大黄鱼_Pseudosciaenacroc_省略_热激蛋白的基因克隆_原核表达及

大黄鱼 热激蛋白的相关研究

第37卷　第4期

2006年7月

海　洋　与　湖　沼

OCEANOLOGIAETLIMNOLOGIASINICA

Vol137,No14July,2006

大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)热激蛋白的

3

基因克隆、原核表达及抗血清的制备

张祖兴　李明云　陈　炯　邬　勇

(宁波大学生命科学与生物工程学院　宁波　315211) (浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所　杭州　310021)

1)

提要　　应用trizol裂解法提取象山港网箱养殖大黄鱼肝脏总RNA,采用RT2PCR获得大黄

鱼cDNA;通过设计特异引物进行PCR扩增,将PCR产物转化到质粒并直接测序,得到117kb的目的基因;同时将此目的基因连接到表达质粒pSBET中,在大肠杆菌BL21中进行诱导表达以及表达产物的分析。克隆基因的表达产物经SDS2PAGE分析表明,为60kDa左右,与阅读框的编码大小一致;。Westernblotting检测结果表明,制备的抗血清与HSP基因的系统进化分析表明,大黄鱼与非洲爪蟾最为接近的亲源关系。通过大黄鱼,、筛选和克隆出。关键词,,原核表达,抗血清中图分类号S432.1

热激蛋白(HSP)是指生物细胞在应激原特别是高温环境下诱导生成的一类蛋白质(Geth2ing,1997)。HSP具有高度的保守性,种类很多,

下生物体热激反应能力变化情况、生物体热耐受温度范围以及高渗透压下机体内热激蛋白的变化情况和功能等(孙旭彤等,2002);另一个热点就是高渗透压下热激蛋白的变化情况,Bruemmer2Smith等(2001)和Dubeau等(1998)的研究都显示鲑鱼体内的HSP含量增加可以提高其抗高渗的能力;而Ramesh等(2001)的实验结果则表明,在高渗环境下,鲑鱼HSP呈组织特异性表达,直接与环境接触的鳃组织比起内部组织来说热激反应更快、更直接。目前,关于海洋生物中热激蛋白的功能尚不完全了解,但多数研究认为,热激蛋白的诱导合成与海洋生物耐热性及耐盐性的获得有平行关系(Rameshetal,2001;Susanet

al,2006)。

一般来说,植物中以低分子量HSP为主,高分子量HSP主要出现在哺乳动物中(邢成,1998)。HSP的生物功能是多样化的,可增强细胞对逆境

的耐受能力和恢复能力,充当分子伴侣(Adrienneetal,2002)。由于热激蛋白在生物体耐热性方面的作用,许多学者试图找到环境温度与热激蛋白表达之间的联系(Carpenteretal,2000;Steinmann

etal,1996)。Tomanek等(1999)的研究发现,生

活在不同地区的同一家族生物的热激蛋白的调解温度域是不同的。近来的研究还表明

,HSP还与生物的正常发育、细胞内的信号传导和育性转化有关(Prattetal,1997,1998)。海洋生物中热激蛋白的研究近年来主要是关于恒定低温环境

大黄鱼(Pseudosciaenacrocea),俗称黄鱼、黄花鱼等,隶属于脊索动物门、脊椎动物亚门、硬骨

)项目,2002AA603021号;宁波市重大招标项目,2004C100040号。张祖兴,硕“863”　　3国家高技术研究发展计划(

士,E2mail:zhangzuxing2@

1)通讯作者:李明云,教授,E2mail:limingyun@

收稿日期:2005201226,收修改稿日期:2005207228

大黄鱼 热激蛋白的相关研究

　338海　　洋　　与　　湖　　沼37卷

鱼纲、鲈形目、鲈形亚目、石首鱼科、黄鱼属,是福建、浙江两省的主要经济和养殖鱼类。有关大黄鱼的研究,各种群的遗传背景和遗传多样性都有许多研究报道(李明云等,2003;王　军等,2001),但有关大黄鱼功能基因的国内外研究较少,迄今尚未发现有大黄鱼HSP基因的报道。近年来,大黄鱼养殖的产量和品质都有下降的现象,其中,逆境因子是造成产量和品质下降的重要原因,这里面就包括温度和盐度。本实验通过对大黄鱼HSP的基因克隆、原核表达及抗血清制备的研究,为下一步的大黄鱼耐热、耐盐研究奠定基础,这不仅在学术上有重要意义,还将对大黄鱼养殖发展起促进作用。

