氧化苦参碱预防肝纤维化的实验研究

肝纤维化的系列论文,包括肝纤维化的诊断、病例报告、新理论、新疗法、新药物、中医中药等方面的研究进展,以及与此相关的系列研究经验等等。

肝胜 2002年 9月第 7卷第 3期

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论

著

氧化苦参碱预防肝纤维化的实验研究杨文卓【摘要】目的

曾民德

陆伦根

茅益民范竹萍

曹爱萍

宋育林

贾一韬建立半乳糖胺和二甲基亚硝

观察氧化苦参碱预防大鼠肝纤维化的疗效并探讨其作用机制。方法

胺大鼠肝纤维化模型，观察氧化苦参碱(30mg/ kg, 90m kg)预防前后肝指数、 g/血及肝组织生化、经脯氨酸含量, TGF邵- RNA表达、电镜及病理组织学改变。结果氧化苦参碱预防组较模型组肝功能改善、肝组织经脯氨酸含量及 T GF01表达水平降低( P< 0.0 1);预防组肝组织内S OD, GST-PX较模型组升高， MDA低于模型组;电镜显示肝细胞损伤减而轻，病理组织学明显改善。结论氧化苦参碱对半乳糖胺及二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化均有预防作用，主要机制为其抗脂质过氧化、肝细胞和抑制肝星状细胞活化，保护从而抑制纤维生成等【关艘词」氧化苦参碱;肝纤维化;半乳糖胺;二甲基亚硝胺;大鼠 Experimental study on oxvmatr ine in pr vention of liver fibros is e YANG Wenzhna, 7 ENG Minde, LU Lungen, et al .

Shanghai Second Medical U y t s r e v i n Renji Hospital, S ha nghai Institute oJ ' Diges tive Dis e, Sha nghai 20000 1 eas[ Abstract] Objective To inves tigate the preven tive effect of oxymatrine( OM ) on experimental liver fibros is and its mechanism. Methods In the process of establishing rat liver fibr sis induced by D-galactosamine ( a Gal ) and dimethylnio trosamme (DMN ), we obser ed t he effects of oxymatrine on the following parameters: liver/ weight index, serum and tis sue v biochemical indexes, TG F(3I - RN A liver hydr xyprohne express ion content, electr n micros c pic ch anges and tissue path logy o o o o Results Serum AST, ALT and liver h ydroxyproline content declined in oxymatr ine group as compared with those of the D-Gal or D MN group ( P< 00 1) . Liver SOD . G ST- PX wer e higher in O M inter entional gr up than in the model gr up, w hile MDA v o o was reduced. RT- PCR revealed that TGF Pl mRNA expression was reduced in O M group more than that in th e mod el group . Electronmicroscopy s howed that O M groups had less hepatocytic damage and less fibr ils than that in the model group. Light micr scopy revealed wider septa fr m portal to central region, more piecemeal and confluent necros is and pres udo-lobule formation o o in the model gr up, w hile in the OM gr up such lesions were much less . Conclusions Oxymatrine shows prophylactic effect on o o D-Gal and DMN induced rat liver fibrosis, pr bably throug h its anti- lipoperoxidation and hepatocyte protection effect, and sup o pressing the activation of hepatic stellate cells[ Key words] Oxymatrine; Liver fibr sis; D-galactosamine; Dimethylnitros amme; Rat o

月前认为肝硬化是不可逆

的，尚无有效的治疗手段，而肝纤维化尚存在可逆性，因而如何在肝纤维化阶段或肝损伤更早阶段阻断疾病的进程成为肝病研究工作者的重要研究课题。氧化苦参碱 (Oxymat rine, OM )是从中药苦豆子中提取的成分，是苦参碱的 N-氧化物。既往研究表明，该药有抗炎、平喘、降酶退黄、免疫调节和抗肿瘤等

效果及机制。材料与方法一、料材

(一)药物公司提供。 (二)动物物中心

OM,由上海绿谷伟业生态 L程有限 .雄性 Wist ar大鼠，购于中科院实验动

作用!1.2近年的 1研究又表明氧化苦参碱有抗乙型肝炎和丙型肝炎病毒的作用，并有抑制胶原活动度，防止

肝纤维化的作用[31。本文通过半乳搪胺及二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化模型研究 OM预防肝纤维化的

