马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析 - 图文

分类号：Q71 U D C ：577 密 级 ：

学 号 ：2111101109

广 东 海 洋 大 学

硕士学位论文

马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因

的关联分析

陈伟耀

指导教

师： 杜晓东 教授 申请学位类别： 理学硕士 专研学

业究院

名方名

称： 海洋生物学 向： 海洋经济动物发育学 称： 水产学院

中国·湛江 2014年6月

马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因

的关联分析

摘 要

本研究以马氏珠母贝选育系F5、对照群体和普通养殖群体为实验材料，比较了三个群体育珠和生长性状的差异，分析了矿化和生长基因与相关性状的关联性，且克隆并分析了4个生长相关基因，结果如下：

1、植核手术后经过7个月的海区养殖，比较三个群体的育珠性能：（1）选系F5比对照群体和普通养殖群体的成活率分别提高了8.79%和7.61%；(2）选系F5比对照和普通养殖群体的留核率分别提高了47.94%和46.06%，差异显著（P < 0.05）；（3）选系F5的珍珠质重量比对照群体和普通养殖群体分别提高了22.02%、18.75%，差异不显著；选系F5的珍珠层厚度比对照群体和普通养殖群体分别提高了30.24%、 24.28%，差异显著（P < 0.05）；

2、植核育珠第210天，育珠性状和矿化基因的相关性分析结果表明：NACREIN、MSI60和PIF177与珍珠性状呈正相关，相关系数为0.408-0.979；而N19与珍珠性状呈负相关，N19与珍珠层厚度和珍珠质重量相关系数分别为-0.214和-0.270；

3、从本实验室珍珠囊转录组数据库筛选出四个生长相关基因，转化生长因子β受体I型(TβR I)、表皮生长因子受体（EGFR）、生长激素诱导的跨膜蛋白（GHITM）和成纤细胞生长因子（FGF18），分析这些基因与生长性状的相关性。四个生长相关基因（TβR I，EGFR，GHITM，FGF18）与马氏珠母贝壳长、壳高等8个生长性状均呈正相关，相关系数为0.387-0.998，其中TβR I与壳长的相关水平显著（r = 0.998，P < 0.05）。

4、马氏珠母贝TβR I基因cDNA全长2210bp，ORF为1569bp，编码522个氨基酸，蛋白前体由信号肽、细胞外区、跨膜区和细胞内区四部分组成。细胞外区包含一个激活素I型受体区，细胞内区包括GS结构域（189-215aa）和丝氨酸/苏氨酸激酶结构域（217-508aa）；马氏珠母贝EGFR基因cDNA全长4934bp，ORF为4269bp，编码1422个氨基酸。蛋白由N端的细胞外区、跨膜区和C端的细胞内区三部分组成，细胞外区是配体的结合位点，跨膜区由22个氨基酸残基组成，将受体锚定在胞膜上；细胞内区包含一个酪氨酸激酶区（872-1128aa）；马氏珠母贝GHITM基因cDNA全长1468bp，ORF为1017bp，编码338个氨基酸，与Bax1-I家族共有217aa结构域；马氏珠母贝FGF18基因的cDNA全长为2534bp，ORF为714bp，编码237个氨基酸，蛋白质前体有N端信号肽结构，成熟蛋白由213个氨基酸残基构成，在45-178aa处存在FGF家族共同的保守序列；氨基酸序列同源比对发现TβR I、GHITM和EGFR具有较强保守性，在软体动物和脊椎动物中同源性亦较高，而FGF18保守性相对较

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差；全组织荧光定量显示，四个基因在各组织均表达，血淋巴中表达量低。TβR I和EGFR在鳃和足中表达量最高，而GHITM和FGF18在性腺中表达量显著高于其他组织（P < 0.05）；

关键词：马氏珠母贝，育珠性状，生长性状，功能基因，关联分析

II

Correlation Analysis of Pearl Production and Growth Traits with the Related Genes from Pinctada martensii

Abstract

In this study, we evaluated the differences in pearl production and growth traits of the fifth-generation selected lines (F5), the control stocks and the common cultured stocks, calculated the correlation between pearl production and growth traits of the three stocks and related genes, then cloned and analyzed the four growth genes. The results are summarized as follows:

1. Cultured for 210 days after nucleus-inserting operation,compared pearl production traits of the three groups: (1) Compared to the control stocks and the common cultured stocks, survival rate of F5 increased by 8.79% and 7.61%, respectively. (2) Compared to the control stocks and the common cultured stocks, nuclear retention rate of F5 increased by 47.94% and 46.06%, respectively, significant difference (P < 0.05). (3) Compared to the control stocks and the common cultured stocks, weight of pearl of F5 increased by 22.02% and 18.75%, respectively, the difference was not significant; Compared to the control stocks and the cultured stocks, pearl thickness of F5 increased by 30.24% and 24.28%, respectively, significant difference (P < 0.05);

2. Cultured for 210 days after nucleus-inserting operation. Correlation analysis showed that the correlation between NACREIN, MSI60, PIF177 and pearl traits (pearl weight and pearl thickness) were positive, with correlation coefficients ranging from 0.408 to 0.979. The correlation coefficients between N19 and pearl traits were negative, correlation coefficients of N19 and pearl thickness and weight of pearl were -0.214 and -0.270, respectively.

3. Four growth related genes, transforming growth factor receptor type I (TβR I), epidermal growth factor receptor (EGFR), growth hormone-induced transmembrane protein (GHITM) and fibroblast growth factors (FGF18) were selected in the experiment. Correlation coefficients between each of the four genes and growth traits of P. martensii were calculated. The results showed a positive correlation between eight growth traits of P. martensii and the four genes, with correlation coefficients ranging from 0.387 to 0.998. The correlation coefficient of TβR I and shell length was significant (r = 0.998, P <0.05). 4. Full-length cDNA of TβR I was 2210 bp, ORF of 1569 bp, encoding 522 amino acids, precursor protein includes a signal peptide, extracellular domain, transmembrane domain and the intracellular domain. Extracellular domain contained an activin type I receptor, intracellular domain includes GS domain (189-215 aa) and serine/threonine kinase domain

III

(217-508 aa). Full-length cDNA of EGFR was 4934 bp, ORF of 4269 bp, encoding 1422 amino acids. The protein consisted of the extracellular domain of the N-terminal, a transmembrane domain and the intracellular domain of the C-terminal. Extracellular domain was a ligand binding site, transmembrane domain includes 22 amino acid residucing, the receptor anchored in the cell membrane, intracellular domain contains a tyrosine kinase domain (872-1128 aa). Full-length cDNA of GHITM was 1468 bp, ORF of 1017 bp, encoding 338 amino acids, there was a region same with Bax1-I family. Full-length cDNA of FGF18 was 2534 bp, ORF of 714 bp, encoding 237 amino acids, protein precursors had an N-terminal signal peptide structure. The mature protein consisted of 213 amino acid residues, co-existence of conserved sequences at the 45-178 aa with FGF family. Amino acid sequence homology compared found TβR I, GHITM and EGFR was conserved, homology in the mollusks and vertebrates was high. FGF18 had relatively poor conservation. RT-PCR detected the gene expression in the tissues of P. martensii. Four genes were expressed in various tissues and expression in hemocytes was the lowest. TβR I and EGFR expression were highest in gill and foot, while GHITM and FGF18 expression in gonad was significantly higher than in the other tissues (P < 0.05).