PCR产物连接进pGem2T,将重组质粒转化E.coli菌株(TG1),转化好的TG1菌株涂布于含有X2gal/IPTG的LB平板,蓝白斑进行筛选。目的质粒经PCR鉴定后进行测序。序列分析采用GCG软件包。114　原核表达载体的构建及诱导表达

含HSP基因的T载体和原核表达载体pSBET经纯化后,分别用NdeⅠ和BamHⅠ进行

双酶切;两种酶切产物经切胶纯化后,应用T4DNA连接酶重新连接以获得有HSP基因插入

片断的重组pSBET质粒,将此重组质粒转化大肠杆菌BL21菌株;此BL21菌液经终浓度为014mmol/L的IPTG诱导6h后,SDS2PAGE检测,考马斯亮蓝G2250染色检测蛋白表达情况。115　非融和蛋白的纯化及抗血清制备

1　材料与方法

111　材料

SDS2PAGE.KCl溶液中2—PBS溶液中透析24h,获得纯化蛋白,所有操作均在4℃进行。用生理盐水将纯化的蛋白配成注射液,每隔7天腹腔注射免疫白鼠1次,

μg,第三次免疫共3次,每次蛋白注射量约为200

后7—10天采血(采血前一天停止进食),4℃过夜后低速离心取上清。116　Westernblotting检测

实验用大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)样本取自宁波象山港海湾种苗繁育公司,活体运回实验室解剖,取肝脏和肌肉,超低温-70℃用,采样过程中所用的离器DEPC大肠杆菌(coli菌株、表达菌株BL21、表达载体pS均由浙江省农业科学院真菌传植物病毒室提供。克隆载体pGEM2T购自Promega公司。

112　大黄鱼总RNA抽提和RT2PCR

总RNA抽提采用RneasyanimalMiniKit(QIAGEN公司),方法略加修改:其间等体积的酚/氯仿抽提蛋白质两次,等体积的LiCl沉淀4h;甲醛变性电泳检测总RNA抽提质量。以总RNA为模板,M42T(5′2GTTTTCCCAGTCACGAC(T)1523′为起始引物,M2MLV逆转录酶逆转录合成第一链cDNA。根据表达载体pSBET阅读框架和已报道的HSP基因序列(EMB登录号:AJ292230)设计特异性表达引物HSP(+)(5′2CCATAT2

)和HSP(2)(5′GAACGACCCCACGAAC23′2CG2

),以经GATCCTTAGAATGTTATCATTGGGGG23′

逆转录合成的cDNA第一链作为扩增模板进行PCR扩增,反应程序为:94℃预变性2min,30个循环扩增(94℃30s,56℃30s,72℃1min),72℃延伸反应10min,4℃保存。113　PCR产物切胶纯化、T2A克隆及序列分析

PCR产物应用1%的低熔点琼脂糖凝胶电泳

样品用新制备的抗血清做Westerbblotting检测,其中一抗稀释500倍,二抗稀释10000倍,二

抗为碱性磷酸酶标样抗兔抗体,NBT/BCIP显色。

2　结果与分析

211　总RNA的抽提和PCR扩增

从图1可以看出,三种器官组织中,肝脏的总RNA抽提质量最好,脑次之,肌肉最差。在三种组织中,28S的含量最高,18S略少,5S含量最少。通过特异性引物对大黄鱼基因进行PCR扩增,扩增产物通过1%Agarose凝胶电泳得到单一、明亮的1.7kb的条带(图2)。测序结果经BLAST检验,与NCBI收录的HSP基因片断同源性

较高,可初步认定扩增得到的条带是HSP基因。212　大黄鱼HSP基因同源性分析

大黄鱼热激蛋白(HSP)cDNA全长2488bp,其中34—1663bp为编码序列,氨基酸序列长度为543。氨基酸序列与其他HSP序列相比都有较高的同源性。采用DNADIST和NEIGHBOR分析方法,对大黄鱼HSP和其他19种HSP

编码的多聚

检测,紫外灯下将观察到的目的条带切下,直接纯化;应用T4DNA连接酶和pGEM2T,将纯化好的

大黄鱼 热激蛋白的相关研究

4期张祖兴等:大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)