(三)试剂超氧化物歧化酶( SOD )、谷胧甘肤过氧化物酶(GST -PX)、丙二醛W DA )、轻脯氨酸试剂盒为南京建成生物制品公司产品; T rizol为 Gibco公司产

品;逆转录酶为Promega公司产品;引物由上海生工生作者单位:200001上海第二医科大学附属仁济医院〔杨文卓、曾民德、伦根、陆茅益民、范竹萍、爱萍、育林 );第二军医大学附属长曹宋海 Irs院(贾-韬) i

物制品公司合成。二、法 (一)实验处理

肝纤维化的系列论文,包括肝纤维化的诊断、病例报告、新理论、新疗法、新药物、中医中药等方面的研究进展,以及与此相关的系列研究经验等等。

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Chinese Hepaialngy,Sep. 2002,V 7,No.3 ol

1. OM预防半乳糖胺诱导的肝纤维化

模型复

制参照J onkc:方法略加改进。雄性 Wista:大鼠54 to〕只， 170一体重 200g,分为:正常组( n= 8)、 (模型组(。二10 ), OM预防组 ( n - 20,中低、其高剂量各 1只) 0和 OM对照组( n二16,其中低、高剂量各 8只)。模型

结

果

一、一般状态、肝指数(肝重/体重)、重和脾/体脾比的变化

(一)一般状态正常对照组一般状态良好;模型组活动少，体重增加减少，皮毛欠光滑，尿色黄，有腹泻。OM预防组一般状态明显好于模型组。 (二)肝脂数、脾重和脾月本比 1_半乳搪胺模型 OM预防组肝指数 (低、高剂量分别为3 .42%、 3.43% )及脾肺比(0. 23%,0 .20%)显著低于模型组 (4 .62%, 0. 35%, P< 0.01),剂量两组间差异无显著性。OM对照组与正常对照组差异亦无显著性 (P> 0. 05 )0 2.二甲基亚硝胺模型预防组肝指数(低、高剂量分别为3.26%、 3.27% )与模型组(3. 31%)差异无显著性(P> 0 .05);预防组脾重 (低、高剂量分别为0. 66

组及预防组以500mg/kg腹腔注射半乳糖胺生理盐水溶液，日 1次， 1周;预防组及 O M对照组每日肌隔共 2

肉注射 OM 30mg/kg, 90mg/kg。正常对照组每周 3次腹腔注射生理盐水，日肌注生理盐水。造模过程每

中模型组死亡 2只。于 12周末下腔静脉采血后处死动物，剪下完整肝脾组织标本，称重后取部分右叶肝脏以 4%中性甲醛固定，内石蜡包埋，病理检测;部 3d备分肝脏修剪成 5mm x 3mm x 2mm大小， .5%的戊以2二醛固定， 0冰箱保存， 4 C备透射电镜检测;将余下肝脏于液氮中速冻，一70 0 C冰箱内保存，备肝组织匀浆测组织生化、抽提组织 RNA。血清于一7少C冰箱内保存备肝功能检测。 2. OM预防二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化

g,0 .64酌及体比(0. 28%, 0. 27%)显脾/著低于模型组(0 .92g,0. 45%, P< 0 .0001),二、肝功能指标 (一)半乳糖胺模型 OM预防组 ALT, AST,

模型建立参照相关文献[51。雄性 Wistai大鼠 38只，体重15。 210g,正常组伽 - 8 ),模型组(二一分为=1 )和 OM预防组 ( n= 20、中低、 0其高剂量各 10只)。其中模型组及治疗组每周连续 3d腹腔注射二甲基亚

GGT, A LP, T BiL和 DB均显著低于模型组 ( P< 0. 01),0 M对照组肝功能与正常对照组差异无显著性

硝胺 10mg/kg, 3周，组造模同共预防时每日肌注 OM (30mg/ kg,90mg/kg),共用药4周。正常对照组每周连续 3d腹腔注射生理盐水， 3周，共同时每日肌注生理盐水共 4周。4周末处死动物，留取血及肝组织标本，同前方法 (二)血清肝功能测定操作

(二)二甲基亚硝胺模型

OM两剂量预防组

ALT,GGT, AK P,A/ G, TBiL和 DB均显著低于模型组(P< 0 .001);高剂量组 ALB显著低于模型组 (P<0 . 00 1 )