Key Words: Pinctada martensii, pearl production traits, growth traits, functional genes, correlation analysi

IV

目 录

摘 要 .................................................................................................................................... I Abstract .............................................................................................................................. III 1前言 .................................................................................................................................... 1 1.1马氏珠母贝的研究现状 .............................................................................................. 1 1.1.1马氏珠母贝的概述 ............................................................................................... 1 1.1.2马氏珠母贝珍珠质矿化的研究 ........................................................................... 1 1.1.3马氏珠母贝生长的研究 ....................................................................................... 3 1.2研究的目的和意义 ...................................................................................................... 5 2育珠性状与珍珠质矿化相关基因表达量的相关分析 .................................................... 6 2.1实验材料 ...................................................................................................................... 6 2.2实验方法 ...................................................................................................................... 6 2.2.1马氏珠母贝三个群体育珠性状的统计分析 ....................................................... 6 2.2.2马氏珠母贝三个群体珍珠质矿化相关基因的荧光定量 ................................... 6 2.2.3 育珠性状与珍珠质矿化相关基因的相关分析 .................................................. 9 2.3实验结果 ...................................................................................................................... 9 2.3.1马氏珠母贝三个群体育珠性能的比较 ............................................................... 9 2.3.2 珍珠质矿化相关基因表达的定量结果 ............................................................ 10 2.3.3 珍珠层厚度与珍珠质矿化相关基因的相关性 ................................................ 10 2.4 讨论 ........................................................................................................................... 11 3生长性状与生长相关基因表达量的相关分析 .............................................................. 13 3.1实验材料 .................................................................................................................... 13 3.2实验方法 .................................................................................................................... 13 3.2.1马氏珠母贝三个群体生长性状的跟踪测量 ..................................................... 13 3.2.2马氏珠母贝三个群体生长相关基因的荧光定量 ............................................. 13 3.2.3 生长性状与相关基因表达量的相关分析 ........................................................ 14 3.3实验结果 .................................................................................................................... 14 3.3.1马氏珠母贝三个群体生长的比较 ..................................................................... 14 3.3.2 生长相关基因的荧光定量结果 ........................................................................ 15 3.3.3 生长性状与生长相关基因表达量的相关性 .................................................... 16 3.4 讨论 ........................................................................................................................... 16 4马氏珠母贝生长相关基因的克隆和组织表达研究 ...................................................... 18 4.1实验材料 .................................................................................................................... 18 4.1.1实验动物和菌种 ................................................................................................. 18 4.1.2主要仪器设备 ..................................................................................................... 18 4.1.3主要试剂 ............................................................................................................. 19 4.1.4主要的溶液和培养基及配制方法 ..................................................................... 20 4.2实验方法 .................................................................................................................... 20 4.2.1引物的设计 ......................................................................................................... 20 4.2.3 RNA的抽提 ........................................................................................................ 21

4.2.4 cDNA 末端的快速扩增(RACE)获取基因的全长 ............................................ 21 4.2.5 序列的拼接及生物信息学分析 ........................................................................ 24 4.2.6荧光定量PCR ..................................................................................................... 24 4.3实验结果 .................................................................................................................... 25 4.3.1 生长相关基因的克隆结果 ................................................................................ 25 4.3.2 生长相关基因的序列分析 ................................................................................ 26 4.3.3 序列的同源性及进化分析 ................................................................................ 36 4.3.4 生长相关基因在各组织中的表达 .................................................................... 43 4.4 讨论 ........................................................................................................................... 46 4.4.1 生长相关基因的序列特征 ................................................................................ 46 4.4.2 生长相关基因的组织表达分析 ........................................................................ 48 5结论 .................................................................................................................................. 50 参考文献 ............................................................................................................................. 51 致 谢 ............................................................................................................................. 59 导师简介 ............................................................................................................................. 60

广东海洋大学硕士学位论文

1前言

1.1马氏珠母贝的研究现状

1.1.1马氏珠母贝的概述

马氏珠母贝（Pinctada martensii），也称合浦珠母贝，属软体动物门，瓣鳃纲，珍珠贝目，珍珠贝科，珠母贝属，是目前我国培育海水珍珠的主要贝类之一。马氏珠母贝是暖水性贝类，在中国主要分布在南海海区，广东大亚湾、流沙湾海区和广西北海都是重要的养殖区。1965年张玺教授带领研究团队在广西首次进行马氏珠母贝的人工育苗并取得成功，开启了人工养殖培育珍珠的时代[1]。1970年湛江水产学院成立珍珠研究小组，在熊大仁教授的领导下对珍珠养殖和加工工艺进行研究[2]，研究成果不断在生产中推广应用，生产规模不断扩大，马氏珠母贝珍珠产业迅速发展，于上世纪90年代达到产业高峰，养殖面积近30万亩，年产珍珠20万吨左右，未加工的初级产品产值超过2亿元。南珠因珍珠品质优良而闻名世界。然而，近几年马氏珠母贝的养殖规模不断缩小，马氏珠母贝珍珠质量与产量明显下降，马氏珠母贝珍珠产业陷入了低谷。

影响南珠产业衰退的因素中，马氏珠贝种质退化是一个不可忽视的原因。随着人类活动对海洋环境影响的加剧，马氏珠母贝的野生群体变得越来越小，同时，由于生产一线人员在苗种培育方面缺乏基本的育种理论，造成长期近交衰退，另外，科研人员引种进行杂交育种或从杂交后代中进行选择育种时，造成品种混杂。直接造成马氏珠母贝生长速度慢，抗逆性差，珍珠质分泌能力差，进而造成养殖周期长和珍珠品质差的严重后果。因此，进行马氏珠母贝种质复壮和通过遗传育种技术培养出具有优良经济性状的良种是振兴南珠产业的重要举措。

马氏珠母贝的遗传育种跟其他水产经济动物的育种相似，主要是杂交育种、多倍体育种、选择育种和近年来发展较快的分子标记辅助育种等。杂交育种可以增加群体的遗传多样性，同时也增加了更多的变异，而根据育种目标进行选择育种可以进一步强化目标性状的出现概率；马氏珠母贝多倍体育种早有研究[3-7]，但在理论和生产实践上还存在诸多问题，马氏珠母贝多倍体育种的理论和方法有待突破。目前分子标记辅助育种在马氏珠母贝的遗传育种中已有应用，随着技术的发展，有望缩短马氏珠母贝良种培育的进程。马氏珠母贝的遗传育种不应该局限于某种育种手段，任何有助于良种培育的方法都可以为科研工作者所用，马氏珠母贝的良种应该具有生长速度快，抗逆性强，珍珠质分泌旺盛的特点。 1.1.2马氏珠母贝珍珠质矿化的研究

在宏观水平上，对于珍珠质矿化的研究主要体现在：生长性状与珍珠矿化能力相关性的研究。Wada博士研究发现，珍珠的重量与贝壳的重量成正相关[8]，而王庆恒

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马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析

等[9]研究表明，壳长、壳高、壳宽、壳重和总重5个生长性状与珍珠的质量和珍珠层厚度存在极显著相关性，提出改良育珠贝的生长性状而达到提高珍珠质量的观点。

马氏珠母贝矿化，尤其是珍珠层的矿化，在分子水平的研究较为深入。首先是贝壳的结构和组成，贝壳由里及外一般分三层，珍珠层、棱柱层和角质层，贝壳由95%的碳酸钙和5%的基质蛋白组成，因此，贝壳基质蛋白一直是学者们关注的焦点，特别是与珍珠层矿化相关的基因或者蛋白质。麻彩萍等[10]从珍珠层中分离和纯化基质蛋白P14；张岑[11]从珍珠层分离纯化得到与珍珠层形成相关的蛋白p10，通过体外碳酸钙结晶实验证明p10能加速碳酸钙以文石晶型结晶；Chihiro Nogawa等[12]研究发现N16具有多样性，至少有两个N16的基因，都能转录和翻译生成N16蛋白质，并参与珍珠质的形成，对N16转录调控机制和功能将更加深入的了解它在软体动物生物矿化的作用；Yu Jiao等[13]克隆得到皮连蛋白（DPT）基因的cDNA全长，RNA干扰实验表明，贝壳与棱柱层接连处的珍珠层的结构发生了紊乱，初步证明DPT与珍珠层生成有关；还有Nacrein[14] ，MSI60[15]等也参与了珍珠层的形成。棱柱层矿化相关基因的研究也有报道，研究发现prismalin-14[16] 、aspein [17]、MSI7 [18]、prisilkin-39 [19]、KRMP家族[20]、prismin 家族[21]等参与棱柱层的形成。Shematrin家族蛋白被证明参与珍珠层和棱柱层的形成[22]。人工养殖游离珍珠的灵感自来于天然珍珠，珍珠贝的外套膜外内侧上皮有分泌珍珠质的机能，在异常情况下，如外界沙粒、寄生虫等入侵刺激，或病理影响，表皮细胞陷入结缔组织中，形成珍珠囊，分泌珍珠质。

