新型壳聚糖止血粉止血作用的实验研究

中国修复重建外科杂志2009年11月第23卷第11期

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新型壳聚糖止血粉止血作用的实验研究

尹刚1 侯春林1 刘万顺2 韩宝芹2 魏长征1

刘双利1 郭兴锋1 于兵3

【摘 要】 目的 探讨通过剂型改造和结构改变制备的一种新型壳聚糖止血粉的止血作用。 方法 取成年SD大鼠24只，雌雄不限，体重210～240 g，制备肝中叶切除出血模型，根据切口使用止血材料不同随机分为3组（n=8），A1组300 mg云南白药，B1组300 mg pH6.5的新型壳聚糖止血粉，C1组300 mg pH7.5的新型壳聚糖止血粉，记录出血时间及出血量。采用Lee等方法进行体外促凝血实验。分别取0.2 mL终浓度为0.2 mg/mL的云南白药（A2组）、pH6.5的新型壳聚糖止血粉（B2组）及pH7.5的新型壳聚糖止血粉（C2组）溶液，与2 mL新西兰兔耳中央动脉血混匀，记录凝血时间。并取B2组及C2组壳聚糖血凝块进行扫描电镜观察。 结果 A1、B1及C1组出血时间分别为（292 ± 31）、（261 ± 23）、（224 ± 28）s，出血量分别为（1.63 ± 0.21）、（1.47 ± 0.18）、（1.18 ± 0.17）g；B1组及C1组出血时间及出血量与A1组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05） ；且C1组优于B1组（P < 0.05）。A2、B2及C2组凝血时间分别为（653 ± 41）、（255 ± 20）、（202 ± 11）s，B2、C2组与A2组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）；且C2组优于B2组（P < 0.05）。扫描电镜下可见B2组及C2组血细胞均聚集于壳聚糖周围。 结论 pH7.5的新型壳聚糖止血粉具有良好的止血作用。【关键词】 壳聚糖 止血粉 止血作用 中图分类号： R318.08 R619.1 文献标志码：A

EXPERIMENTAL STUDY ON HEMOSTASIS OF A NEW CHITOSAN HEMOSTATIC POWDER/YIN Gang1, HOU Chunlin1, LIU Wanshun2, HAN Baoqin2, WEI Changzheng1, LIU Shuangli1, GUO Xingfeng1, YU Bing3. 1Department of Orthopaedics, Changzheng Hospital of the Second Military Medical University, Shanghai, 200003, P.R.China; 2Biotemed Biological Material Co.Ltd of Qingdao; 3Department of Cell Biology of the Second Military Medical University. Corresponding author: HOU Chunlin, E-mail: chunlin_hou@

Objective To study hemostasis of a new chitosan hemostatic powder. Methods Twenty-four adult 【Abstract】

SD rats were made the models of liver injury, male or female, and weighing 210-240 g. They were divided into three groups randomly (n=8) depending on different hemostatic powders. The incision of the liver was treated with 300 mg Yunnan baiyao (group A1), chitosan hemostatic powder of pH6.5 (group B1) and pH7.5 (group C1), respectively. The bleeding time and bleeding amount were recorded. In vitro, with the modi ed Ree-White method, 2 mL artery blood from New Zealand white rabbit was added into the 0.2 mL solution of Yunnan baiyao, chitosan hemostatic powder of pH6.5 and pH7.5 (concentration of 0.2 mg/mL), respectively. The blood coagulation time was recorded. The chitosan blood clots of group B2 and group C2 were observed with scanning electron microscopy (SEM). Results The bleeding time of group A1, group B1 and group C1 was (292 ± 31), (261 ± 23), and (224 ± 28) s, respectively, the bleeding amount was (1.63 ± 0.21), (1.47 ± 0.18), and (1.18 ± 0.17) g, respectively, showing statistically signi cant differences between groups B1, C1, and group A1 (P < 0.05), between group C1 and group B1 (P < 0.05). The blood clotting time of group A2, group B2, and group C2 was (653 ± 41), (255 ± 20), and (202 ± 11) s, respectively, showing statistically signi cant differences between groups B2, C2, and group A2 (P < 0.05), between group C2 and group B2 (P < 0.05). The SEM showed that the blood cells of group B2 and group C2 gathered around the chitosan. Conclusion Chitosan hemostatic powder of pH7.5 has good hemostasis. Chitosan Hemostatic powder Hemostasis【Key words】

