多靶点pCRISPR载体改良版(单子叶植物用)使用方法2014-10-26(P)副

CRISPR/Cas9-based genome editing technology

A CRISPR/Cas9 vector system for multiplex targeting of gene

sites in monocot plants

亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室

华南农业大学 生命科学学院 刘耀光课题组

（ygliu@scau.edu.cn）

1. CRISPR/Cas9核酸酶切靶序列原理图

Cas9 nucleaseRuvC-like domainHNH domainTarget Site PAMNGGNNNNNNNNNNNN-3’5’ NNNNNNNNNNNN3’ NNNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCleavage siteNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenome NCCNNNNNNNNNNNN-5’sequence5’-G/ANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAACUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUUCGAUAGAACUUGAAAAAGUGGCACCGAAAUUUUU-3’CGUGGCUG

1

2 相关载体图谱

2.1 CRISPR/gRNA vectors (单子叶植物用) (sgRNA: single guide RNA,简称gRNA)：

pUC18 backboneAmprBsaIpYLgRNA-OsU3/LacZgRNAdownIstream primersMluE.coliPrgRNABamHILacZU3/6up stream primersOsU3BsaI(2)BsaI(1)HindIIIpUC18 backboneAmprBsaIpYLgRNA-OsU6a~c ; -OsU3gRNAdownstream primersgRNABamHIOsU3, OsU6a,b,c U3/6up stream primersBsaI(2)BsaI(1)HindIIIBsaI cutting :NNNggtctcNNNNNNN-33-NNNccagagNNNNNNNRice small nuclear RNA promotersLacZOsU3Transcription initiation sitesGGCAGCCGGTTGTCAG BsaI(1)pUC18 backboneOsU6aOsU6bOsU6cagagaccTCTGA----GCGTCggtctcaGTTTtctctggAGACT----CGCAGccagagaCAAABsaI(2)gRNA

注：用载体骨架长片段隔开U3/U6启动子和gRNA区可避免未切断质粒被PCR扩增（短时延伸20秒)见后面）。这些质粒在E.coli DH10B繁殖。

2.2 CRISPR/Cas9双元载体(单子叶植物用)

pYLCRISPR/Cas9-MH，原命名pYLCRISPR/Cas9-MTmono (M=monocot; H=HPT，抗

潮霉素基因)

pYLCRISPR/Cas9-MB (B=Bar, 抗草苷膦基因)

本套载体系统的pCas9为本实验室设计合成的植物优化密码子基因。双元载体骨架（LB—RB非T-DNA序列）为pCAMBIA-1300(ACCESSION: AF234296)

与以前的载体相比，这2个载体改造了原来的融合型ccdB即LacZ/ccdB为ccdBs(shorten

ccdB,即删除了LacZ序列)及其相对方向反过来，其它部分不变。

2

注： 这些质粒保存在 E. coli TOP10F’(LacIq) 菌株繁殖，以使ccdB(大肠杆菌致死基因)能够被LacIq 产生高水平阻碍蛋白抑制其表达。

(Nuclear Localization Signal)NLSNotIPubiNLSpCas9BsaI(B-L)BsaI (B-R)ccdBsAscITnosRBNotIPCR/Sequencing primer (SP-ML, 原命名SP2)GCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAGCACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGAGAGACCTCTGAAG(ccdBs,657bp)GAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGGCGCGCCTCTCGAGCTAGCGGCCGCATGCATCGATCTCCTACATCGTATAAATTAGCCTATACGAAGTTATTGCATCTATGTCGGGPCR/Sequencing primer (SP-R, 原命名SP1):P35:HPTP35:Bar

pYLCRISPR/Cas9-MH (~16.5kb)LBKanrpVS1repliconpBR322 oripBR322 bornNLSNotIPubiNLSpCas9BsaI(B-L)BsaI (B-R)ccdBsAscITnosRBNotIpYLCRISPR/Cas9-MB (~16.5kb)LBKanrpBR322 oripVS1repliconpBR322 bornAscI B-L BsaI BsaI B-R AscI NotI CCCGACATAGATGCAATAACTTC-3

3. 基因组靶位点选择和双链接头设计 3.1 靶位点选择

（1）在目标区如果能够找到NGG上游第20碱基是A（用U3启动子）或G (用U6a~c启动子）的序列 (A，G分别为U3和U6启动子的转录起始碱基），优先选为靶序列

19nt如果这里存在4碱基酶切位点，有利于检测打靶效果PAM5-NNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNN-3G靶位点3

19nt接头正向引物19nt5-gccGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’5-ggcANNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’3-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’反向引物合成接头的形式（左：连接U3启动子；右：连接U6a启动子）

注意：接头正向引物F和反向R命名命名是根据靶点在gRNA表达盒的连接方向决定，不是基因方向决定，否则这些引物用于检测阳性克隆时容易搞错方向; 另外注意设计引物（尤其反向引物）时的5’---3’方向。

（2） 如果在NGG上游第20碱基不是A或G，可选20碱基为靶序列（参考Kabin Xie and Yinong Yang， 2013， Molecular Plant)合成接头的形式

PAM5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNN-320nt20nt5-gccGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-33-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5（连接U6a启动子）

也就是说，所用启动子的转录起始点与NGG上游第20碱基相同的靶点就是19碱基(19+A/G=20)，不相同的靶点就是20碱基。

（3）为了提高突变效率，可以对一个目的基因设计2个靶点(尤其只有一个靶基因)。建议在ORF 5’区和功能结构域各设计1个靶点，使之任何1个靶点的突变都可以产生功能缺失，或2个靶点之间的序列被敲除。靶点序列GC%偏高可提高打靶效率，因此靶点最好含有11-14个C/G（包括U6转

