足细胞损伤与糖尿病肾病相关性研究

探讨糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)大鼠足细胞超微结构及其相关分子改变与肾损伤的相关关系。方法：将20只Wistar大鼠随机分为正常对照组和糖尿病肾病模型组。于第4、8周检测24h尿蛋白量和血清肌酐等生化指标,并计算肌酐清除率;用免疫组织化学和RT—PCR方法检测肾皮质nephrin,podocinmRNA及蛋白表达;用透射电镜检测足细胞超微结构变化。结果：24h尿蛋白排泄量与足突

实用医学杂志 2 1年第 2卷第 2 00 6期

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足细胞损伤与糖尿病肾病相关性研究陈立平聂晚年吴晓英摘要目的：讨糖尿病肾病 ( i ei np rp t, N)鼠足细胞超微结构及其相关分子改变与肾损伤的探 da t e ho a y D大 b c h

相关关系方法： 2将 0只 Wia大鼠随机分为正常对照组和糖尿病肾病模型组， sr t于第 4 8周检测 2蛋白量和、 4h尿血清肌酐等生化指标，并计算肌酐清除率；用免疫组织化学和 R—C T P R方法检测肾皮质 n pr,ooi m N e hi pd cn R A及 n蛋白表达：透射电镜检测足细胞超微结构变化。结果：4h尿蛋白排泄量与足突融合率成正相关 (用 2 P<00 )与 .、 5

肾组织 n p r ( ehi P<00 )p dc ( n .1、ooi P<0O )白表达成负相关。肌酐清除率与足突宽度成负相关( n .1蛋 P<00 )与 .、 5 n pr ( ehi P<0 5、 ooi白表达( n . )pd c 0 n蛋 P<00 ) .成正相关。Ⅳ型胶原蛋白表达与足突宽度成正相关( 5 P<0o )与 .1、 np r ( ehi P<00 )p dcn蛋白表达成负相关( n .1、 ooi P<00 ) .1。结论：细胞超微结构改变及其相关分子表达减少不仅足与肾功能损害密切相关 .且可导致肾小球硬化和肾纤维化。而 关键词糖尿病肾病：足细胞损伤：肌酐清除率； 1胶原蛋白 V型

足细胞是位于肾小球基底膜外侧的一种高度分化的细胞，构成肾小球滤过屏障的最后一道防它线…。糖尿病肾病 ( N) D肾小球足细胞病变与蛋白尿的关系为人们所熟知『,足细胞超微结构及其相 2但 _关分子改变与肾功能及肾纤维化之间的关系尚缺乏全面了解。本文通过 D N大鼠模型，足细胞病变与对肾功能及肾纤维化之间的相关关系进行了深入研究。1材料与方法

132免疫组化检测以 P S代替一抗的方法做阴 .. B性对照染色 (剂盒购于福州迈新 )石蜡切片常规处试。理 .分别滴加羊抗大鼠 npr ehi体、兔抗大鼠 n抗 pdc ooi体、抗大鼠 C lV体，育 4 n抗兔 o 1

抗 孵℃过夜。滴加特异性二抗、抗，后显微镜下控制 D B显色。三最 A n p r .o oi白及 C l表达采用半定量分析， e hi pd cn蛋 n o V I即随机选取 1连续不重复的视野 ( 4 0,据肾 O个 x 0 )根小球足细胞着色情况计算阳性指数 ( I, I P ) P=阳性信号面积 X阳性强度 .和、平均数 _。求取 7] 1 .透射电镜检测检测足细胞计数、突平均宽 .3 3足

11实验动物选择雄性 Wia大鼠 2 . sr t 0只，体重 (2 2 0±2 )。大鼠随机分为正常对照组 ( 0g将 N组 )和糖

尿病肾病组 ( D组 )每组 l。, 0只

1动物模型制作链脲佐菌素 (T )0m/ g . 2 S Z 6 g k腹腔注射。4 8~7测空腹血糖>1.mm lL为糖 2h检 67 o/ 尿病大鼠。 3周后 2 4h尿蛋白量 ( r ) 0mg时认为 Po≥3 D N大鼠模型成功。糖≥2 . mmo L的大鼠皮下注血 60 l/射适量胰岛素，随机血糖维持在 1.mm lL水平以使 7 o 6/上。分别于第 4 8处死各组大鼠 5只 (、周处死前收集血和尿标本 )留取肾皮质 1,。 mm数小块， 25以 .%戊二醛固定用于电镜检测， 1%甲醛固定后用于光镜检测。以 0 其余肾组织速冻于液氮中封存用于 R—C TP R检测。 13实验方法 .131生化检测双缩脲法测定 2 .. 4h尿蛋白定量： 全自动生化分析仪检测血清肌酐及 2 4h尿肌酐：肌酐清除率 ( c) C r的计算方法如下[: ], 、、J 1一

度 (P )足突融合率 (P R)] FW和 F F。 1 . R -C . 4 TP R检测总 R A提取按 Ti l美国MR 3 N r o( z C公司 )明书进行。 2 N说取 gR A逆转录成 c N引物 D A;序列： p r上游 5-A C C A C, C A G 下 n hi e n C A C G Ar C C 3, T丌游 5一 G C C G T T T T T .: o oi游 5一 G G T G C G A G A T 3 p dcn上 T A C C C GG r C AG C T T A兀 G 3下游 5一 I A G T 一 . C’ T G G TC

G IGC T3。以 G D为内参照，分别计算

TT A . AP H npr e hi p d c n和 o oi因吸光度/ A D n基 G P H吸光度。 1统计学方法采用 S S 1. . 4 P S 10软件包统计分析。 结果用±表示。计量资料的组间比较采用单因素 s方差分析。两组问的关系比较采用直线相关分析。以P<00 .5为差异具有统计学意义。2结果

21各观察指标造模前后比较结果 .

造模后第 4周

尿肌酐 ( m lL￣ o/ )X每分钟尿量 (/ i ) mL m n一

血肌酐( m lL× I o )体重 (g x/ k)

和第 8周。 D组大鼠 2 r 4hPo与 N组比较。差异有统计学意义 ( P<00 ) .1。造模后第 8周， D组大鼠 Cr c与 N组比较，异有统计学意义 (差 P<00 ) .1。造模后第 4 周和第 8周。大鼠 np r D组 ehi n和 pdc ooi白表达水 n蛋平 ( I )与 N组比较，差异有统计学意义 ( P值 P< 00 )与 N组比较， .5。 D组大鼠肾组织Ⅳ型胶原 ( o Cl Ⅳ )白表达逐渐增强，蛋两组同期比较分别 P<00、 . 5 0O。透射电镜可见 D组足突增宽、融合甚至消失， .1 足细胞有脱落、细胞数减少； D组大鼠足细胞数、

d i1 . 6￣.s.0 6 52 . 1 . .1 o:03 9 i n10 - 7 52 00 0 7 9 s 0 2

基金项目：湖南省自然科学基金 (编号：5J0 7 ) 0 J3 17

作者单位： 10 8长沙市， 400中南大学湘雅医院肾内科 (陈立平聂晚年 ) 4 0 7长沙市，; 10 8中南大学湘雅医学院电镜室(吴晓英 ) 通信作者：晚年聂 E m i ne ana@13cr— al iw nin 6 . n: o

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