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们还可以对 PCR 产物或样品进行定性分析：例如 利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及 SNP 检测等。 目前 实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：

1. DNA 或 RNA 的绝对定量分析 。包括 病原微生物或病毒含量的检测 , 转基因动植物转基因拷贝数的检测， RNAi 基因失活率的检测等。

2. 基因表达差异分析。例如比较 经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差显结果的确证

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