录起始点G）。

几个靶位点设计例：

起始密码PAMTTGCGAGCGAGATCGAGCGATGGCGACGGGG-3Cas9切点外显子切点TAAGAGCATAAGAACGGCGTTAAAAGGGTATGATAATGCAGTATGGTTA-3内含子左图：切点在起始密码附近或尽量在ORF上游，或在特定的功能域 (可能引起密码子缺失和移码)

右图：切点在外显子末端或前端（可能引起移码，或内含子识别位点缺失使内含子不被剪切）

（4）靶点特异性检查：虽然对植物基因打靶的特异性不是重要的问题（万一产生有负面作用的非特异打靶，把突变体与原受体亲本杂交（和回交）就可分离排除非特异打靶位点），但应该将候选靶序列+NGG（上下游加几十碱基）对目标基因组做Blast (选Somewhat similar sequences (blastn)，避免在靶序列

4

3’端+NGG与其它功能基因和基因组序列有相似性。但是打算用一个靶序列敲除2个或以上的同源基因时，就选择几个目标基因完全相同的区域为靶位点。

3.2 靶位点接头引物设计例

ExonborderIntron5’-gcctacggccatggtaagtgcccccatcctcttctacccctttgattt-3’3’-ggtaccattcacgggggtaggag-5’PAMForU3-gRNA20bp20bp5’-ggcAgaggatgggggcacttacca-3’3’-ctcctacccccgtgaatggtcaaa-5’19bp5’-gccGaggatgggggcacttacca-3’3’--tcctacccccgtgaatggtcaaa-5’5’-gttGaggatgggggcacttacca-3’3’--tcctacccccgtgaatggtcaaa-5’5’-tcaGaggatgggggcacttacca-3’3’--tcctacccccgtgaatggtcaaa-5’ForU6a-gRNAForU6b-gRNAForU6c-gRNA

4. 多靶点pYLCRISPR/Cas9-MH (B)载体构建

4.1 gRNA表达盒构建示意图

BsaI(1)U3BsaI(2)pUC8 backbonegRNABsaIdigestionTarget-1 (T1)U3gRNAligationU3gRNABsaI(B1’)PCRU3gRNABsaI(B2)Nested PCRBsaI(B1’)U3gRNA

BsaI(B2)

4.2 靶点引物接头与gRNA表达盒的实际连接方式和扩增

为了提高接头连接效率，使用较高浓度（0.05-0.1 ?M）的靶点接头，实际上大部分产生线性单端连接，而环状(双端)连接较少。另外，过度酶切，星活性，过度连接等可能产生破坏的平滑末端，有可能连接产生双接头产物或的空载产物（下图的产物IV和产物V）。连接接头后，有3种方法扩增gRNA表达盒片段：（1）直接用位置特异引物做一轮PCR扩增; （2）做2轮巢式PCR，第一轮PCR用通用的

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U-F/gRNA-R做1个反应，第二轮用位置特异引物扩增；（3）做2轮巢式PCR，第一轮PCR做2个反应，分别用U-F/接头反向引物，和用接头正向引物/gRNA-R；第二轮为Overlapping PCR,用位置特异引物扩增出表达盒产物。方法（1）效果不那么稳定，且不能避免扩增下图的产物IV和产物V。方法（2）的扩增效果好且稳定，但同样不能避免扩增产物IV和产物V。方法（3）虽然第一轮PCR需要做2个反应，但效果最好且能避免扩增产物IV和产物V，因此推荐使用方法（3）。下图为方法（3）示意图。

U3/6ProNickTarget adaptergRNAregionI Two BsaI-cut ends are linked to an adapter II III IV V Two BsaI-cut ends are linked to different adapter Two adapter ends of product s II & III are polished to blunt and linked to produce IVTwo BsaI-cut ends are polished to blunt and linked together Forward adapter Reaction 2primer/gRNAdownstream primerFirst PCR (2reactions):U3(6)upstream primer U-F/Reverse adapter primerReaction 1U-FIIIIV The product IV with doubled target sequence are amplified into two desirable fragments II & III, and the product V is not amplified. III gRNA-RTake 0.1 ?l Nested PCR:AnnealingExtensionSite-specific primer (Bn’)BsaIPCRBsaIBsaISite-specific primer(Bn+1)BsaI

在第一轮PCR加热过程中（73-75度），有缺口的引物（Tm值低于U3/6和gRNA序列）先解离， U3/6和gRNA序列3’端（未解离）立即延伸补平，产生接头引物互补结合位点。

4.3 gRNA表达盒扩增引物

第一轮PCR扩增引物（所有gRNA表达盒共用）：

U-F: 5-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3; gRNA-R: 5-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3

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第二轮PCR扩增引物（使用策略I Golden Gate ligation的位置特异gRNA表达盒专用）：

（B1’, B2, B2’, B3, B3’等表示各连接点位置； ctcg, tcag等表示Bsa I 切点粘性末端的正链序列;相同颜色的BsaI切点粘性末端是可特异配对连接的互补末端）

靶点1（T1）： SpeI

（new）Uctcg-B1’: TTCAGAggtctcTctcgACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3（U3/6上游引物） gRctga-B2: AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3（第二轮gRNA下游引物） T2:

Uctga-B2’: TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRaaga-B3: AGCGTGggtctcGtcttGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 T3:

Uaaga-B3’: TTCAGAggtctcTaagaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRgact-B4: AGCGTGggtctcGagtcGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 T4:

Ugact-B4’: TTCAGAggtctcTgactCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRggac-B5: AGCGTGggtctcGgtccGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 T5:

Uggac-B5’: TTCAGAggtctcTggacCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRtctg-B6: AGCGTGggtctcGcagaGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 T6:

Utctg-B6’: TTCAGAggtctcTtctgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRaggt-B7: AGCGTGggtctcGacctGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 T7:

Uaggt-B7’: TTCAGAggtctcTaggtCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRcgct-B8: AGCGTGggtctcGagcgGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 T8:

Ucgct-B8’: TTCAGAggtctcTcgctCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3

(如果要多于8个靶点，通过设计不同的BsaI切点碱基，合成新引物对）

最后靶点(Last site) MluI

（new）gRcggt-BL:AGCGTGggtctcGaccgACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 （与载体RB侧B-R互补）

当靶点数少于8个时，gRcggt-BL（BL）作为最后一个gRNA表达盒下游引物替代B2,B3, B4...，见

以下引物使用方法)

4.4 靶标gRNA表达盒排列和扩增引物使用方法

本系统目前使用水稻来源的4个small nuclear RNA启动子（OsU3, OsU6a~c）。当连接靶点多于4个时，为了降低相同启动子序列在农杆菌发生同源重组的可能性，使相同启动子间的距离尽量近（2个相邻的同向重复序列间能够发生同源配对的碱基对数少于该重复序列长度的1/2）。因此建议U3、U6a~c启动子的使用和排列方式为： 1个靶点：LacZ-U3 2个靶点：LacZ-U3—U6a 3个靶点：LacZ-U3—U6a—U6b

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4个靶点：LacZ-U3—U6a—U6c—U6b 5个靶点：LacZ-U3—U3—U6a—U6c—U6b 6个靶点：LacZ-U3—U3—U6a—U6a—U6c—U6b 7个靶点：LacZ-U3—U3—U6a—U6a—U6b—U6c—U6b 8个靶点：LacZ-U3—U3—U6a—U6a—U6b—U6b—U6c—U6c

靶点接头设计：由于靶点接头的正向引物的5’端4个碱基是根据使用的不同启动子而不同的，因此要确定那个靶点使用那个启动子的基础上合成其正向引物。

特定位置gRNA表达盒引物使用方法 (U#=U3, U6a~c)： 1个靶点：用引物对B1’/BL 扩增相应的U#-T1-gRNA;

2个靶点：用引物对B1’/B2, B2’/BL 扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA;

3个靶点：用引物对B1’/B2, B2’/B3, B3’/BL 扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA, U#-T3-gRNA; 4个靶点：用引物对B1’/B2, B2’/B3, B3’/B4, B4’/BL 扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA, U#-T3-gRNA, U#-T4-gRNA 5个或以上靶点： 如此类推。

4.5 靶标gRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9-MH(B) 的连接方法

本载体系统可采用2种策略进行Cas9载体和多个gRNA表达盒片段的一次连接组装： 策略I

用Golden Gate cloning (ligation)方法 (Engler et al., 2008; 2009)； 策略II用Gibson assembly方法(Gibson,

et al., 2009, 2010)。Golden Gate ligation是利用Bsa I (type IIs restriction enzyme)的识别位点和切割位点不

重叠的特性，可以设计出多种不同的且非回文结构的粘性末端（256-16=240种，减去的16种是回文结构；第6-7页的PCR扩增引物使用了16种）。多个要连接的片段在连接点具有特异的互补末端可以连接（如下图, 4个表达盒为例)，而非连接点的末端之间不互补不能连接（相同末端分子间也不互补不能连接），因此连接反应是向着目标单方向进行，效率很高。由于OsU3上游附有LacZ标记基因(198 bp)，可在含有X-gal的培养基产生蓝色菌斑筛选阳性克隆，达到绝对真阳性。策略II见后面介绍。

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靶点设计，接头引物合成gRNA质粒先切后连gRNA质粒BsaI酶切gRNA表达盒连接物连接第一轮PCR(每种2反应)扩增产物(混合)Golden Gate引物第二轮PCRGibson Assembly引物gRNA表达盒gRNA表达盒BsaI 切pYLCRISPR/Cas9质粒Golden Gate 连接（边切边连）Gibson Assembly连接转化阳性菌落(蓝色），PCR确认，MluI酶切，测序

操作流程图

SpeIMluI(B1’)LacZctcgU3 pr(B2’)T1ctgagRNAgact(B2)(B3’)T2aagaU6b prgRNAU6a prttct(B3)(B4’)gactgRNActga(B4)T3T4U6c prMluIgRNA(B-R )cggtgcca(BL)gagc(B-L ) E.coliPrGolden Gate ligationB-LB-RAscIPubiP35:HPT (Bar)

RBpCas9TnosAscIpYLCRISPR/Cas9-MH (B) constructpVS1repliconLBKanrpBR322 oripBR322 born 注：由Uctcg-B1’导入的载体唯一Spe I位点是特别留的一个“后门”，其用途是，在构建好一组目的靶点gRNA

表达盒的载体的基础上，如果情况需要再添加第二组其它靶点gRNA表达盒，可以用Spe I将载体切成线状，再用策略II（Gibson Assembly，见后面）将第二组靶点gRNA表达盒克隆进去。

