猪细小病毒SD-68株NS1基因的克隆与序列分析

对猪细小病毒(PPV)SD-68株NS1基因进行了克隆和序列测定,结果表明SD-68株NS1基因全长1989bp,编码662个氨基酸组成的多肽。该序列与PPV SY-99株、Kresse株、NADL-2(5075)和NADL-2(4973)株的NS1基因比较,核苷酸的同源性分别为99.9%、99.9%、99.7%、98.1%,氨基酸的同源性分别为

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第 l 9卷 3期 20 0 4年 6月

中国病毒学VI ROLOGI CA I CA S NI

1 (:2 22 4 9 3) 4 .4J une 2 O04

用Vr eo细胞制备马抗狂犬病血清抗原张捷一，,叶林柏，曾莹春，阳帆，刘静 (.武汉大学生命科学院病毒研究所，湖北武汉 40 7; .武汉生物制品研究所，湖北武汉 4 0 6 ) 1 30 2 2 3 00

Fo e a i g t eAn i e fRa isI m u g o u i r l rPr p rn t n o b e m h g no l b l i Ve o Cel n n sZHA N G i’, YE n b il, ZEN G n c un l YANG n J el Li— a Yi g— h , Fa, LI Jn U i g l

r.ntue fvrlg, h nU i ri, h n4 0 7,hn; . u a s tt o boo i l rd cs W h n4 0 6, hn ) J Istt i oyWua nv syWua 3 0 2C i 2 W h nI t e f ilgc p u t u a 3 0 0 C i i o o e t a ni u a o, a

Absr c: sa ls a fe tve e on mi a d smpl e h ol g o r p rn a e r la tg n t a t To e t b ih e f ci, c o c la i n n et c n o y f rp e a i g r bi svia i e n t tC e u e o pr u e h s t—a e e u,r bi s v r s sr i s i o u ae n v r e l ha a b s d t od c or e a ir bi s s r m n n a e iu ta n wa n c l t d i e o c ls

c l r d wi e i m o t i i g % h r e s r m n s p o a ae t 9 c l r d u u t e t m d u c n a n n 1 u h 0 o s e u a d wa r p g t d wi 1 u t e me i m h 9 uc nt ni g%一3% h r e e m .Vi s o a n l i o s s r u u r we e a v se a t e if a d i h ys n d s d o r r h r e td t h f t n e g t da a u e f h h pr p rng

a tg n o e ra i n,i a tva on a d e tiu to e a i i e s by c nc nt to n n ci t i n c n rf gai n.The tt r f r bi s v r s i e ie s o a e i n t u h

c l r r ec e b v . lg D d ut eweera h dao e70 o L s mL.h oe c f t e s r ih r a . I/ . h u T e tn yo i n ehg e n 60 U mL T e p n a g we h tn i n i i l a t e s u tb ei g s a mm u i i g h r ef r r d c n a i s mm u o l b l . n sn o s o u i g r b e o p i n go u i nKe yW or:Ve o c ls Ho es r m; An i n ds r el; s r e u tge ’

摘要：以 V r eo细胞为基质制备马抗狂犬病血清用抗原，以期建立有效、经济、简便的抗原制备方法。用含 1% 0马血清营养液对 V r eo细胞作适应性培养，接种狂犬病毒，以含 1 3%~%马血清营养液作维持液培养病毒，于第 5, 8收获病毒液，经灭活、浓缩、离心等制成抗原。第 5天收获病毒滴度可稳定在 70o L。 mL以上，灭活天，8 .1g D5/抗原具良好的抗原性，用 N H法测定效价达 60U/ I . I mL以上，可用作抗原生产抗狂犬病血清。关键词： V r胞；马血清；抗原 eo细

中图分类号：￥ 5 .5 8 26

文献标识码：A

文章编号：10—1 2(0 4 0 .2 20 0 35 5 2 0 ) 30 4—3

狂犬病是一种由狂犬病毒引起的危害极为严重的人畜共患疾病，人一旦发病，死亡率为 1 0 0%。

型疫苗【,是以传代细胞为基质，脱了动物条件限 2】摆制，制备工艺稳定简化，但该疫苗生产过程中同样使用人白蛋白，不符合制备马抗狂犬病血清抗原生产要求【, j因此我们对制备用于生产马抗狂犬病血清 J的抗原的制作方法加以改进，现将以 V r eo细胞为基质制备抗狂犬病马血清抗原的研究报告如下。