采用全自动化仪测定。

三、氧化抗氧化指标 (一 )半乳糖胺模型预防组 SOD (136. 24士10 .2 4, 149 .8 1士 15 . 28 )、C S T-P X ( 4 5 .2 3士 5 .0 7,

SOD, GST -PX, MDA及经脯氨酸测定按照试剂盒说明

(三) RT-PCR检测肝组织TGF俘 mRNA的表达 1 Triwl抽提组织 RNA,进行RT-PCR扩增。TGF叩引物序列:上游: 5' 00 0GGCGACCT GGGCACCAT C CAT GAC3';下游: 5' C丁 GCI' CCACCT T GGGCT T -

52 .45士 43 )显著高于模型组(95. 22土16. 33, 32. 42 6.士4 . 20, P< 0 .0 1 ), M D A ( 2 . 27士0 .2 1、 .0 6士而 2

0. 1 )较模型组 (4 .57土0 .37)显著减低 ( P< 0. 01 )。 7高剂量组效果好于低剂量组，但两者差异无统计学意_义

GCGACCCAC3'。以昆 actin为内对照，物序列为:其引5' GAT GGT GGGT AT GGGT CAGAAGGA3'; 5' GCT CA T T GC CG A I' AG T (-,AT G A CC T3 ' o

(二 )二甲基亚硝胺模型预防组 SOD,GST -PX显著高于模型组 (P< 0 .01), M DA较模型组显著减而低( P< 0 .01),且高剂量组效果好于低剂量组，但两者差异无统计学意义。四,经脯氨酸含量测定

(四)形态学观察透射电镜标本按常规方法进行。病理行

苏木精伊红及 Masson染色，并按照改良

K nodell HAI评分标准f6]进行纤维化程度计分三、计统

计量资料以 s士;表示，统计分析采用 SAS软件

(一)半乳搪胺模型预防组轻脯氨酸含量(rig/ mg)低、高剂量组分别为( 0. 58士0. 10 )和(0 . 50士0. 11),较模型组 (0. 99士 . 14)显著减低 (P< 0. 01). 0 (二 )二甲基亚硝胺模型预防组经脯氨酸含量

包 glm程序进行差分组间析，两两比较采用Dunnctt程度进行，< 0. 05为有统计学差异。 P

肝纤维化的系列论文,包括肝纤维化的诊断、病例报告、新理论、新疗法、新药物、中医中药等方面的研究进展,以及与此相关的系列研究经验等等。

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g a t (/- K高剂量组分别为(0 .68士 08 )和(0. 58士 )低、 0.0.1 ), 2显著低于模型组( 1. 09士0. 12, P< 0. 01),高且剂量组低于低剂量组，但两者无统计学意义。五、态学检测形(一 )电镜

我们的研究表明，对半乳搪胺及二甲基亚硝 OM胺诱导的肝纤维化具有明显的预防作用。电镜、病理组织学、能检测均提示 OM可减轻肝细胞的变性肝功和坏死，改善肝细胞功能，井表现为 OM预防组肝细胞形态基本正常，粒体膜完整，线基质密度及体积大小与正常组无明显差异，肝小叶内肝细胞多数仍呈放射状排列，氨酶及胆红素较模型组显著降低 (尸<转 0 .01)形态学检测还发现 OM预防组汇管区肝星状细胞数量减少，原沉积较模型组明显减少。模JO组胶 Mas on染色可见纤维间隔增宽、多，增多数小叶存在 P-P,P-C间隔， OM预防组纤维问隔细，而数量明显减少。这与检测肝组织匀浆轻脯氨酸含量的结果相一致，说明 OM可抑制胶原的生成和沉积。a-SMA是肝