对珍珠囊矿化的研究将有助于解开生物矿化的机理，研究发现珍珠囊形成之后首先矿化附着在珠核上的是方解石结晶，然后在此基础上不断分泌，粘附珍珠质。部分基因既能参与珍珠层的形成也能参与与棱柱层的形成，但是对于它们在参与方解石和文石结晶之间的选择调控机制还不清楚。Nariaki Inoue等[23]对生产优质珍珠与劣质珍珠的马氏珠母贝育珠贝外套膜组织中贝壳基质蛋白基因的表达模式比较，认为劣质珍珠是由于棱柱层矿化相关基因的表达量上升导致的，但是由于实验样本数过少，实验结果并不一定是可靠的。珍珠囊是分泌珍珠质的特殊结构，目前对珍珠囊矿化基因表达模式的研究还比较少，值得深入研究。

目前，马氏珠母贝在转录组和基因组上也有研究。赵晓霞[24]对珍珠囊转录组的高通量测序，数据组装和注释后通过数据库比对得到了103条与生物矿化相关的序列，通过对珍珠囊六个不同发育时期矿化相关基因的表达分析，发现了13个差异表达的基因，它们分别编码皮连蛋白、钙调素蛋白和氨酸蛋白酶等；Dong Fang等[25]在马氏珠母贝幼虫贝壳形成的关键点构建三个抑制消减杂交文库，总共2923条EST序列得到990未知基因，从中筛选分泌蛋白和有串联排列重复单元的蛋白，得到一些参与贝壳形成的基因序列，对其中5种文石结晶相关基因RT-PCR和原位杂交的研究表明，这些基因与已知生物矿化相关基因有不同的表达模式。通过RNA干扰抑制5个基因的表达会造成对珍珠层不同的影响，说明这5个基因都参与文石结晶；TAKESHI

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Takeuchi等[26]通过现代高能量测序技术研究了合浦珠母贝的基因组，构建了解开珍珠矿化分子机制的平台。 1.1.3马氏珠母贝生长的研究

马氏珠母贝的生长速度直接影响着珍珠生产的周期，并且普遍认为生长速度快的马氏珠母贝具有更强的珍珠质分泌能力，所以生长速度快是遗传育种的重要目标性状。多年来国内外许多专家学者对马氏珠母贝的生长做了大量的研究，文献报道显示，国外学者Wada 等最早对马氏珠母贝的生长进行研究[27-30]，而国内对马氏珠母贝生长的研究主要有：

（1）对不同地理群体生长性状的比较分析。王爱民等[31]研究马氏珠母贝三个不同地理群体自繁和群体杂交子一代11个形态性状并对性状进行相关分析，认为马氏珠母贝壳长、壳重和总体重是生长速度的重要形态指标；随后王爱民等[32]采用2×2双列杂交的方式，取得马氏珠母贝印度群体和三亚群体4组子代，其中以三亚野生群体作为母本，印度养殖群体作为父本的杂交后代在壳长，壳高，绞合线长等表现出最大的杂交优势，微卫星标记研究表明本杂交子一代杂合度和遗传多样性更高，这是杂交子一代具有明显杂交优势的分子基础；而邹烈星[33]把印度群体和三亚群体双列杂交得到四个后代群体分别在海南陵水和三亚两个地方养殖，试验表明杂交群体生长速度比自交后代快。

（2）通过选择育种对马氏珠母贝生长的研究。何毛贤等[34]从大亚湾海区3月龄马氏珠母贝养殖群体中挑选出大个体和小个体两组，在相同的环境中养殖13个月，定期测量，比较两组个体的生长情况，结果显示初始值较大的个体在后期仍有较大的长速，个别较小的个体生长速度较快，在后期也能长得很大，3-9月龄贝大小增长率较11-16龄快，而体重增长却小于11-16月龄贝；何毛贤等[35]把大亚湾养殖群体选育子一代当作实验组，以大亚湾养殖群体作为对照组，在相同的环境下养殖，并对两组群体生长性状进行1年的跟踪测量，结果显示，实验组壳长、壳高、壳宽、总生和成活率都大于对照组，为马氏珠母良种选育奠定了基础；何毛贤等[36]用一年多的时间跟踪测量马氏珠母贝不同时期的壳长、壳高、壳宽和总重，结果表明，4个性状两两间的相关系数均达到了极显著水平，不同生长时期，活体质量对壳高的偏回归系数极显著差异，确定壳高和总重为育种的目标性状；随后何毛贤等[37]采用单对配对方法建立7个家系，以壳高和总重为选育的目标性状，对家系生长的变异进行比较，确定壳高和总重具有明显优势的家系，该家系作为进一步选育出生长速度更快群体的基础选育材料。还有类似的研究，陈丹群等[38]以连续2代群体选育的马氏珠母贝为亲本，采用单个配对，建立10个合浦珠母贝家系，对生长性状进行研究，选出总体生长指标较好的家系，作为进一步选育的材料；而李雷斌等[39]则通过研究不同规格亲本对子后代生产性能的影响，结果表明大规格亲贝群交后代表现出更加明显的生长优势，截断选择策略有效。

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马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析

（3）构建壳色群体研究马氏珠母贝的生长优势。在实际的生产中发现马氏珠母贝的壳色具有多样性，所占比例最大的是白色、黑色、红色和黄色四种壳色，这是一个非常直观的表型性状，能不断选育得到了较纯的壳色群体，并且通过选育不断纯化稳定与壳色关联的性状。自2003年以来，广东海洋大学科技工作者们相继建立起了马氏珠母贝黄色、白色、黑色和红色壳系，并对这四种壳色群体的生长进行了研究。邓岳文等[40]比较了黄色选系F1与同海区同龄养殖群体的形态性状，结果显示，养殖群体平均壳长显著大于黄壳色群体，而黄壳色群体的壳重量指数和肥满度指数显著大于养殖群体；王庆恒等[41]对4个壳色选系F1幼虫生长的比较，显示在幼虫阶段壳色与生长性状可能存在一定的关联性；陈静等[42]比较4种壳色F3与普通群体的生长情况，结果表明F3选系四个性状显著大于普通群体，选系中黑壳色群体生长最快，其次是白壳色和黄壳色，最后是红壳色；朱晓闻等[43]比较4种壳色F5与对照群体的生长情况，4个选系的生长指标均显著大于对照组；郭华阳等[44]以4种壳色选育群体为亲贝，同一壳色雌雄单个配对，构建15个全同胞家系，对幼体生长性状的相关性和遗传力进行分析，结果表明，以壳长和壳高为目标性状进行选育能达到改良生长性状的目的。壳色与其他性状的关联性有待进一步研究。