目前主要通过预防接种狂犬病疫苗及联合使用高

免血清或免疫球蛋白来控制该病的发生和流行。由于人抗狂犬病特异性免疫球

蛋白远远不能满足市场需求，精制马抗狂犬病血清仍在广泛使用【。 l】我国制备马抗狂犬病血清免疫马所使用的抗原是人用狂犬病疫苗，包括羊脑固定毒抗原和地鼠。肾细胞疫苗。羊脑固定毒抗原制备繁琐复杂，受诸多动物条件限制；而地鼠。胞疫苗在其制备过程中肾细使用人白蛋白作为病毒抗原的保护剂，因此使用这种抗原免疫的马血清含有抗人白蛋白抗体。我们曾采用人白蛋白吸附的方法去除血清中的抗人白蛋白

1材料与方法11细胞 .

V r细胞来源于武汉大学生命科学院病毒研 eo究所。培养液为含 1%马血清 1 9液，用常规细胞 0 9传代方法【作适应性传代培养。 4】 1毒种 . 2狂犬病毒 a株 (鼠脑 )来源于武汉生物制 G豚品研究所。V r eo细胞适应马血清培养后，将毒种在

抗体，但这一步骤大幅度提高了抗狂犬病血清的成本。人用 V r eo细胞狂犬疫苗是近几年研制成功的新

收稿日期：20 .10,修回日期：2 0 .21 0 31-5 0 31.6作者简介：张捷 ( 9 8)女，广东省籍，在职研究生，主要从事生物制品研究。 16一， “通讯作者：C r so dn Au rT l 2—7 8 3 2 - i ib ie oma . m. o r p n ig￣o . e:0 78 6 2 7,E ma:l ay@h t ic e l n lo

对猪细小病毒(PPV)SD-68株NS1基因进行了克隆和序列测定,结果表明SD-68株NS1基因全长1989bp,编码662个氨基酸组成的多肽。该序列与PPV SY-99株、Kresse株、NADL-2(5075)和NADL-2(4973)株的NS1基因比较,核苷酸的同源性分别为99.9%、99.9%、99.7%、98.1%,氨基酸的同源性分别为

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张

捷，等.用 V r eo细胞制备马抗狂犬病血清抗原

23 4

V r胞上作适应性培育， eo细连续传代：接种病毒后， 以含 1 3%~%马血清 1 9液作维持培养。 9 1病毒滴定 . 3

毒力并连续传代，结果显示连续传 1 O代后基本适应。1 1~ 2代毒力为 4O . lg D 0 L, 1~ 1 .~55 o L s m / 3 8代毒力可达 58~75o L 0 L。 .3 . g D5 m 1/

用小鼠脑内接种法进行【。 3将病毒液做 1倍系】 O列稀释，用体重 1g 1g小鼠脑腔注射，00 mL l~ 3 .3/只，每个稀释度至少注射 4只小鼠，观察 1d 4,计算 lg D 0 o L 5 mL。/

23不同接种比例对病毒滴度的影响 .对处于对数生长期的 1 0 0 mL小方瓶 V r胞 eo细记数，般

数量为 5 6 l6按 00 0、 .0、 .l一 - x 0, . 1 00 1 00、 0

01 . MOI度接种，置 3℃培养，于不同天数收获浓 5培养液，测定病毒滴度 ( 1。表 1示，当细胞表 )显在生长对数期时，种毒比例在 00 1 01 .~ .MOI比较 0适宜。表 1感染浓度对病毒滴度的影响 Ta l T e e e b e 1 h ct0fd fe e nf c i os r he i r nti e tve d e ofviuson t

1抗原试制 . 4

将收获的病毒液进行 5 1~ O倍超滤浓缩，经 p .丙内酯灭活、离心等处理制成抗原【。 6 J 1效力测定 . 5用 NI法进行【。将抗原做 5倍连续稀释，用 H 3】 3个稀释度对 1g 1 g小鼠进行腹腔免疫，05 L 2~4 .m/只，每个稀释度 1 6只，间隔一周再免疫一次，同时做参考品稀释免疫。小鼠于第一次免疫后 1d 4,

t e f iu i r rs t o v

用预先测定每 00 mL含 5 10个 L o .3~0 D5的病毒量脑内攻击 0 3/,病毒滴定用 1 0、1一 0, . mL只 0、1一 0、1一每个稀释度做 8只，所有小鼠自攻击之日起观察1d 4,统计计算效力。

2结果21细胞在马血清培养液中适应性传代 .