1.半乳糖胺模型

模型组胆小管明显增生，肝细

胞线粒体数量增多、,肿胀部分外膜破裂和蜻断裂;滑面内质网增生，粗面内质网脱颗粒;汇管区大量肝星状细胞增生，伴多量胶原沉积;Disse间隙变小，库普弗细胞活跃，可见吞噬小体。OM预防组肝细胞形态基本正常，线粒体无明显改变;汇管区仅见少量胶原 2.二甲基亚硝胺模型模型组肝细胞变性明显，表现为体积增大、沉积、体肿胀，脂肪线粒部分外膜破裂和崎断裂;汇管区大量肝星状细胞增生，多量胶原伴沉积。OM预防组肝细胞形态基本正常，见糖原沉偶积，线粒体无明显改变;汇管区仅见少量胶原。 (二)病理组织学 1_半乳糖胺模型苏木精一伊红染色显示模型组肝小叶结构紊乱、胞肿胀、肝细汇管区增大、纤维隔增宽和胆小管明显增生;Masson染色见多数小叶有 P-P, P-C间隔形成，不完全分割小叶;O M预防组肝细胞变性轻，小叶仍呈放射状分布，多数汇管区纤维隔纤细

,数量明显减少，见 P-P间隔。根据改良的 Knodell仅偶 HA I分期(纤维化 )积分标准，型组、模低剂量预防组

星状细胞活化的标志物， TG印1是而最强的促纤维生成因子。RT-PCR检测提示 OM预防组‘ 3, aI 'GF( lSMA mRNA的表达较模型组显著减少 (P G 0. 01),说明其对胶原合成的抑制作用可能与其抑制肝星状细胞

分泌TG 31有关， F(但这一作用产生的关键是抑制 r肝星状细胞的活化。氧化应激及脂质过氧化是引起肝细胞损伤与肝星

状细胞活化的重要机制1本研究通过检测肝组织 71匀浆中 SOD, CST -PX, MDA含量发现 . OM干预组的 SOD及 GST -PX较模型组显著升高， MDA显著降而低，说明 OM有降低自由基生成，减轻脂质过氧化的作用。其保护肝细胞、制肝星状细胞合成和分泌细抑

和高剂量预防组积分分别为4. 5士 .93,1. 7士 82和。 0.1. 21 0 .42,预防组与模型组间差异有显著性 ( P<0 . 00 0 1 ),

胞外基质及，. FRI等促纤维形成因子的作用，可能即是抗脂质过氧化的结果参考文献

2.二甲基亚硝胺模'1 4苏木精一染色显示模伊红型组肝细胞肿胀，有点状坏死，肝小叶结构紊乱，汇管区增大，隔增宽，纤维向小叶内延伸; Masson染色见多数小叶有 P-P IP-C间隔形成，不完全分割小叶; OM预防组肝细胞病变较模型组轻，部分小叶仍呈放射状分布，汇管区纤维隔纤细，数量明显减少。根据改良的

朱莉，晶晶 .钱富荣，苦参总碱对小鼠脾细胞产生+扰素的影刘等响上海第二医科大学学报, 1998, 18: 204-206张燕军，夏天，赵建斌 .等苦参碱对 SSM C 772】细胞系的诱导分化作用第四军医大学学报, 1998, 19: 34ti -343甘乐文，十国俊，李玉莉，氧化苦参喊对大鼠肝纤维化的影响第等二军医大学学报， 1999 .20: 445-448. k .,nke r AM, Dij khui, F, Hardm k MJ, et a l. Irrtmunohistochemical a c ndy of hepat ic f b- i induced in ra t a by - hi l l, galact ommine injee J, et a l ( ene - 1 i on of type

Knodell HAI分期(纤维化)积分标准，模型组织分为4. 5士 .85, 0低剂量预防组的积分为1. 8士0. 63,高剂量预防组的积分为1. 3土 . 48. SAS统计分析表明预防 0组与模型组间差异有显著性 ( P< 0 .0001)。两剂量组间差异无显著性(P> 0 .05 )六、肝组织 T GF(31,a-SMA mRNA的表达

dons. Hepao logy, 1994, 1二 9 775-781 Alakokko L, Pila ianiemi l ' . M, 1, and N coll age n in hepat ic fibrosis induced by di ethylnarosa mine田 m the rat . Bioche m J, 1987, 224: 75 Brunt E M . Grading and s taging t he hist opat hological les ion, of chronic hepa ti ti s; the Knodel l hisudogya ct ivi ty i ndex and be yond. Hepa to

l ogy,2 00 0 . 3 1:2 4 1- 24 6

模型组TGF( a-SMA mRNA的表达 3I,均显著高于正常对照组及 OM预防组， OM对照组的表达与正而常对照组无差异讨论

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/nos4.html