在微观方面，随着现代测序技术及生物信息学的发展，近年来贝类转录组已经有报道，Huan 等[45]对文蛤不同发育阶段幼虫进行454高通量测序，通过组装拼接并进行功能注释得到一系列与生长发育、免疫和贝壳形成相关的侯选基因，初步分析一些基因在幼虫不同发育阶段的表达情况；Hou 等[46]分析虾夷扇贝成体不同组织和不同发育阶段的转录组特征，序列组装拼得到将获得25237 个蛋白编码基因，通过功能注释获得许多与生长、抗逆性、免疫等相关的基因，同时鉴别了2700 个 SSR 标记和49000 个 SNP 标记；董迎辉[47]从泥蚶转录组数据中挖掘了大量生长相关的基因，如表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、转化生长因子 β（TGF-β）和成纤维生长因子（FGF）等；从转录组文库中还发现了细胞外信号调节激酶1/2（ERK1_2）、MAPK激酶1（MEK1）和MKK7等一系列关键酶，以及生长因子受体FGFR、EGFR与受体调节因子蛋白激酶C也被发现。对于马氏珠母贝转录组的研究已有很多报道方，王爱民[48]构建了9个马氏珠母贝的cDNA文库，测序后组装得到大量的EST序列，将得到的EST序列与线虫的生长相关基因比对，得到了175条马氏珠母贝可能与生长相关的基因，但是并没有深入地研究这些基因；Yu Shi等[49]从同一个选育群体中取出5个小个体和5个大个体，通过高通量测序，把得到的EST序列进行比对，34个差异表达的基因中有11个与生长相关，并通过荧光定量检测这些基因在大小群体中的表达。目前马氏珠母贝生长相关基因的研究还相对较少，有待深入研究。

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1.2研究的目的和意义

本实验通过研究马氏珠母贝生长和育珠性状与相关基因的关联性，探索马氏珠母贝育珠和生长性状差异的分子机理，为分子辅助育种应用于马氏珠母贝的品种改良，培育出具有生长速度快和育珠性状好的优良品种提供支持。

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马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析

2育珠性状与珍珠质矿化相关基因表达量的相关分析

2.1实验材料

2001-2002年期间，从广西北海涠洲岛收集3批自然群体，转移到雷州乌石海区养殖。2003年，利用采集的3批亲本构建了1个选育基础群体，以壳型（壳长和壳宽）为育种目标，通过连续5代的连续选择，培育出选系F5，同时从亲本群体随机选择个体繁育对照群体（B），从海区养殖群体中随机挑选亲本培育普通养殖群体（C）。本部分实验利用选系F5（A）、对照群体（B）与普通养殖群体（C）进行植核育珠，按常规方法海区休养及育珠养殖，根据实验要求，定时取样。

2.2实验方法

2.2.1马氏珠母贝三个群体育珠性状的统计分析

1、死亡率和留核率的统计

植核后的第7天、第15天、第30天、第90天第、第150天、第210天，从三个群体中各随机抽取5笼（每笼38个育珠贝），统计植核后三个群体育珠贝的成活率和留核率。

2、珍珠性状的测量

植核后第90天、第150天和第210天，从每个群体中随机取30颗珍珠，游标卡尺测量珍珠的直径，电子天平称量珍珠重量；用小铁锤去除珍珠层，测量珠核的直径，称量珠核的重量，对应数据作差得到珍珠层的厚度（精确到0.01mm）和珍珠质的重量（精确到0.001g）。

3、数据处理

采用M±SD统计样本，用统计软件SPSS19.0对数据进行分析处理，差异显著性检验水平为P < 0.05。

2.2.2马氏珠母贝三个群体珍珠质矿化相关基因的荧光定量

1、实验前的准备

无RNA酶金属工具的准备：用双蒸水清洗干净小剪刀，镊子，解剖刀等，烘干，用锡箔纸包裹于烘箱中180℃烧烤8h以上；无RNA酶塑料耗材的准备：在大烧杯中配制1‰ DEPC水，将枪头、离心管等浸泡其中，用塑料薄膜和锡箔纸封闭瓶口于通风橱中摇床上缓慢摇过夜，121℃高压灭菌30min，倒掉水，烘箱中80℃的烘干；一般无菌塑料耗材和金属工具的处理，需要清洗干净，烘干，用容器分装并用报纸或牛皮纸包裹，然后121℃高压灭菌30min，90℃烘箱中烘烤除净水份，备用。

2、RNA的提取

植核育珠第210天后从三个群体中分别随机取10个生产优质珍珠的珍珠囊，每

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个珍珠囊分成2-3份装入灭菌的抗冻管中，立即放入液氮中速冻至少30min，然后迅速转移到-80℃超低温冰箱保存备用。根据Trizol Reagent RNA说明书进行RNA提取操作，略有变化：

（1）取新鲜组织或从-80℃冰箱取组织，2mL无RNA酶离心管中每50mg组织加入1mL Trizol，加入小钢珠，用组织匀浆机匀浆3-5min，使组织破碎完全，室温放置5min，使核蛋白与核酸完全分离；

（2）每1mL Trizol加入0.2mL 4℃预泠的三氯甲烷；

（3）手动剧烈摇晃1min，室温放置3 min，4℃，12000g离心15min； （40取上清于1.5 mL无RNA酶离心管，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min；

（5）4℃，12000g离心10min；

（6）弃上清，加入1mL无RNA酶75%乙醇，轻轻颠倒使沉淀悬浮于溶液中，4℃，7500g离心5 min；

（7）弃上清，超净工作台上放置5-10min，20-30?L无RNA酶水溶解RNA； （8）用核酸定量仪检测RNA的浓度和纯度； （9）用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性； 3、cDNA的合成

用核酸定量仪检测RNA的纯度和浓度，质量合格的RNA用 M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 合成cDNA，详细操作如下：

（1）0.2mL的管中制备下列模板RNA/引物混合液，总体积6?L；

模板RNA 500ng Random Primers（25μm） 1?L RNase-free ddH2O up to 6?L

（2）70℃保温10min后迅速在冰上冷却2min以上；

（3）离心数秒种使模板RNA/引物的变性溶液聚集于0.2mL离心管底部； （4）在上述离心管中配制下列反转录反应液：

上述模板RNA/引物变形溶液 5×M-MLV Buffer dNTP Mixtue（各10mM） RNase Inhibitor（40 U/?L ）

RTase M-MLV（RNase Hˉ）（200 U/?L ） RNase free dH2O 总体积

6.0?L 2.0?L 0.5?L 0.25?L 0.5?L 0.75?L 10.0?L

注意：起始模板RNA量超过500ng，RTase M-MLV（RNase H-）的使用量就大于0.25?L；

7

马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析

（5）以Random Primers 作引物时先进行30℃，10min，然后42℃保温1h； （6）70℃保温15min后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接PCR扩增或-20℃保存备用。

4、引物设计

查阅相关文献，确定目标基因，从NCBI上下载马氏珠母贝珍珠质形成相关基因的序列，用Primer5.0设计荧光定量的引物。

表2-1 引物信息

Table 2-1 Primers information

引物名称

引物序列

引物来源

GenBank: D83523.1 GenBank: D86074.1 GenBank: AB332326.1 GenBank: AB236929.1 Unigene73353 GenBank:AB205404.1

产物长度 102 240 80 178 171 219

TM值（℃） 59 59 59 59 59 59 59 59 59 59 59 59

NACREIN-A GGGTGATGTCCCTTTAAGATGTG NACREIN-S CGATTTTGTCGTCGTTGGAGT MSI60-A MSI60-S N19-A N19-S PIF177-A PIF177-S ACTIN-S ACTIN-A GAPDH-S GAPDH-A

AATGTCTCCTAATGCGTCCCT GGTGGTGTTGGTTTCTACGG CGGTTATGACTGCTTTGTTGC TTTCACTTTTGATGGGTATGGC CATACGCCATACCACTAGGACA CAGTATTGGAGCAAACGACAGA GTGTAAGGCGGGGTTTGCT GGGTCCTTCAGCGTTAGTATCTT CACTCGCCAAGATAATCAACG CCATTCCTGTCAACTTCCCAT

5、荧光定量PCR反应程序及体系

反转录得到的cDNA用于荧光定量PCR，荧光定量为Thermo Scientific公司生产

的 DyNAmo? ColorFlash SYBR? Green qPCR Kit（F-416XL）试剂盒，反应程序为：

94℃ 4min 94℃ 30sec

59℃ 15sec 40cycles

72℃(收集荧光信号) 35sec

20?L反应体系如下：

Premix 上游引物 下游引物 cDNA模板 ddH2O 总体积

10?L 0.8?L 0.8?L 0.8?L 7.6?L 20?L

6、以 GAPDH作为内参,每组实验重复10次，用△CT值法进行基因相对表达量

8

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的计算，用软件SPSS19.0 Duncan法进行多重比较，显著性检验水平设为P < 0.05。 2.2.3 育珠性状与珍珠质矿化相关基因的相关分析