24维持液中不同马血清含量的病毒滴度 .将在对数生长期的 1 0 0 mL小方瓶 V r eo细胞接

采用常规细胞传代方法，将在已适应牛血清培养液的 V r eo细胞改用 1%马血清培养液进行传代 0培养。由小牛血清培养改为马血清培养，第一、二代细胞表现出生长减缓，经适应性传代 3代以上后同牛血清培养效果基本一致，细胞生长状态良好。 细胞增殖曲线见图 1。7 0 6 0 50 40

种病毒后，分别以含 1%、3%、5%的马血清 19维 9持液 3℃培养，于不同天数收获培养液，测定病毒 5滴度 ( 2。由表 2可见，维持液中 1表 )%~3%的马

血清浓度均可获得较高的病毒滴度，血清浓度高则不利于病毒增殖。表 2不同马血清含量对病毒滴度的影响Ta e 2 T e e e to i e e ts r m m o bl h f c f d f r n e u a unton t

e tt f i o h erVl l n S

3 020 1 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8

da yS

图 1细胞增殖曲线F g 1 T emu t l ai no e l i . h l p i t f l i c o c s1 Cu t rdi 1 9me i m o t i e a f e u . l e n 9 u d u c na n c l r m, . ef s u t r i 9 d s 2 Th i t l e n1 9 r c udm e i m o t i e o s e m; . e sc n u t r 9 e i m c n d u c na n h r es r d u 3 T e o d c l e i 1 9m d u o t h ud n

25不同收获时间的病毒滴度 .病毒感染 V r胞后， 7 h开始于不同时间 eo细于 2取样收获病毒培养液，测定其病毒滴度，同时用含人白蛋白的维持液作对照 ( 3。由表 3可见，用表 )马血清组病毒接种 4 h后病毒滴度即可达到 8 55o L 5 mL,第 5 8天达高峰，以后滴度下降， . g D0 1/~ 但到第 2天病毒仍可维持复制；用传统方法白蛋 O白组病毒情况类似，到第 2天病毒亦可维持，但 O整体病毒滴度略低于马血清培养。

an o e s r m:4 h e t id c l r n 9 d i i o ti e o e ie h r e d s u .T h r u t e i l 9 me u n c n an ud d hr sser m . u

22病毒株在 V r . eo细胞上适应性培育将用 1%马血清培养、已长成单层的细胞接种 0狂犬病毒 a株 (鼠脑 ) G豚，接种后 5 l~1 d取样测

对猪细小病毒(PPV)SD-68株NS1基因进行了克隆和序列测定,结果表明SD-68株NS1基因全长1989bp,编码662个氨基酸组成的多肽。该序列与PPV SY-99株、Kresse株、NADL-2(5075)和NADL-2(4973)株的NS1基因比较,核苷酸的同源性分别为99.9%、99.9%、99.7%、98.1%,氨基酸的同源性分别为

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第 1 9卷

表 3不同收获时间的病毒滴度Ta e3 ViusLt sby dif r nth r s a bl r i er fe e a ve td ysTp s f yc oCu t r lu e2 4 d d lc l n di m l Ho s n 5 5 6.3 7 5 reⅡn _ 8 . 7 1 7. 6 8 6 5 .7 0 .3 . 65 . 5. 5. 7 5 1 5. 0 5 d 6 d 7 d 8 d 9 d I d 1 d l 4 ld 7 2 od

于目前普遍使用的人用 V r胞疫苗，且制备成 eo细而本大

大降低。 本次试验表明，V r胞能较快适应马血清， eo细 仅连续传代 3代次，其生长状况同小牛血清培养就基本一致。、

' e o v u 1g D Ut f i s( 1 r r o.

)

Al umi b n

5 5 _

65 .

70 .

7. 0

7. 6 1 6 0 0 .7 . 5. 5

4. 5

4. 0

4. 5

为了获得高滴度的病毒，我们对毒种 a株预 G

先作了适应性培育。毒种用含马血清的 V r胞将 eo细26抗原制备 .