出血是创伤患者死亡原因之一，快速、有效地控制出血可明显减少死亡率。外科手术是快速、有效控制出血的方法之一，但单纯的外科手术不能完全控制出血，止血材料的使用可明显减少出血量。壳聚糖具有

1第二军医大学附属长征医院骨科200003）2 青作者单位：（上海，；

3第二军医大学细胞生物学教研室岛博益特生物材料有限公司；

通讯作者：侯春林，教授，博士导师，研究方向：创伤骨科与修复重

E-mail: chunlin_hou@建、生物材料，

无毒性、无刺激性、良好组织相容性、抗菌、消炎、止血、减少创面渗出和促进创伤组织再生、修复、愈合的作用，易于形成凝胶以及可自然降解，可作为良好的止血材料 [1-4]。我们与青岛博益特生物材料有限公司共同研究，通过剂型改造和结构改变将壳聚糖制作成粉剂，并加入Ca2+及Zn2+，研制出一种新型壳聚糖止血粉。通过动物实验及体外促凝血实验，为该新型壳聚糖止血粉临床应用提供实验依据。

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Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, November 2009, Vol. 23, No.11

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器

健康成年SD大鼠24只，雌雄不限，体重210～240 g；健康成年新西兰兔8只，雌雄不限，体重1.9～2.1 kg；均由第二军医大学动物实验中心提供。

pH6.5与pH7.5的新型壳聚糖止血粉，由第二军医大学附属长征医院与青岛博益特生物材料有限公司研制；戊巴比妥钠（上海科丰化学试剂有限公司）；云南白药（云南白药集团股份有限公司）。LE2202S型电子天平（Sartorius公司，德国）；XL-30ESEM型扫描电镜Philips公司，荷兰）。1.2 实验方法

1.2.1 出血时间及出血量测定 根据使用止血材料不同将24只大鼠随机分成3组，每组8只。A1组为云南白药对照组，B1组为pH6.5的新型壳聚糖止血粉，C1组为pH7.5的新型壳聚糖止血粉。根据Matsuoka等

[5]

方法制备肝中叶切除出血模型。腹腔注射3%戊

巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，于肋弓下沿腹中线作长约2 cm纵行切口，沿腹中线剪开腹肌，挤压腹部将肝中叶从切口处挤出，吸干肝脏周围腹腔液后将称重后的无菌纱布垫于肝中叶下，于肝中叶下缘以上2 cm处快速切除肝中叶。根据分组立即均匀涂抹止血材料300 mg，并开始计时，直至出血停止，以无鲜红血液渗出为出血停止标准，观察各组止血材料凝固过程，记录出血时间及出血量。出血时间为切除肝中叶开始至出血停止，出血量为切除前后无菌纱布重量差。1.2.2 体外促凝血测定 采用Lee等[6]方法测定。各取1 mg云南白药、pH6.5的新型壳聚糖止血粉、pH7.5的新型壳聚糖止血粉，分别置于5 mL 0.01 mol/L PBS溶液中，终浓度为0.2 mg/mL，分别为A2、B2及C2组。各组取0.2 mL溶液置于直径1 cm、长10 cm的玻璃管中，于37℃水浴箱中水浴2 min。于8只新西兰兔耳中央动脉抽取6 mL动脉血，分别于上述试管中加入2 mL兔血，混合均匀后水浴，每隔30 s倾斜玻璃管，至血液凝结不流动，记录凝血时间，每组测量8个样本。

1.2.3 扫描电镜观察 取上述方法获得的B2组及C2组壳聚糖血凝块，以2%戊二醛固定2 h，经干燥、样品装台粘胶、表面导电处理后，扫描电镜观察。A2组由于血液未凝固成块，未行扫描电镜观察。1.3 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采q检验，P值 < 0.05为有统计学意义。

2 结果 2.1 大体观察

B1组及C1组新型壳聚糖止血粉均匀涂抹切口后，快速聚集的血液在创面形成一层凝胶状保护膜；A1组云南白药涂抹后未形成凝胶状保护膜。2.2 出血时间及出血量测定

A1、B1及C1组出血时间分别为（292 ± 31）（、261 ± 23）、（224 ± 28）s，出血量分别为（1.63 ± 0.21）、（1.47 ± 0.18）、（1.18 ± 0.17）g。B1组及C1组出血时间及出血量与A1组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）；且C1组优于B1组（P < 0.05）。2.3 体外促凝血测定