用软件SPSS19.0对珍珠层性状与珍珠质矿化相关基因的表达量进行简单的相关分析，对相关系数作Person检验，显著性水平为P < 0.05。

2.3实验结果

2.3.1马氏珠母贝三个群体育珠性能的比较

马氏珠母贝三个群体休养期及育珠期成活率、留核率、珍珠层厚度和珍珠质重量的比较如下：1）植核后第7天、第15天、第30天、第90天、第150天、第210天，选系F5（A）的成活率均高于对照群体（B）和普通养殖群体（C），育珠期结束时，即植核育珠后第210天的统计结果表明，选系F5比对照群体的成活率提高了8.79%，选系F5比普通养殖群体的成活率提高了7.61%，差异不显著。详见表2-2。

表2-2 马氏珠母贝三个群体成活率的统计

Table 2-2 Statistics the survival rate of the three groups from P. martensii

时 间 植核 7天 植核 15天 植核 30天 植核 90天 植核150天 植核210天

对照群体(B) 86.84±6.88a 81.02 ±7.53a 73.42±13.50a 46.49±5.48b 42.63±3.43b 39.91±4.53a

普通养殖群体(C) 84.62±7.35a 81.38±5.42a 68.61±11.14a 53.51±4.02ab 39.47±6.45b 40.35±9.66a

选系F5(A) 86.23±6.28a 84.82±6.28a 76.75±9.86a 55.26±2.63a 46.84±4.71a 43.42±10.09a

注：每行有相同字母表示差异不显著

2）从表2-3可知，植核后第7天、第15天、第30天、第90天、第150天、第210天，选系F5（A）的留核率均高于对照群体（B）和普通养殖群体（C）。植核后第210天的统计结果表明，选系F5比对照群体留核率平均提高了47.94%，选系F5比普通养殖群体的留核率平均提高了46.06%，差异显著（P < 0.05）。

表2-3 马氏珠母贝三个群体留核率的统计

Table 2-3 Statistics leave the nuclear rate of the three groups from P. martensii

时 间 植核 7天 植核 15天 植核 30天 植核 90天 植核150天 植核210天

对照群体(B) 87.98±9.21b 80.01±10.37b 72.88±15.65b 45.96±3.5a 34.68±6.08b 33.33±3.81b

普通养殖群体(C) 93.40±6.58ab 85.81±6.49ab 78.35±8.79a 42.89±2.28a 35.63±1.93b 33.76±5.59b

选系F5(A) 94.99±4.29a 87.14±6.72a 80.89±5.85a 52.02±9.45a 50.08 ±10.04a 49.31±2.84a

注：每行有相同字母表示差异不显著

3）从表2-4可以看出，植核后第90天、第150天和第210天选系F5（A）的珍珠性状均高于对照群体（B）和普通养殖群体（C）。育珠期结束，即植核后第210天

9

马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析

的统计表明，选系F5的珍珠质重量比对照群体和普通养殖群体分别提高了22.02%，18.75%，差异不显著；选系F5的珍珠层厚度比对照群体和普通养殖群体分别提高了30.42%，24.28%，差异显著（P < 0.05）。

表2-4A 马氏珠母贝三个群体珍珠质质量的统计

Table 2-4A Statistics the pearl weight of the three groups from P. martensii

时 间 植核 90天 植核150天 植核210天

对照群体(B) 珍珠质重量(g) 0.069±0.027b 0.100±0.043a 0.109±0.029a

普通养殖群体(C) 珍珠质重量(g) 0.077±0.031ab 0.102±0.039a 0.112±0.039a

选系F5(A) 珍珠质重量(g) 0.084±0.032a 0.114±0.025a 0.133±0.044a

注：每行有相同字母表示差异不显著

表2-4B 马氏珠母贝三个群体珍珠层厚度的统计

Table 2-4B Statistics the pearl thickness of the three groups from P. martensii

时 间 植核 90天 植核 150天 植核 210天

对照群体(B) 珍珠层厚度(mm) 0.187±0.074a 0.266±0.110a 0.296±0.075b

普通养殖群体(C) 珍珠层厚度(mm) 0.205±0.074a 0.279±0.095a 0.313±0.094b

选系F5(A) 珍珠层厚度(mm) 0.210±0.078a 0.306±0.066a 0.389±0.098a

注：每行有相同字母表示差异不显著

2.3.2 珍珠质矿化相关基因表达的定量结果

从表2-5中可以看出，植核后第210天三个群体珍珠囊中矿化基因的相对表达量有差异，但差异不显著。选系F5 NACREIN和MSI60的表达量高于对照群体和普通养殖群体，PIF177在普通群体中的表达量最高，其次到选系F5，N19在对照群体中表达量最高，而在普通养殖群体中表达量最低。

表2-5 植核后第210天三个群体矿化基因的相对表达量（2-△CT）

Table 2-5 The relative expression of mineralization genes of the three populations from

P. martensii 210 days after implantation nucleus (2 -△CT)

对照群体(B)

NACREIN 0.926±0.368a

MSI60 0.277±0.104a 0.261±0.149a 0.330±0.117a

PIF177 0.208±0.108a 0.303±0.120a

N19

0.493±0.234a 0.323±0.172a

0.279a 普通养殖群体(C) 0.988±选系F5(A)

1.093±0.415a

注：同列相同字母表示差异不显著

0.282±0.262a 0.394±0.178a

2.3.3 珍珠层厚度与珍珠质矿化相关基因的相关性

简单相关分析的结果显示，NACREIN，MSI60和PIF177与珍珠层厚度和珍珠质重量成正相关，相关系数从0.408-0.979；而N19与珍珠性状成负相关，与珍珠层厚度和珍珠质重量的相关系数分别为-0.214和-0.270。详见表2-6。

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表2-6 马氏珠母贝珍珠性状与矿化基因表达量的相关系数 Table 2-6 Correlation coefficients of pearl traits and expression level

of mineralization genes from P. martensii

珍珠层厚度 珍珠质重量

NACREIN 0.965 0.979

MSI60 0.943 0.922

PIF177 0.408 0.460

N19 -0.214 -0.270

2.4 讨论

人工养殖游离有核珍珠的培育是通过把珠核与小片植入受体贝的核位，经过相互作用形成珍珠囊，珍珠囊分泌珍珠质形成有核珍珠，普遍认为珍珠囊细胞与贝壳外套膜上皮细胞在生理和组织上是相似的[50]，因此珍珠囊一直是国内外学者们的研究热点，特别是珍珠囊是如何形成的问题。杜晓东等[51]通过透射电子显微镜观察植核后不同发育时期珍珠囊的形成，初步认为马氏珠母贝珍珠囊表皮细胞来源于移植小片, 即移植小片的表皮细胞增殖形成了珍珠囊；在分子水平上，Erin L. McGinty 等[52]用大珠母贝和黑蝶贝异体进行移植育珠，在珍珠囊中检测物种特有珍珠质矿化基因N66和N44的表达情况，以研究供体和受体在珍珠形成过程中所起的作用，结果表明，供体贝是珍珠培育过程中生物矿化的重要贡献者；随后E.L. McGinty 等[53]以大珠母贝和黑碟贝异体移植构建实验材料，通过转录组分析受体贝和供体贝对珍珠囊中矿化相关基因表达的贡献，结果表明，供体贝的外套膜组织（小片）对珍珠囊矿化基因的表达起主要贡献。Nariaki Inoue等[54]用马氏珠母贝矿化相关基因（msi60、n16、nacrein、msi31、prismalin-14、aspein)研究了外套膜上皮细胞基因的表达模式与珍珠囊形成的联系，结果显示，外套膜矿化基因的表达不确定，在珍珠囊形成的前后表达模式不一样，并认为珍珠囊中外套膜矿化基因的表达可能受到受体贝的调节。

