分子生物实验 - 图文

实验一 少量质粒DNA的制备和琼脂糖凝胶电泳

一、实验目的

通过本实验，学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法，掌握质粒DNA制备的方法和原理,以及熟悉分子生物学实验室的一些基本仪器的使用方法。

二、实验原理

㈠质粒DNA的制备

质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物。

质粒DNA的提取可分为三个步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中，将上清液用乙醇溶液沉淀洗涤后，可得到质粒DNA。

从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。抽提过程中在加入溶液II后，碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在TE溶液中。

在实验步骤中，加入Solution I的目的主要是将细菌团块重新悬浮于缓冲溶液中（兼有破壁作用）：SolutionⅡ含有SDS及NaOH，前者可将细菌溶解，后者可将DNA变性；Solution Ⅲ是由醋酸及钾盐所形成，前者在于中和碱，后者则与DNA形成复合物而有利于DNA的沉淀。加入Solution Ⅲ后离心，大部分的蛋白质与染色体DNA会留在下面的有机层，而上层的水层所含的质体DNA可用乙醇沉淀，（亦有实验室用酚／氯仿／异戊醇[PCl]莘取以去除残留的蛋白质），再以70%乙醇洗涤以去除盐类。 ㈡凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便

快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。

DNA凝胶电泳检测原理主要有:①琼脂糖或者丙烯酰胺凝胶的分子筛作用②DNA分子结合SDS后在电场的作用下向正极移动③DNA分子的大小和形状的区别会在凝胶中区分出来，大的跑的慢，线性比环形跑的慢

三、实验仪器及药品

㈠实验仪器：

高速台式离心机、移液管、移液枪、真空干燥机、Eppendorf管、电泳槽、凝胶成像仪 ㈡实验药品：

① Solution Ⅰ：25mM Tris-HCl (pH8.0)， 10mM EDTA (pH8.0)， 50 mM glucose ② Solution Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS,4℃保存备用。

③ Solution Ⅲ：3M醋酸钾溶液（KOAc,pH5.2）,高压灭菌，4℃保存备用。 ④ 100%酒精、70%酒精 ⑤ 双蒸水 ⑥ 琼脂糖 ⑦ TAE缓冲液 ⑧ Loading buffer

⑨ LB培养液：10g tryptone ,5g teaste extract,10g NaCl in 1L

其中溶液I和溶液III分别在115℃和121℃灭菌后，存放于4℃冰箱使用。溶液II先配制母液(NaOH 2M，SDS 10％)，然后现配现用。SDS(十二烷基硫酸纳)10％母液的配制：在900mL水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。无需灭菌。因SDS微粉易扩散，称量需戴面具。称后要及时清洁称量区。

四、实验步骤

㈠质粒DNA的制备

⑴ 将过夜菌液1.5mL置于微量离心管中以6000rpm离心2min后，倒去上清液。 ⑵ 沉淀菌体加入50uL SolutionⅠ，剧烈震荡使菌体完全悬浮，置于室温5min。 ⑶ 加入100uL SolutionⅡ，盖上管盖后将管子反复上下摇动3次，不可震荡，置

于室温5min。

⑷ 加入75uL Solution Ⅲ，亦温和摇匀，置于室温5min。

⑸ 以12000rpm离心5min，小心吸取上清液至另一微量的离心管中。 ⑹ 加入2倍体积的100%酒精，混合均匀，置于室温2min。

⑺ 以12000rpm离心10min，倒掉上清液，加入70%酒精清洗一次，置于真空干燥机中10min，加入40 uL双蒸水溶解。 ㈡凝胶电泳

⑴ 琼脂糖胶置于微波炉中加热至琼脂糖完全溶化（注意！）防止突沸及胶液外 溢）。让琼脂糖在室温下冷却30min以上，待手持胶液不烫手时，倒入电泳槽内，插入梳子后使之凝结。未使用的电泳胶片可以用保鲜膜封存，或浸入1×TBE内，置于4℃冰箱内，留待下次再使用。

⑵ 限制酶反应完，加入上样缓冲液，与质粒一起进行电泳，并放入DNA marker进行比较，连接电源插头（黑色为负极，红色为正极）到电源，带负电荷的DNA分子会由负极移向正极，50vol跑胶约1h，或直至上样缓冲液染剂前端距胶底1.5cm。（注意！勿碰触高压电的电泳仪器）

五、实验结果

实验结果见下图：

在紫外灯下观察到一个DNA条带，但伴有拖尾现象。

六、实验讨论

① 琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移

速率由下列多种因素决定： ⑴DNA的分子大小： ⑵琼脂糖浓度⑶DNA分子的构象 ⑷电源电压 ⑸嵌入染料的存在⑹离子强度影响。

② 用70%的乙醇洗过以后，要待其挥发才能进行下一步的操作，以免影响下一步的操作

③ 由电泳图可以看出，质粒提取的效果不是很好，可能的原因是在取上清液时吸入了一部分蛋白杂质，影响了质粒的提取

④ 点样孔很亮的原因是杂质未清除干净，阻碍了质粒的迁移

七、注意事项

⑴ 收集菌体提取质粒前，培养基要干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。 ⑵ 在添加SolutionⅠ和Solution Ⅲ混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不要在振荡器上剧烈振荡。其中加入SolutionⅡ后，溶液变澄清，并有黏性；加入Solution Ⅲ后，出现絮状沉淀。

⑶ 加两倍体积的无水乙醇离心如果得不到质粒沉淀，可以放入-20℃ 1h 以后再离心。

⑷ 为了得到高纯度的质粒DNA，可以在乙醇沉淀之前，再用苯酚氯仿抽提一次。 ⑸ 戴手套把琼脂糖放在强UV透射光源板上，即可对结果拍照存档，尽量减少身体和胶体暴露于UV下过久，有时会使DNA产生缺口或突变。

⑹ 照相后，用刀片将此DNA切下，做DNA纯化及浓缩，用于连接反应。 ⑺ 有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次移接有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种应挑选单菌落。

实验二 质粒DNA限制酶切割和凝胶电泳

一、实验目的

学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解的操作方法，理解限制性内切酶是 DNA重组技术的关键工具。

同一质粒DNA，经不同的限制酶切割，得到不同的DNA片段，再经琼脂糖 凝胶电泳分离后，与Maker进行比较，检测质粒的正确性或切割所需DNA片段进行重组质粒DNA的构建。

二、实验原理

限制性内切酶可切割双链DNA。它可分为三类：Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶(限制酶); 另一种为独立的甲基化酶。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：5'-G↓AATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ：5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端， 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5'…G↓AATTC…3' → 5'…G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G…5' → 3'…CTTAA G…5'

DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。

在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约

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