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5 多靶点载体构建详细操作方法（策略I）：

（1）菌种活化和质粒提取制备：将pYLCRISPR/Cas9-MH (B)菌种(TOP10F’)和CRISPR/gRNA vectors 菌种(DH10B)分别在含有卡那霉素（25μg/ml）和氨苄青霉素（50μg/ml）平板培养基划出活化单菌落，取单菌落培养1ml种子液（不要将保存的菌种直接接种子液！），再扩大培养用于提取质粒。

pYLCRISPR/Cas9-MH (B) 载体较大（约16.5 kb），拷贝数较低（pBR322复制子），用质粒小型柱提取纯化的回收率较低，因此最好用适合于较大质粒提取的大柱纯化试剂盒（如TIANGEN公司EndoFree Maxi Plasmid Kit）提取纯化（由于溶出的质粒DNA可能含有残留的洗液成分即乙醇，且体积大浓度低，最好再做一次标准的乙醇沉淀操作以去除残留乙醇和减少DNA溶液体积），或用普通碱裂解法提取（用酚/氯仿抽提2次后再乙醇沉淀）。溶解在TE（约0.5?g/?l）保存。取部分质粒稀释成约100 ng/?l冷冻保存，作为步骤（10）使用。

由于BsaI是很容易失活的酶（有时新买的BsaI是失活的！），在进行以下步骤之前，先检测BsaI活性： 配制10 μl BsaI反应液，含有5U BsaI, ~100 ng pYLgRNA-U# (或其它有AmpR基因的质粒)。37℃15min后电泳检查（也电泳50ng未切的相同质粒为对照）。pYLgRNA-U#的BsaI图谱见第2页。最好把BsaI分装成几管冷冻保存。

(2) （推荐使用以下4+5步骤边切边连方法，这个步骤只做参考，如果采用边切边连方法，不需要执行这个步骤）取约2-3 ug pYLCRISPR/Cas9-MH (B) 在50 μl（30U BsaI）酶切30 min, 用低熔点胶电泳回收酶切的质粒片段（去除ccdB片段）（不要用太多酶或太长时间过度酶切）。 用0.5x TE洗回收胶30分钟，65 ℃ 3 min熔解，在40 ℃加入Agarase（1U/100μl胶， NEB)处理30分钟后，分装成每管40-60ng（2-3 μl）冷冻保存公用（一管做一次连接，以避免多次冻融）。

（3）靶点接头制备：将接头引物TE溶解成100 μM母液，各取1μl加入到98μl 0.5x TE混合稀释到1 μM。约90℃ 30 S，移至室温冷却完成退火。

（4）gRNA载体酶切：取pYLgRNA-OsU3/LacZ 等质粒各约1 ug，在25μl反应用~10 U BsaI （NEB公司）酶切20 min（不要用太多酶或太长时间过度酶切），70℃ 5min失活酶。冷冻保存公用。 （5）gRNA表达盒连接反应：酶切过的pYLgRNA-OsU3/LacZ等质粒与各所对应接头连接反应： 1 μl 10x T4 DNA ligase buffer； 0.5 μl (~20 ng) pYLgRNA-OsU#质粒； 0.5 μl接头（最终浓度0.05 μM) 加 ddH2O至 10μl

最后加约20~35 U (0.05~0.1 μl) T4 DNA ligase (Takara，其它公司的T4 DNA ligase单位定义不

同，但每μl的酶活相当)

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室温（20-28 ℃）连接约10-15 min（过多DNA ligase和过长时间连接会产生较多第6页所述产物IV &V !）

（4+5）步骤4、5结合的简化（边切边连法）方法：配制10 μl 1x BsaI酶切连接反应液：在1x Bsa I-内切酶Buffer中加入ATP至终浓度0.5~1.0 mM，加入约20 ng pYLgRNA-OsU#质粒（预先配好20 ng/μl保存），0.5 μl接头（最终浓度0.05 μM），~5 U BsaI，~35 U T4 DNA ligase（此buffer对Bsa I和ligase都有效）。如果实验室没有ATP，在1x内切酶Buffer中加入0.2~0.3 μl 10 x NEB T4 DNA ligase buffer（10x NEB T4 DNA ligase buffer中含有10 mM ATP, 但10x Takara T4 DNA ligase buffer中含有1.0 mM ATP，因此优先用NEB的；或加1μl 10 x Takara T4DNA ligase buffer）。注意：没有加内切酶buffer而单纯加T4 DNA ligase buffer缺少KCl或NaCl，不适合Bsa I酶切！）。用变温循环仪（或PCR仪）循环反应5循环：37℃ 5 min，20℃ 5 min。

(6) 扩增gRNA表达盒（虽然用第二轮PCR的位置特异引物直接从连接产物也可以扩增出目标产物，但用2轮PCR扩增可以更稳定地得到特异性目标产物且能避免空载产物扩增，见第6页） （a）第一轮扩增（每个gRNA表达盒2个PCR反应，各15 μl）：

取1 μl连接产物为模板，使用第6页引物U-F/接头反向引物（反应1），和接头正向引物/gRNA-R（反

应2），各0.2 μM, 适量高保真PCR酶，最好使用KOD-Plus (TOYOBO)，保真度最高且性价比高，或KOD FX，或Takara ExTaq。不要使用能在产物3’附加A碱基的Taq酶，此A碱基使产物在第二轮PCR中不与互补链配对而不能延伸补平）。

25-28 循环：95 ℃ 10s，60 ℃ 15s ，68 ℃ 20 s

(任意) 取 4 μl电泳检查（反应2产物长度约140bp，最好用PAGE检查，或用2%琼脂糖胶）。如果扩增产物较弱，也可以继续第二轮PCR。 （b）第二轮PCR：

按第6-7页所示，预先将位置特异引物对混合成10 x工作液，每种1.5 μM： B1’ + B2 (PT1); B2’ + B3 (PT2); B3’ + B4 (PT3)； B4’ + B5 (PT4)； B5’ + B6 (PT5)；B6’ + B7 (PT6)；B7’ + B8 (PT7)； B1’ + BL (PT1L); B2’ + BL (PT2L); B3’ + BL (PT3L); B4’ + BL (PT4L); B5’ + BL (PT5L); B6’ + BL (PT6L); B7’ + BL (PT7L); B8’ + BL (PT8L)。 引物组合