热激蛋白的基因克隆、原核表达及抗血清的制备339　

清,在膜上进行的免疫反应,与间接ELISA类似,

固定在蛋白质条带能特异性地结合相应的抗体,结合的抗体可用酶联第二抗体及底物进行显色。从图4中可以看出,在泳道2的HSP蛋白与抗体特异性结合形成了一条比较明显的条带,而作为对照的菌体蛋白没有条带出现。说明制备抗血清能与纯化的HSP蛋白起较强的特异性反应。

图1　大黄鱼总RNA抽提

Fig.1　TotalRNAextractionofP.crocea

1:肌肉;2:脑;3:

肝脏

图3　各种HSP编码的多聚蛋白全长核

苷酸序列系统进化树分析

Fig.3　PhylogeneticanalysisofthecompletepolyproteinnucleotidesequencesofHSPusingDNADISTandNEI

GHBOR

图2　大黄鱼HSP基因PCR扩增产物凝胶电泳图

Fig.2　AgarosegelelectrophoresisofHSPgenePCRproductsofP.croceaM:1kb的DNA的标准分子对照;

1:HSPPCR扩增产物

蛋白全长核苷酸序列进行系统进化树分析。分

叉上的数值表示100次成树中该簇出现的次数,仅数值>70的显示。标尺表明每个碱基发生0.1次交换。具体结果见图3。

213　HSP原核表达和WesternBlot检测分析

结果

在IPTG的诱导下,构建的表达载体pSBET在BL21菌株中大量表达;表达产物进行SDS2PAGE分析,结果表明:HSP表达产物的分子量为60kDa左右,与用生物信息学方法对HSP蛋白进行预测得到的结果非常吻合。制备HSP的抗血

图4　大黄鱼HSP蛋白抗血清的Westernblot分析

Fig.4　Westernblotanalysisoftheantiserumto

HSPfromP.crocea

M:SDS2PAGE低分子量标准蛋白质,1:BL21菌株蛋白,2:HSP

蛋白

大黄鱼 热激蛋白的相关研究

　340海　　洋　　与　　湖　　沼

523—526

37卷

3　讨论

HSP相似蛋白的全长氨基酸序列系统进化

AdrienneN,BooneM,VijayanMetal,2002.Constitutive

heatshockprotein70(HSC70)expressioninrainbowtrouthepatocytes:parativeBiochemistryandPhysiologyPartC:Toxicology&Pharmacology,17(2):223—233Bruemmer2SmithS,StuberF,SchroederS,2001.Protective

functionsofintracellularheat2shockprotein(HSP)702expressioninpatientswithseverespecies.IntensiveCareMed,4(27):1835—1848

CarpenterC,HofmannG,2000.Expressionof70kDaheat

shockproteinsinAntarcticandNewZealandnotothe2nioidfish.BiochemPhysiolPartA,125:229—238DubeauS,HirokoS,MarkEetal,1998.Thermalshockof

salmoninvivoinducestheheatshockproteinhsp70andconfersprotectionagainstosshock.Aquaculture,168:—323

M,.toChaperonesand

.Oxford,NewYork:OxfordPress,20—21

,AdesS,1998.Thehsp902basedchaperonesystem:

involvementinsignaltransductionfromavarietyofhor2moneandgrowthfactorreceptors.ProcSocExpBiolMed,217:420—434

PrattW,VandenbulckeF,IlyinGetal,1997.Theroleofthe

hsp902basedchaperonesysteminsignaltransductionbynuclearreceptorsandreceptorssignalingviaMAPkinase.AnnRevPharmacolToxicol,13(37):297—326RameshS,TraceyC,MathilakathM,2001.Cortisolmodulates

parativeBiochemistryandPhysiologyPartB:BiochemistryandMolecularBiology,5(2):679—685

SteinmannL,BornmanL,1996.Acclimatization,precondition2

ingandheatshockproteins.MedicalHypotheses,4(4):257—260

SusanG,LundM,HofmannGetal,2006.Turningupthe

heat:Theeffectsofthermalacclimationonthekineticsofhsp70geneexpressionintheeurythermalgoby,parativeBiochemistryandPhysiolo2