本实验马氏珠母贝三个群体自身同时作供体贝和受体贝，构建实验材料，检测马氏珠母贝三个群体珍珠质矿化能力的差异，并检测相关基因对珍珠性状所产生的影响。所选四个马氏珠母贝珍珠质矿化相关基因，三个基因与珍珠性状呈正相关，一个基因（N19）与珍珠性状呈负相关，Funabara D等[55]通过RNA干扰NACREIN基因的表达，结果发现珍珠层的结构发生了紊乱，因此NACREIN参与了珍珠层的形成；Asakura T等[56]研究发现MSI60具有结合钙离子的能力，Sato Y等[57]通过原位杂交研究植核后38天珍珠囊中MSI60的表达情况，发现优质珍珠中MSI60的表达量很高，因此MSI60与珍珠囊中珍珠层的形成有关；Michio Suzuki等[58]在珍珠层中发现了一种PIF酸性基质蛋白，通过免疫定位，RNA干扰和体外钙酸盐体外结晶实验，认为PIF调控珍珠层形成；而Masato Yano等[59]从珍珠层中分离出一种蛋白N19，Northern blot实验发现N19在外套膜中的mRNA表达量比在缘膜区多一些，而体外重组的N19抑制碳酸钙的结晶，说明N19存在于珍珠层并在钙化的过程中起负调控作用。

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马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析

本实验以三个马氏珠母贝群体各自同时做受体贝和供体贝为实验材料，选取四个马氏珠母贝表达量较高（与内参比），表达较稳定（个休间差异小）的基质蛋白NACREIN、MSI60、PIF177 、N19，检测植核后第210天不同群体珍珠囊中基因的表达情况，分析珍珠性状与相关基因的相关性。基质蛋白基因的筛选主要考虑如下：表达量大可能对珍珠形成的影响比重更大，并且基因表达量高使得定量更加准确。而选取植核后第210天的珍珠囊来检测珍珠质矿化基因表达量的主要考虑为：植核后贝体受到伤害恢复生长需要时间，完整珍珠囊的形成需要时间，而且珍珠质的分泌是一个相对缓慢和连续不断的过程，留有足够长的珍珠生成时间，测量更加精确，结果更加可靠。

本实验研究四个珍珠质矿化基因表达量与珍珠性状相关性，为以珍珠质分泌能力强为目标性状的马氏珠母贝分子辅助育种提供理论支持。

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3生长性状与生长相关基因表达量的相关分析

3.1实验材料

同上2.1

3.2实验方法

3.2.1马氏珠母贝三个群体生长性状的跟踪测量

植核育珠前和植核育珠后的第90天，第150天和第210天随机取三个群体各50个个体，数显游标卡尺测量壳长，壳高，壳宽，精确到0.01mm，电子天平称量壳重，总重等性状，精确到0.01g，采用M±SD统计样本，用SPSS19.0软件对数据进行分析处理，显著性检验水平为P < 0.05。

3.2.2马氏珠母贝三个群体生长相关基因的荧光定量

1、实验材料

植核育珠后第210天三个群体各随机取10个个体，每个个体取闭壳肌、鳃、肝胰腺、外套膜、性腺和足六种组织加入灭菌的抗冻管中，立即加入液氮中速冻至少30min，然后迅速转移到-80℃超低温冰箱保存备用。

2、RNA的提取 同上2.2.2 3、cDNA的合成 同上2.2.2 4、引物设计

以本实验室马氏珠母贝珍珠囊转录组数据库为基础，筛选出四个生长相关基因，转化生长因子受体I型（TGF-β receptor type-I，TβR I），表皮生长因子受体（Epithelial growth factor receptor，EGFR），生长激素诱导的跨膜蛋白（Growth hormone-inducible transmembrane protein，GHITM）和成纤细胞生长因子（Fibroblast growth factor18，FGF18），得到的部分核酸序列，用于设计荧光定量引物，引物信息如下：

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马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析

表3-1 引物信息

Table 3-1 Primers information

引物名称 TβR I-A TβR I-S EGFR-A EGFR-S FGF18-A FGF18-S GHITM-A GHITM-S ACTIN-S ACTIN-A GAPDH-S GAPDH-A

引物序列

TCCCATAATACCAAACCAAACG TGACCTCGCTCCATCAGACA GTACGATTCCCCGTTCCTCT ATGCCCCTTGGTTGTCTTTT GAAATGTTACCCGTCTGTGCC GGTGGGAATTGATACGTTGATC GGGTCATCCACGCCAGTT GAGGAGGTACGACAGCGAGTT GTGTAAGGCGGGGTTTGCT GGGTCCTTCAGCGTTAGTATCTT CACTCGCCAAGATAATCAACG CCATTCCTGTCAACTTCCCAT

219 171 113 127 产物长度 135

TM值（℃） 59 59 59 59 59 59 59 59 59 59 59 59

235

5、荧光定量PCR反应程序及体系 同上2.2.2

6、以β-actin作为内参，每组实验重复 10 次，用△CT值法进行基因相对表达量的计算，用统计软件SPSS19.0 Duncan法进行多重比较，差异显著性水平为P < 0.05。 3.2.3 生长性状与相关基因表达量的相关分析

用统计软件SPSS19.0对植核后第210天生长性状和相关基因的表达量，做简单相关分析，并对相关系数做Person检验，显著性水平为P < 0.05。

3.3实验结果

3.3.1马氏珠母贝三个群体生长的比较

从表3-2和表3-3可以看出，植核育珠后第90天到第210天，统计结果表明，选系F5（A）壳长和壳高的生长率明显大于对照群体（B）与普通养殖群体（C）。选系F5（A）具有壳长和壳高生长速度快的优势(见表3-3)。植核育珠后第210天三个群体之间的生长性状存在明显差异（见表3-2）。

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表3-2 马氏珠母贝三个群体三个时间点生长性状的测量结果 Table 3-2 Measurement results of growth traits at three diferent times

from P. martensii three populations

群体 生长阶段(天) 壳长(mm) B C A B C A B C A 表3-3 马氏珠母贝三个群体两个时间段的生长比较

Table 3-3 Compares the growth of the three populations from P. martensii at two periods 群 体

生长阶段(天) 0-90

对 照 群 体 (B)

90-210 0-90

普通养殖群体(C)

90-210 0-90

选 系 F5 (A)

90-210

2.19

3.57

0.44

4.75

4.4

2.14 4.91

1.95 4.08

0.87 2.68

4.9 5.78

4.8 6.12

1.75 5.83

1.54 6.18

0.67 2.98

5.52 5.44

5.66 5.59

壳长增长(mm) 5.08

壳高增长(mm) 5.27

壳宽增长(mm) 3.45

壳重增长(g) 7.54

总干重增长(g) 7.81

植核前

植核90天

植核210天

64.89±3.62 58.27±3.04 61.48±3.41 69.97±4.71 64.11±4.30 66.39±4.05 71.72±4.89 66.25±4.40 68.58±3.98

壳高(mm) 66.23±3.75 61.82±2.94 62.45±3.61 71.50±5.74 68.00±3.89 66.53±4.31 73.05±4.83 69.95±3.99 70.10±4.00

壳宽(mm) 22.16±1.38 20.57±1.12 21.51±1.64 25.61±1.85 23.55±1.54 24.19±1.33 26.28±1.92 24.42±1.58 24.63±1.24

壳重(g) 14.11±1.67 12.48±1.44 13.81±1.71 21.64±4.01 17.92±3.08 19.59±2.71 27.17±4.94 22.81±3.55 24.34±3.40

总干重(g) 15.25±1.79 13.83±1.52 14.83±1.82 23.06±4.19 19.42±3.30 20.96±2.88 28.72±5.23 24.22±3.78 25.78±3.58