1个靶点：PT1L；

2个靶点：PT1，PT2L； 3个靶点：PT1，PT2，PT3L;

4个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4L;

5个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5L;

6个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6L；

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7个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7L； 8个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7，T8L

取第一轮PCR反应1，2产物1μl用H2O稀释10倍，各取1 μl混合为模板。各表达盒20-50 μl PCR (1个靶点50μl； 2-3个靶点各30μl；4个或以上靶点各20μl)。加入1/10量每种引物组合工作液（最终浓度0.15μM）。使用适量KOD-Plus或其它高保真PCR酶。扩增15-20 循环(实际情况调整)：95 ℃ 10s，58 ℃ 15s，68 ℃ 20 s。取 2 -3μl电泳检查产物长度是否符合，并估计样品的大致浓度。注：各种启动子gRNA表达盒的长度为（括号为Bsa I切后）：U3-gRNA=767 bp(728 bp); U6a-gRNA=629 bp(599 bp); U6b-gRNA=515 bp(485 bp); U6c-gRNA=924 bp(984 bp)。

（7）根据各样品产物估算的量，把所有产物大致等量混合，酚抽提乙醇沉淀或用PCR产物纯化kit纯化(除去Taq酶以防止下步骤补平BsaI酶切末端)。

（8）（如果采用步骤10方法II，不需要此步骤8和9）混合产物在50μl BsaI反应，用20 U BsaI 37 ℃酶切30 min，73 ℃ 2 min（使切出的13 bp末端小片段变性，以减少连接竞争）。用PCR产物纯化kit纯化，以去除切出的13/17碱基末端片段以防止连接竞争。

（9）方法I：在切好分装（步骤2）的pYLCRISPR/Cas9-MH (B) (约60-80ng）管中，加入相当于每个靶点约10-15 ng的步骤（8）酶切PCR产物(如1个靶点约10ng、 2个靶点共20-30ng、 3个共约40-50 ng、 4个共约60-70 ng、更多靶点时每个片段的量适当增加（最多15ng/片段）,不要加入过多的gRNA表达盒片段。这样载体与每种插入片段摩尔比=1: 4-6) ，在10 μl 连接反应（加35 U连接酶，不要过多连接酶）， 16 ℃（或最好用变温循环: 10 ℃ 5min，20℃ 5 min；10-15循环）连接2-3h（不要过长时间连接）。做3个以上靶点Cas9载体构建时，最好把Bsa I切好的多个gRNA表达盒混合片段（先不加pYLCRISPR/Cas9-MH (B)片段）先在20℃连接约~3 min将其连接成一个片段，再加入pYLCRISPR/Cas9-MH(B)片段(约60-80ng），再连接2-3个小时。

（10）方法II（边切边连法）：作为步骤8，9的简化替代操作，从步骤（7）取约20-70 ng 产物（参考步骤9中gRNA表达盒片段使用量），加入约60-80 ng 未切割的pYLCRISPR/Cas9-MH (B)质粒（预先稀释成约100 ng/?l冷冻保存），在15 μl反应（1x Bsa I-内切酶Buffer）用10 U BsaI 37 ℃酶切~10min（不要过多BsaI和过长时间，否则载体会产生破坏平滑末端而自连）。（不要失活Bsa I !）加入ATP至终浓度0.5~1.0 mM。如果实验室没有ATP，加~0.5 μl 10 x NEB T4DNA ligase buffer (或1.5μl 10 x Takara T4 DNA ligase buffer)，和35 U ligase（不要过多连接酶）。 用变温循环酶切连接约10-15循环: 37℃ 2 min；10 ℃ 3 min，20℃ 5 min；最后37℃ 2 min。此方法要点：由于没有去除Bsa I切出的13/17碱基小片段和ccdBs片段，它们会被竞争连接回原来的位置。此变温边切边连反应能把连接回去的片段再次被Bsa I切除，而连接好的目标产物序列由于不存在Bsa I的识别位点不会被切断。此方法简便效率高，阳

性克隆率高，推荐优先使用。

12

（11） 电激法转化：将连接产物滴载在悬浮式透析膜Millipore VSWP04700（0.025μm孔径）对1/5 x TE透析15~30 min（最好在4℃冷柜内）脱盐（或用乙醇沉淀，70%乙醇洗，风干溶在5 μl 去离子水），取1-1.5μl连接产物电激转化E. coli DH10B 感受态细胞（虽然其它菌株也可以用，但DH10B更适合高效率电激转化大质粒。电激转化感受体态细胞制备最好用SOB培养（不要用LB培养），以10 pg pUC18质粒转化测试转化效率（小质粒用电激电压1800 V/20μl感受态细胞/1μl电激杯），要求达到效率>109 colonies/1μg pUC18(即电激10 pg质粒，涂1/20 转化细胞出500以上菌斑)。 >15kb大质粒的电激电压为1500-1600 V/20μl感受态细胞/1μl电激杯（或2500V/40μl感受态细胞/2μl电激杯）；电激后加入1ml SOC (不要用LB)）,37℃培养1-1.5h。涂板培养基为LB+ 25μg/ml Kan, 0.3~0.5 mM IPTG (使用Lac Iq基因型菌种用1.0 mM)，适量X-gal。IPTG诱导没有彻底切除ccdBs的空载质粒转化子的ccdBs表达致死。而含有目标插入序列（LacZ-OsU3-gRNA表达盒）的阳性克隆由LacZs表达产生蓝色菌斑。注意：白色且生长大小正常的菌斑是已切除ccdBs但末端破坏平端连接的空载克隆，或ccdBs功能突变（有约1/1000频率发生）但未切除ccdB的空载克隆。