树分析表明,不同物种编码的HSP存在一些明显相关的群体(Bruemmer2Smithetal,2001),如不同酵母编码的HSP在进化上紧密相关,形成一个显著群体,高等植物编码的HSP在进化上也紧密相关,形成一个显著群体;高等动物编码的HSP在进化上也紧密相关,形成一个显著群体,并且在这些群体中,物种亲缘关系高的其编码的HSP进化相关性也高(Carpenteretal,2000)。大黄鱼编码的HSP蛋白位于高等动物群体中,该群体中,大鼠、小鼠、中国地鼠和人组成了一个进化高度相关群体,非洲爪蟾和热带爪蟾与其关系略远,大黄鱼与该群体远缘相关,并且高等动物群体与低等动物果蝇和家蚕形成的小群体位于同一大的进化分支上,这与这些动物物种间的亲缘关系吻合,也印证了脊椎动物中两栖纲动物与鱼纲动物的亲源关系。

搞清楚大黄鱼的遗传背景基因研究工作中;本文中作者所研究的HSPcDNA序列,而且成功构建了原核表达载体,可以在IPTG的诱导下大量表达HSP蛋白,同时制备出专一性好的抗血清,为大黄鱼HSP功能研究和其他后续研究打下深厚基础。HSP蛋白生理功能多样化,与鱼类的发育和各种逆境胁迫都有联系(孙旭彤等,2002;Carpenteretal,2000);作者制备的抗血清就可以有效运用于各种胁迫下或各个发育阶段中大黄鱼所表达的HSP蛋白检测。总之,本实验对大黄鱼HSP基因提取分析和抗血清制备,可为今后制备出核酸探针、筛选和克隆出一批具有优良性状的基因,构建基因文库等研究工作奠定基础,以促进大黄鱼养殖业的健康快速发展。

参　考　文　献

王　军,全成干,苏永全等,2001.官井洋大黄鱼遗传多样

性的RAPD分析.海洋学报,23(3):87—91邢　成,1998.热休克蛋白的产生、分布及功能.生物化学

与生物物理进展,15(6):406—410孙旭彤,张士璀,刘振辉等,2002.热激蛋白研究概况及其

在海洋生物中的研究进展.海洋科学,26(6):24—27李明云,张海琪,薛良义,2003.网箱养殖大黄鱼遗传多样

性的同工酶和RAPD分析.中国水产科学,10(5):

gyPartA:Molecular&IntegrativePhysiology,3(4):435—446

TomanekL,SomeroG,1999.Evolutionaryandacclimationin2

ducedvariationintheheat2shockresponsesofcongener2icmarinesnails(Genustegula)fromdifferentthermalhabitats:implicationsforlimitsofthermotoleranceandbiogeography.JExpBiol,202:2925—

2936

大黄鱼 热激蛋白的相关研究

4期张祖兴等:大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)热激蛋白的基因克隆、原核表达及抗血清的制备341　

HEATSHOCKPROTEIN(HSP)GENEFROMPSEUDOSCIAENACROCEA:CLONING,PROKARYOTICEXPRESSING,ANDANTISERUM

FORMATION

ZHANGZu2Xing,LIMing2Yun,CHENJiong ,WUYong

(FacultyofLifeSciencesandBiotechnology,NingboUniversity,Ningbo,315211)

(DepartmentofVirologyandBiotechnology,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou,310021)

Abstract　　Withtheprotocoloftrizol,totalRNAwasextractedfromthelivertissueoflargecroaker(Pseudosciaenacrocea)culturedinXiangshanBay;RT2PCRwasusedtoobtaincDNAofP.crocea.SpecialprimersweredesignedforHSPamplification,aftersequencingandcloning,theHSPgenewasligatedintotheexpressionvectorpSBET.TherecombinantplasmidwastransformedintocoliBL21andtheninducedtoexpressbyIPTG.ThemolecularweightofHSP2Pconsistentwiththededucedsize.Theexpressedfusionproteinwaswasempoimmunizethemiceforpreparingspecificantiserum,whichreactedstrbywesternblotting.Thephylo2genicanalysisshowed:HSPamandnucleotidesequenceofP.croceasharedveryhigh(clawedfrog),whichconfirmedthehypothesisthattheAmphibianwastothePiscesinphylogentics.Phylogenicconstructionwouldprovidebasisforfollow2upworksnucleotideprobepreparation,cloneandselectionofsomefinefunctionalgenesforculture,bininggenewithSDS2PAGEwouldbeaneffectivewayforassessingthelevelsofgeneticdiversityinfishesrespectivelyfromDNAlevel.

Keywords　　Pseudosciaenacrocea,Heatshockprotein(HSP)gene,Prokaryoticexpression,

Antiserum

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/no54.html