3.3.2 生长相关基因的荧光定量结果

从表3-4中得知，TβR I、EGFR 和GHITM在对照群体中的表达量较另外两个群体高，而FGF18在选系F5中的表达水平比对照群体和普通养殖群体高，但差异不显著。总体而言，各生长相关基因在普通养殖群体中的表达水平最低。

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马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析

表3-4马氏珠母贝三个群体生长相关基因的相对表达量（2-△CT） Table 3-4 relative expression of growth-related genes at the three

populations from P. martensii (2-△CT)

群 体 对 照 群 体 (B) 普通养殖群体(C) 选 系 F5 (A)

TβR I 3.21±1.62a 1.66±0.42a 2.40±1.84a

EGFR 5.25±2.05a 3.56±2.03ab 2.34±2.35b

GHITM 3.47±1.09a 2.43±0.88b 1.99±0.65b

FGF18 1.40±0.44a 1.05±0.26a 1.48±0.55a

注：同列有相同字母表示差异不显著

3.3.3 生长性状与生长相关基因表达量的相关性

相关分析结果表明，四个侯选生长基因的表达量与壳长、壳高、壳宽、壳重、总重、总干重、软体干重和软体湿重8个生长性状均呈正相关，相关系数为0.387-0.998，其中TβR I与壳长的相关水平显著（P < 0.05），总体上TβR I与各生长性状的相关系数最高，其次是GHITM和EGFR，而FGF18与各生长性状的相关系数最低。详见表3-5。

表3-5 马氏珠母贝生长性状与生长相关基因表达量的相关系数

Table 3-5 Correlation coefficient of growth traits and growth-related genes from P. martensii

壳 长 壳 高 壳 宽 总 重 总 干 重 壳 重 软体干重 软体湿重

TβR I 0.998 0.898 0.922 0.973 0.989 0.989 0.965 0.95

＊

EGFR 0.646 0.89 0.862 0.768 0.711 0.709 0.787 0.819

GHITM 0.741 0.943 0.922 0.846 0.798 0.796 0.862 0.888

FGF18 0.712 0.387 0.44 0.581 0.647 0.65 0.555 0.509

注：＊表示相关水平显著（P < 0.05）

3.4 讨论

重要经济贝类遗传育种的目标在于不断提高和稳定经济性状出现的概率。许多经济性状是数量性状，这些性状受多种基因共同影响，在动植物遗传育种中通过构建高密度分子标记遗传连锁图，对重要数量相关性状QTL进行精细定位，确定其在染色体上的位置和效应，对遗传改良具有重要意义[60]。遗传连锁图可应用于分子标记辅助育种，是利用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段而进行的选育，由于遗传标记的等位基因变异与经济性状的表型变异相连锁，因此分子标记可以提供与经济性状

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相关的 DNA 水平上的遗传信息[61]。马氏珠母贝中QTL定位也有研究，邓岳文等[62]利用自主开发的50个马氏珠母贝EST-SSR标记，对马氏珠母贝快速生长选育群体F4 90个个体基因组DNA进行PCR扩增，然后使用统计软件SPSS对50个微卫星标记与马氏珠母贝总重、壳长、壳高、壳宽和韧带长的相关性进行分析，结果显示，共有18个微卫星标记与马氏珠母贝的5个生长性状相关，9个标记与总重显著相关（P < 0.05），12个标记与壳长显著相关，其中3个是极显著相关；14个位点与壳高显著相关，其中3个为极显著相关；6个位点和壳宽显著相关，其中一个标记为极显著相关；5个标记与韧带长显著相关，对同一标记不同基因型间进行多重比较，找到了与5种性状相关的基因型。邱樱[63]也通过EST-SSR标记与相关性状的关联分析，得到了马氏珠母贝2个与生长性状显著相关的微卫星标记，一个微卫星标记与壳高和总重呈显著相关，另一个微卫星标记与壳宽和总重呈现显著相关。

数量性状的QTL定位归根结底要对功能基因进行研究，寻找与性状连锁的基因，可以更直接有效地研究经济性状与基因的相关性。MSTN、TGF-β、EGF、FGF、GHITM等生长因子及其相关信号通路上的其他因子控制着肌肉，上皮，神经等的生长与发育，因此是生长性状相关的侯选基因。这些生长因子的共同特征是在细胞生长过程中介导细胞增殖[47]。目前贝类生长相关基因的研究报道还比较少，Hu等[64]和 Kim等[65]分别克隆了栉孔扇贝和海湾扇贝的MSTN基因，荧光定量分析基因在各组织中的表达，发现MSTN在闭壳肌中的表达量最高；Akalal等[66]从海兔中鉴别出贝类生长因子MDGF，在神经发生的胚胎期至变态后表达量上升，在成体中枢神经系统没有表达，认为它在神经发生中与神经细胞增殖相关；Willem等[67]在静水椎实螺中发现了类似EGF(L-EGF)因子，发现它在神经的发生中起作用。马氏珠母贝方面，Zhou等[68]对生长相关TGF-β信号通路上的Smad3和激活素受体I型基因进行克隆和鉴定，发现这两个基因在壳的形成和修复过程发挥重要作用，Zhou等[69]还研究了马氏珠母贝BMP2和Smad3基因表达的关联性，结果显示，BMP2和Smad3在mRNA水平的表达显著相关；而张立娟等[70]则用外源的生长激素处理马氏珠母贝，结果显示，激素处理提高了马氏珠母贝胰岛素相关受体基因的表达量，这与其在软体动物中作为胰岛素样生长因子受体的作用相一致。

本部分实验从珍珠囊转录组Unigene序列功能注释的数据库中，筛选生长相关侯选基因，在育珠期第210天检测马氏珠母贝三个群体四个基因在贝体中的整体表达水平，研究四个基因表达量与生长性状的关联性，实验结果显示四个基因与马氏珠母贝各生长性状呈正相关，说明在马氏珠母贝中这些基因对生长起正调控作用。马氏珠母贝三个群体存在生长差异是本部分实验得以进行的基础，为查找与性状差异相关的基因提供前提条件。本实验只检测马氏珠母贝生命周期中一个时间点上相关基因与生长性状的关系，对马氏珠母贝生命过程中各个时间点的检测，将有利于深入了解相关基因在各个时期对生长所产生的影响。

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马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析

4马氏珠母贝生长相关基因的克隆和组织表达研究

为较深入地研究马氏珠母贝生长相关基因和蛋白的结构与功能，用RACE技术克隆得到基因的cDNA全长，用软件分析预测基因和蛋白质的结构和功能，以及进行氨基酸序列同源性比对和进化分析，并检测基因在各组织中的表达。

4.1实验材料

4.1.1实验动物和菌种

本实验材料来自湛江市徐闻县西连镇大井村养殖基地，2龄贝，壳长5-6cm，取外套膜后立即放入液氮中冷冻保存。用于制作感受态细胞的细菌为E.coli DH5α，含 DH5α的菌种或感受态于含15%灭菌甘油的LB（Amp-）培养液中，-80℃保存备用。 4.1.2主要仪器设备

表4-1 本实验所用仪器设备

Table 4-1 The main instruments and equipments in this reseach

仪器名称 样品组织破碎仪 PCR仪 电流仪 水平电泳槽 凝胶成像系统 核酸定量仪 高速冷冻离心机 超净工作台 恒温金属浴

生产制造商 德国QIAGEN 美国Bio-rad 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂 美国Bio-rad Thermo Scientific 德国eppendorf

上海上净净化设备有限公司 上海一恒科技有限公司

型号 TissueLyser II S1000 DYY-II2 DYCP-32 170-8170 NanoDrop 2000c 5804R CA-920-3 TU-100 GZX-9240MBE SPX-250 SHZ-C MDF-U73V 各种规格 DK-8D型 SYQ-MDX-280 7500 JA2003 111-101DT