化学熱激法转化也可以获得阳性克隆，但效率较低。因此，有电激仪的实验室应该使用电激法。 （12）阳性克隆确认：用常规碱裂解法提取质粒，取约100ng（20μl反应）用MluI（由LacZ-OsU3表达盒和BL引物导入Mlu I位点）切出串联的gRNA表达盒片段（以未切的空载环状质粒为对照）电泳检查其大小是否符合预期（各gRNA表达盒片段大小之和）。如果Mlu I切不动（电泳显示没有插入子片段且带型与未切空载环状质粒相似，即条带较宽拖尾），这是空载体。

（如果做以下步骤测序，可不做这个PCR检测）取少量（1~3 ng）质粒为模板对所有靶点进行PCR检测(也用空载质粒做阴性对照)。引物配对形式为：SP-DL引物与第一靶点接头反向引物配对；第一靶点接头正向引物与第二靶点反向接头引物配对；第二靶点正向接头引物与第三靶点接头反向引物配对；第三靶点接头正向引物与第四靶点反向接头引物配对；?如此类推，最后靶点正向接头引物与SP-R引物配对。这样每个靶点的正反方向都检测过一次。电泳确认其大小是否符合预期。

（13）测序检测：（如果通过步骤12 PCR检测阳性，可不做测序）利用各靶点引物的特异性，按下图方式对特定靶点进行测序. 注意：由于U6c比较长（742bp），用前一个靶点正向引物不一定能测通U6c到靶序列（T#），如果U6c是最后一个表达盒，要用SP-R (见第2页)进行测序；如果U6c不是最后一个表达盒，用其后面的靶点反向引物测。（最好提醒测序公司，这是中低拷贝的较大质粒，以便公司采取相应措施）。

SP-ML 测T1以T1正向引物测T2以T2正向引物测T3U6cT#SP-R测T#RBSP-RT1T2T3

（14）在农杆菌的稳定性检测(任意步骤)：获得的克隆电激转化农杆菌（EHA105），从农杆菌提取质粒（农杆菌提取质粒质量较差，只适合做PCR），取约2-5 ng质粒为模板再用所有靶点接头正向引物和反向引物

13

配对进行PCR确认。或将质粒转化DH10B，再提取质粒酶切分析。

(15) 打靶效果检测：打靶成功往往在靶点缺失若干碱基。以靶点切点为中心，在两侧各离开约150 bp处合成引物。可将T0或T1植株的靶点PCR产物不经克隆直接测序。从测序出现杂波峰或突变型波峰判断突变状态。

策略II: 基于Gibson Assembly的gRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9-MH(B)的连接方法

Gibson 等开发了一种“isothermal in vitro recombination reaction”，也称为 “Gibson Assembly” 可进行多个PCR片段的连接(Gibson, et al., 2009; Gibson, et al., 2010; Gibson, 2011)。商业的连接克隆试剂盒“Gibson Assembly Kit” (NEB)就是基于此技术, Takara的In-Fusion 使用不同酶系，原理相似，也可以达到相同目的，但这些试剂盒很昂贵！（1500-1700元/10次反应）。本实验室利用自制的isothermal in vitro recombination reaction mixture (见以下，成本非常低)，可进行质粒载体的多个片段同时克隆和缺失（Jiang et al., 2013. One-step cloning of intron-containing hairpin RNA constructs for RNA interference via isothermal in vitro recombination system. Planta 238, 325-330; Zhu et al., 2014. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene 548, 39–42）。以下介绍基于Gibson Assembly的CRISPR/Cas9多靶点载体的构建。 (1)

根据在一个载体构建靶点数的需要，合成以下引物对（gR-L是最后一个gRNA表达盒用）。 以下相同颜色表示连接配对序列，右端斜体表示与U3/6启动子上游配对序列，方框为各种通用引物配对位点，测序检验阳性克隆时测序公司可以提供这些通用引物。

Spe I Up-T1: ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3(下划线与GAS-L配对)

gR-T1: CAGGGAGCGGATAACAATTTCACACAGGCACATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (Ptac promoter F primer site)

Up-T2: GTGCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCCCTGGAATCGGCAGCAAAGG-3

gR-T2: CCACGCATACGATTTAGGTGACACTATAGCGCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (Sp6 promoter primer site)

Up-T3: CGCTATAGTGTCACCTAAATCGTATGCGTGGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3

gR-T3: GTCGCTAGTTATTGCTCAGCGGCCAAGCTCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (T7 terminator F primer site)

Up-T4: GAGCTTGGCCGCTGAGCAATAACTAGCGACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3

gR-T4: CATCGTCGCCGTCCAGCTCGACCATTGAACATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (EGFP-N primer

site)

Up-T5: GTTCAATGGTCGAGCTGGACGGCGACGATGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3

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gR-T5: GCTCCGAATACGACTCACTATAGGGTGACCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (T7 universal

primer site)

Up-T6: GGTCACCCTATAGTGAGTCGTATTCGGAGCTGGAATCGGCAGCAAAGG-3

gR-T6: CTGAGGTTAACCCTCACTAAAGGGAAGCTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (T3 Promoter

primer site )

Up-T7: GGAGCTTCCCTTTAGTGAGGGTTAACCTCAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3

gR-T7: CGTGGTATGCTAGTTATTGCTCAGCCTCGACATCCACTCCAAGCTCTTG-3(T7 terminator R primer site)