B2组及C2组血液快速形成血凝块，A2组血凝块形成较慢。A2、B2及C2组凝血时间分别为（653 ± 41）、（255 ± 20）、（202 ± 11）s，B2组及C2组凝血时间与A2组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）；且C2组优于B2组（P < 0.05）。2.4 扫描电镜观察

扫描电镜下可见B2组和C2组血细胞均聚集于壳聚糖周围，血细胞与壳聚糖之间连结紧密，且C2组血细胞与壳聚糖之间的连接较B2组更多、更紧密（图1）。

图1 壳聚糖血凝块观察（扫描电镜× 500）

B2组

C2组

Fig.1 Observation of chitosan blood clots (SEM × 500)

Group

B2

Group C2

3 讨论

自Malette等（1983）报道了壳聚糖止血功能的研究以来，学者们开始尝试采用壳聚糖研制止血敷料。2002 年11月，HemCon 绷带获美国FDA认可，临床试验证明壳聚糖敷料较标准纱布敷料能显著减少出血量，降低死亡率 [7]。国内也陆续报道壳聚糖止血敷料的止血效果[8-9]。但壳聚糖止血敷料有一定的局限性，如易与伤口粘连影响换药、止血时间较长、需加压易致伤口血液循环较差等。我们通过对壳聚糖的改性，将壳聚糖制成粉剂，从而扩大壳聚糖应用范围[10]。

（

中国修复重建外科杂志2009年11月第23卷第11期

我们的实验观察到新型壳聚糖止血粉与大鼠肝中叶切面血液接触后，血液能快速聚集，在创面形成一层凝胶状保护膜，同时血液快速凝固，缩短出血时间和减少出血量；体外凝血实验示新型壳聚糖止血粉可促进血液快速凝固形成血凝块，云南白药组血液则凝结较慢。扫描电镜观察显示，血细胞聚集在壳聚糖周围，血细胞与壳聚糖间有紧密连接。我们认为新型壳聚糖止血粉的止血机制可能有以下几方面：①壳聚糖对RBC的聚集作用。由于壳聚糖是自然界唯一阳离子碱性多糖，与RBC表面的阴离子作用产生RBC凝集。侯春林等[1]通过观察壳聚糖对RBC的聚集作用，提出在壳聚糖促RBC聚集作用中，阳离子效应是重要因素之一。此外，壳聚糖的氨基有吸附脂质能力[11]，而RBC细胞膜上脂质比重较大，通过壳聚糖的氨基与胞膜上脂质的吸附，促进其聚集达到止血作用。②壳聚糖对PLT具有黏附和聚集作用。Wu等[12]与Chou等[13]研究发现，壳聚糖可明显促进PLT黏附与聚集，且随浓度增加，作用越强。同时壳聚糖还能促进PLT中PDGF-AB和TGF-β[14]1 表达，最终达到促进PLT黏附与聚集作用。③新型壳聚糖止血粉中的Ca2+及Zn2+，一方面可增加PLT内Ca2+

浓度，另一方面通过其分子链上大

量氨基和羟基基团的亲水性，增加纤维蛋白原吸附的数量，从而激活补体系统促进PLT黏附和血栓形成

[15]

。

④新型壳聚糖止血粉与血液接触后能快速形成凝胶状，起物理屏障作用，阻止切口血液渗出。而云南白药的止血机制主要是促进PLT聚集，增强PLT活化百分率及PLT表面糖蛋白的表达，通过PLT途径达到止血作用[16-17]。同时新型壳聚糖止血粉具有可降解性、防粘连、抑制成纤维细胞生成及抗菌等作用[18-20]，以上特性拓展了其应用领域，不但可以应用于体外，也可应用于体内减轻粘连等并发症的发生。

综上述，新型壳聚糖止血粉具有良好的止血作用，是一种有效、安全、可降解的生物止血材料，且pH7.5的新型壳聚糖止血粉止血效果更好。但本次实验仅观察了两种pH的新型壳聚糖止血粉止血作用，关于pH、添加成分不同及使用剂量对止血作用的影响，以及止血机制、生物相容性以及创面修复作用等问题，均有待进一步深入研究。

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（收稿：2009-05-18 修回：2009-08-16）

（本文编辑：刘丹）

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/nkfj.html