数显鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 生化培养箱 振荡恒温摇床 超低温冰箱 微量移液枪 恒温水浴锅 蒸汽高压灭菌锅 荧光定量PCR仪 电子天平 数显游标卡尺

上海跃进医疗器械厂

上海博讯实业有限公司医疗设备厂 日本SANYO公司 德国eppendorf 上海一恒科技有限公司 上海申安医疗器械厂 ABI Applied Biosystems 上海良平仪器仪表有限公司 桂林广陆数字测控股份有限公司

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4.1.3主要试剂

表4-2 本实验主要试剂

Table 4-2 The main reagents in this reseach

试剂名称

焦碳酸二乙脂（DEPC）

生产商

生工生物工程（上海）有限公司

Trizol Reagent RNA Invitrogen公司 SMART? RACE cDNA Amplification Kit 美国 Clontech公司 M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 宝生物工程 (大连) 有限公司 TaKaRa Ex Taq TaKaRa Ex Taq Buffer TaKaRa LA Taq TaKaRa LA Taq Buffer dNTPs

TaKaRa rTaq mix 琼脂糖(Agrose)

Thermo Gene JET Gel Extraction Kit pMD19-T simple Vector DNAMarker

三氯甲烷（Trichloromethane） 异丙醇（iso-Propyl alcohol ） 无水乙醇（absolute alcohol） 4S Green Nucleic Acid Stain

DyNAmo? ColorFlash SYBR? Green qPCR Kit

宝生物工程 (大连) 有限公司 宝生物工程 (大连) 有限公司 宝生物工程 (大连) 有限公司 宝生物工程 (大连) 有限公司 宝生物工程 (大连) 有限公司 宝生物工程 (大连) 有限公司 生工生物工程（上海）有限公司 Thermo Scientific

宝生物工程 (大连) 有限公司 宝生物工程 (大连) 有限公司 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂

生工生物工程（上海）有限公司 Thermo Scientific

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马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析

4.1.4主要的溶液和培养基及配制方法

表4-3 本实验主要溶液和培养基及配制方法

Table 4-3 The main solution, culture medium and preparation method in this reseach 溶液名称 5×TBE

配制方法

Tris 54g，硼酸 27.5g，0.5mol/L EDTA (pH 7.9) 20mL， 加水定容至1L

加灭菌双蒸水配制成100mg/mL的母液，分装至每管1mL，-20℃保存备用

1.1g无水CaCl2溶于水后定容至100mL，0.22μm微孔滤器过滤，4℃保存

氨苄青霉素母液

0.1 mol/L CaCl2

15%甘油的0.1 mol/L 按体积比，甘油：0.1mol/L 氯化钙=3:19配制，高温高压灭菌备CaCl2 用 无RNA酶水

双蒸水加入DEPC，使DEPC的终浓度为1%，密封，室温过夜，

121℃高压灭菌，30min，彻底分解DEPC 按体积比，无RNA酶水：乙醇=1:3配制

酵母提取物（Yeast extract）5g，胰蛋白胨（Tryptone）10g，氯化钠（NaCl）10g，定容至1L，高温高压灭菌，4℃保存备用

无RNA酶75%乙醇

LB（Amp-）培养液

酵母提取物（Yeast extract）5g，胰蛋白胨（Tryptone）10g，氯

LB（Amp-）固体培养基 化钠（NaCl）10g，琼脂粉15g，定容至1L，高温高压灭菌，倒

平板，4℃保存备用 LA（Amp+）培养液

LB（Amp-）培养液冷却至55-60℃加入100mg/mL的Amp，使 培养液中Amp的终浓度100μg/mL，4℃保存备用

LB（Amp-）固体培养基冷却至55-60℃加入100mg/mL的Amp，使培养液中Amp的终浓度100μg/mL，倒平板，4℃保存备用

LA（Amp+）固体培养基

4.2实验方法

4.2.1引物的设计

通过cDNA末端快速扩增技术得到基因的全长，RACE引物信息如表4-4：

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马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析

A B

C D

E F

图4-1 马氏珠母贝四个生长相关基因5’和3’片段扩增产物电泳图（A-F） Fig. 4-1 Electrophoresis of four growth related genes 5 'and 3' fragment

amplification productions from P. martensii (A - F)

4.3.2 生长相关基因的序列分析

通过RACE技术得到了四个与马氏珠母贝生长相关的基因的cDNA全长，通过

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软件预测了解基因的基本特征：

（1）TβR I（转化生长因子-β受体I型）全长为2210bp，5’ UTR为45bp，3’ UTR为596bp，包括27个poly(A)尾巴，开放阅读框（ORF）1569bp，编码522个氨基酸。在线软件预测蛋白质的等电点（PI）为8.70，分子质量为59.74KD；TβR I由信号肽（1-22aa）、细胞外区（23-133aa）、跨膜区（134-156aa）和细胞内区（157-522aa）四部分组成；在23-106aa处有激活素I型受体区，在189-215 aa处存在GS motif，在217-508aa有蛋白酶结构域，如图4-2A和4-2B所示。

（2）EGFR（表皮生长因子受体）全长为4934bp，5’ UTR为250bp，3’ UTR为250bp，包括28个poly(A)尾巴，开放阅读框（ORF）4269bp，编码1422个氨基酸，在线软件预测蛋白质的等电点（PI）为6.19，分子质量为159.76KD；由N端的细胞外区（1-803aa）、跨膜区（804-826aa）和C端的细胞内区（827-1422aa）三部分组成；细胞外区包含两个可以形成β螺旋的富含亮氨酸的结构域（9-127aa和322-441aa），三个可以形成二硫键的富含半胱氨酸的结构域（133-300aa、469-595aa、613-715aa）；细胞内区包含一个酪氨酸激酶区（872-1128aa），如图4-3A和4-3B所示。

（3）生长激素诱导的跨膜蛋白（GHITM）全长为1468bp，5’ UTR为62bp，3’ UTR为389bp，包括27个poly(A)尾巴，开放阅读框（ORF）1017bp，编码338个氨基酸，在线软件预测蛋白质的等电点（PI）为9.87，分子质量为35.48KD，在113-329aa处存在Bax1-I结构域，如图4-4所示。

（4）成纤细细胞生长因子18（FGF18）全长为2534bp，5’ UTR为248bp，3’ UTR为1572bp，包括29个poly(A)尾巴，开放阅读框（ORF）714bp，编码237个氨基酸，包含N端（1-24aa）24个氨基酸残基的信号肽，在线软件预测蛋白质的等电点（PI）为11.28，分子质量为28.09KD，蛋白在45-178aa处存在FGF家族共有的结构域，如图4-5所示。

四个基因的cDNA全长已经提交到GeneBank，登录号：KJ579133（TβR I），KJ579134（EGFR）， KJ579135（GHITM），KJ579136（FGF18）。

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马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析

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图4-2A 马氏珠母贝TβR I cDNA序列及编码的氨基酸序列

Fig. 4-2A The full length cDNA and amino acid sequence of TβR I from P. martensii

左边的数字表示核苷酸和氨基酸的位置，有框的核苷酸分别表示起始密码子和终止密码子，斜体：信号肽(1-22aa)，横线：激活素受体结构域(23-106aa)，波浪线：跨膜区，小段线：细胞外区，灰色底纹：CCX5C结构 Numbers on the left represents the position of the nucleotide and amino acid, respectively, nucleotide with a frame represents start codon and the stop codon, in italic: signal peptide (1-22 aa), horizontal: Activin receptor domain( 23-106 aa), wavy lines: the transmembrane region, small pieces of wire: extracellular region, shades of gray: CCX5C structure.

图4-2B 马氏珠母贝TβR I蛋白质结构示意图

Fig. 4-2B Protein structure diagram of TβR I from P. martensii

Activin receptor: 激活素受体区(23-106 aa), GS motif: GS 模板(189-215 aa),

Protein Kinase domain: 蛋白酶结构域(217-508 aa)

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/nmg6.html