Up-T8: GTCGAGGCTGAGCAATAACTAGCATACCACGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3

（gR-R为右侧最后一个表达盒反向引物。如1个靶点，Up-T1与gR-R配组；2个靶点，Up-T2与gR-R配组；3个靶点，Up-T3与gR-R配组，...如此类推）

gR-R: TAGCTCGAGAGGCGCGCCAATGATACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (下划线

与GAS-R配对) Mlu I （以上引物对单双子叶植物用Cas9载体通用）

为方便操作，参考11页模式预先混合好引物组。

MluIGAS-LLacZT1Ptacpromoter F primerU3 U#T2Sp6 promoter primerSpeIT3Sp6 universal primerU#U#T4MluIGibson AssemblyNotIPubipCas9TnosRBGAS-LGAS-RGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAGCACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGAGAGACCTCTGGibson assembly site (GAS-L)AAG(ccdB,657bp)GAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGGCGCGCCTCTCGAGCTAGCGGCCGCATGC Gibson assembly site (GAS-R)ATCGATCTCCTACATCGTATAAATTAGCCTATACGAAGTTATTGCATCTATGTCGGGPCR/Sequencing primer (SP-R):15

P35:HPT(Bar)pYLCRISPR/Cas9-MH (B)LBKanrpVS1repliconpBR322 oripBR322 bornNotIPCR/Sequencing primer (SP-ML)AscI B-L BsaI BsaI B-R AscI NotI

注：由Up-T1导入的载体唯一Spe I位点是特别留的一个“后门”。其用途是，当构建好第一组目的靶点gRNA

表达盒的载体后，如果情况需要再添加第二组其它靶点gRNA表达盒时（或靶点数目较多，一次连接所有gRNA表达盒不能成功，可以把它们分成2组连接）。可以用Spe I将载体切成线状，再继续用Gibson assembly将第二组靶点gRNA表达盒克隆进去。第二组靶点gRNA表达盒的扩增需要用gR-R2替代gR-R（Up-T1不变）。也可以利用此位点（或策略I构建载体留的Spe I位点）插入其它目标基因片段。 Mlu I gR-R2: TGTCAACGCGTCCTTTGCTGCCGATTCCAGGTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (第一组T1-gRNA

表达盒使用了LacZ-OsU3启动子)。如果第一组的T1-gRNA表达盒不是用LacZ-OsU3启动子，gR-R2的 5’端的TGTCAACGCG要替换成如下碱基： OsU3: AAAGATTCCT; OsU6a: CAGGAAAAAA; OsU6b:TGCAAGAACG; OsU6c:CGCTAATGAG（这是各不同启动子的5’端10 bp，作为连接位点的一部分，见附录序列）。其它Up-T#/gR-T# 的使用原理与第一组的相同，但不能重复使用第一组用过的Up-T#/gR-T# （Up-T1可以再使用）。如果是有计划分2组克隆，建议将LacZ-OsU3启动子留在第2组使用，因为第2组克隆的难度大些，可利用LacZ帮助筛选阳性克隆。

如果第一组靶点gRNA表达盒是用策略I构建的，第二组靶点gRNA表达盒的克隆就使用Spe I切开载

体，使用Up-T1b (ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGAGGAATCGGCAGCAAAGG-3)替换Up-T1。

gR-R2的序列（及其10碱基替换，如果需要）与以上相同。

（2）自制Isothermal in vitro recombination reaction mixture：

5X isothermal（ISO）reaction buffer：25% PEG-8000，500 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，50 mmol/L MgCl2，50 mmol/L DTT，4种dNTPs 各1 mmol/L，5 mmol/L NAD，?20 °C保存。

2X master mixture：160 μL 5 × ISO buffer, T5 Exonuclease (Epicentre) 1.5 units（严格控制T5 exouclease酶量，不能过多！过多T5 exouclease会造成DNA片段被快速降解），Phusion High-Fidelity DNA polymerase (NEB) 20 units, Taq ligase (NEB) 2000 units, deionized water to 0.4 mL。多管分装?20 °C保存

（3）参考第7页指引设计U3/6启动子排列。但如果是4个靶点，建议把较长的U6c用于T3, U6b用于T4,

这样可以用SP2测通T4和T3（见以下步骤7）。

（4）在50 μl反应用20 U Bsa I酶切~2 μg pYLCRISPR/Cas9-MH (B) 约30 min。取2μl（~80 ng）电泳检

查，确认被切出的ccdB条带（732bp）。65℃5min失活，每管3μl（100~120 ng）约分装冷冻保存。（一般不需要回收纯化，也可使用策略I步骤2电泳回收纯化的样品）。

（5） 按以上策略I步骤2至步骤6的第一轮PCR同样操作；第二轮PCR使用以上引物对(各引物0.15μM)

扩增各靶点（T1, T2, T3,...）的gRNA表达盒片段。取2 μl电泳检查。

（6）根据各样品产物估算的量，把所有产物大致等量混合，酚抽提乙醇沉淀或用PCR产物纯化kit纯化；或在PCR产物中加入5 U 单链核酸酶Exonuclease I (Takara)在37°C处理10-15 min消除剩余引物（这是为

16

了避免引物与目的片段竞争结合），80°C 20min失活ExoI（以避免消化Gibson反应中产生的单链末端），不需纯化直接取适量进入步骤7。

（7）参考策略I步骤9，在分装有pYLCRISPR/Cas9-MH (B)（100~120 ng）的管中加入适量的gRNA表达盒片段，加入去离子水至最终量7~8 μl。加入等量7~8 μl 2X master mixture，50 °C反应25 ~30 min（时间过长可能会造成DNA被T5 exouclease降解！）。可以取10 μl连接产物电泳检查，正常反应可见连接的较大片