连续传 1代， 8病毒滴度稳定在 70o L 0 . g D5mL左右。 1/ 在细胞生长对数期以 00 1 .MOI .0~01接种病毒，用含 1%~3%马血清维持液培养， 1第 1天时病毒滴度仍能达到 65o L 0 . g D5 mL;试验表明病毒增殖高峰 1/为 5 d~8,病毒复制可持续 2 d以上，同牛血清培 0养类似口。我们试制了 3批抗原，于种毒的第 5】 天、第 8天 2次收获病毒液进行浓缩、灭活、离心等处理，经检测效力均在 60 U, .I mL以上。 实验结果表明，用改进后的技术制备用于免疫马生产马抗血清的狂犬病毒抗原，不含人白蛋白， 在生产周期、产量和质量及成本等方面与采用牛血清培养技术基本相同，但用这种技术生产的抗原制

用 2克氏瓶培养 V r胞，接种病毒制备 3 L eo细 批抗原。所用毒种毒力为 75o L 5 mL,接毒浓 .1g D 0/度为 00 MOI .1,于第 5天、 8天收获两次病毒液，第 测定收获液毒力均大于 65o L 0 .1g D5 mL;经浓缩、/ 灭活、离心等处理制成成品抗原。用 NI法测定抗 H原效价，3批抗原效价均达 60U mL以上 ( 4。 ./ I表 )表 4抗原效力检定结果Ta l b e4 Th otnc ntb e p e y ofa i ody

备马抗狂犬病免疫球蛋白可省略去除抗人白蛋白抗体步骤，大大降低成本和提高收获率。因此本改进的技术具有实用意义和推广价值。

3讨论目前国内用于制备精制马抗狂犬病血清的抗原为人用狂犬病疫苗，包括地鼠肾细胞疫苗和 V r eo

参考文献[】俞永新 .狂犬病和狂

犬病疫苗[ .北京：中国医药科技出版社， 1 M】2 o1 0 .

细胞疫苗等。地鼠肾细胞疫苗的生产受动物来源、 检疫、养殖等多方面条件限制，疫苗质量和稳定性均难以得到保证，因此不是理想的制备抗血清用的免疫抗原。V r eo细胞狂犬病疫苗是一种传代细胞疫

[】俞永新 .我国狂犬病细胞疫苗的发展和存在问题[ .中国生物制 2 J】品学杂志，2 0, 1 ( ) 3 83 0 0 2 5 6: 7—8 .

[】中国生物制品标准化委员会 .中国生物制品规程 2 0[】 3 00版 M .北京：化工工业出版社，2 0 . 0 0

苗，细胞来源和生产工艺均稳定可控，是目前国内比较理想的免疫抗原。 本文研究的是一种新型的马抗狂犬病血清的免疫抗原，与传统的 V r胞疫苗相比，原成分 eo细抗中不含人白蛋白等人体成分，免疫马匹后不会产生抗人白蛋白抗体。统的 V r胞疫苗在培养细胞传 eo细中采用小牛血清，接种病毒后换用人白蛋白维持， 这种营养液成分的变化对细胞和病毒培养均会产生一定的影响。我们将 V r胞和狂犬病毒 a eo细 G株

[】鄂 4

征.组织培养和分子细胞学技术[ .京：京出版社，94 M】北北 19 .铠 .医学生物制品学[ .北京：人民卫生 M】

[】卢锦汉，章以浩，赵 5出版社，1 9 . 95

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[】李宏玲，李河民，俞永新，等 .狂犬病毒在 V r胞上的传代适 7 eo细应[ .生物制品学杂志，18,2 ( ) 2 J】 99 2:2 . [】李淑兰，张 8莹，杨兵，等 .狂犬病病毒地鼠’肾细胞适应株的

均用含马血清的营养液进行驯化，使之适宜在含马血清的营养液中培养和繁殖，进一步提高了疫苗的质量和稳定性，用马血清培养得到

的新型抗原符合《国生物制品规程》2 0中 0 0年版要求，不仅质量优

选育[ .中国生物制品学杂志，19,1 ( ) 0 . J】 9 7 0 4:2 4 [】高鸿瑞，魏至栋，单秀琴，等 .狂犬病病毒 V r胞适应株的建 9 e o细立及其应用于疫苗生产的可行性探讨[ .微生物学免疫学进展， J】1 9, 2 ( ) 1 9. 9 5 3 3: 2

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