段（见18页图）。

（8）参考策略I步骤11-13操作，但在透析膜对1/5 x TE透析较短时间的5-10 min（这是因为ISO buffer含有PEG-8000，过长时间透析会吸收过多的1/5x TE降低连接产物浓度。但不透析直接电激转化容易打炸或电激电流过大而降低转化效率）。 测序策略既可以按策略I步骤13进行，也可以用以上的通用引物Sp6 promoter primer等（测序公司可提供，将这些测序引物序列交测序公司确认）从gRNA往启动子方向进行测序，每个引物可以测通2个靶点。

Construction of a CRISPR/Cas9 vector with four targeting sites0.5 kb23 kb9 kb1 kb0.5 kb15 kb3,Colony PCR screening for positive clonesCas9vector backboneLinked 4 gRNAexpression cassettes1,Recovered Cas9vector backbone digested with BsaI2, PCR amplification of four gRNAexpression cassettes 3 kbChecked clones4,Restriction analysis of positive clones with AscICas9 vector backboneLinked 4 gRNAexpression cassettes5,Stability verification of the Cas9construct in Agrobacteriumtumefaciens(the plasmid from Agrobacteriumwas transferred back to E. coli, then clone plasmids were isolated and digested with AscI)

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Construction of a CRISPR/Cas9 vector with eight targeting sites2 kb0.5 kb1, PCR amplification of eight gRNAexpression cassettes (first round of amplification)23 kb4.3 kbCas9vector backboneLinked 8 gRNAexpression cassettes2,Restriction analysis of positive clones with AscI1 kb0.5 kb3, Testing one positive clone with PCR, using pairs of the target adaptor primers(F, R are forward and reverse primers, respectively).Cas9vector backboneLinked 8 gRNAexpression cassettes4,Stability verification of the Cas9construct in Agrobacteriumtumefaciens, clones were digested with AscI

PCR-amplified sgRNA expression cassettes 2 kb0.5 kbGibsonassembly productsVector;Vector + gRNAcassettes5kbLinked gRNAcassettes1kb23 kb4 kb2 kbLinked 6 sgRNA expression cassettes

A 6-target CRISPR/Cas9 construct prepared by Gibson assembly

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T1T2AAACCATCTG--GTTGTAAGCAAGCC5’-AAACCATCTGCAGTTGTAAGCAAGCC(WT)GTCGGCCGGCAGCTGAACTGACGGAC5’-GTCGGCCGGCAGCCGGATGACGGGCA(WT)T3T5GTCACGAGGTAGGGAT-CTTTGGCATGTCACGAGGTAGGGATCCTTTGGCAT(WT)AGATATTGGTGGCACCGACCTTGAGGGTAGATATTGGTGGCACCGACC-TGAGGGT(WT)T6T7CCGCCGTCG-CGGCAAGCCGCGCGTCCCGCCGTCGCCGGCAAGCCGCGCGTC(WT)CGACGGTGCTGATGAAGGATTCCAGGACACGACGGTGCTGATGAAGGAT-CCAGGACA(WT)T8Edited sites in a transgenic rice plant with an 8-target CRISPR/Cas9 construct TCAATCTTCACTAGCCATGTACAAGGGACCTCAATCTTCACTAGCCATGT-CAAGGGACC(WT)

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附录序列信息(每个PCR扩增序列为活字)：

pYLCRISPR/Cas9-MH (B)克隆位点附近关键序列

GCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAGCACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGAGAGACCTCTGAAG(ccdB)GAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGGCGCGCCTCTCGAGCTAGCGGCCGCATGCATCGATCTCCTACATCGTATAAATTAGCCTATACGAAGTTATTGCATCTATGTCGGG

LacZ-OsU3-gRNA载体部分序列gRNA下游引物U3/U6上游引物第二轮gRNA-RU-F第二轮BsaIBamHIgRNAacccggGGATCCTAGCCGGGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGAATTTTCCTCCGTTTTACCTGTGGAATCGGCAGCAAAGGACGCGTTGAMluIE.coliPromoter LacZ(alpha)CATTGTAGGACTATATTGCTCTAATAAAGGAGGCAGCTATGctggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaa tcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgc OsU3 PrgcagcctgaatggcTAAAAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCAT GGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGG GAACACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGTGATGTGAAGGAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGGTTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCAAGAGACCTCTGAAGATAACATACTAAGCTTggcact..(pUC18骨架）BsaIHindIII

PCR扩增的LacZ-OsU3-gRNA单元序列（767 bp, Bsa I酶切后737 bp）：

TTCAGAGGTCTCTNNNNCTCTGGAATCGGCAGCAAAGGACGCGTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCTAATAAAGGAGGCAGCTATGctggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcTAAAAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGTGATGTGAAGGAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGGTTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCA(19-20pb靶序列）GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGG CACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGACCNNNNCGAGACCCACGCT

OsU3-gRNA载体部分序列gRNABsaIBamHIacccggGGATCCTAGCCGGGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGAATTTTCCTCCGTTTTACCTGTGGAATCGGCAGCAAAGGAAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGTGATGTGAAGGAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGGTTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCAAGAGACCTCTGAAGATAACATACTAAGCTTggcact(pUC18骨架）BsaIHindIIIgRNA下游引物第二轮gRNA-RU3/U6上游引物U-F第二轮

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PCR扩增的OsU3-gRNA单元序列(564 bp, Bsa I 酶切后534 bp)

TTCAGAGGTCTCTNNNNCTCTGGAATCGGCAGCAAAGGACGCGTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCTAATAAAGGAAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGTGATGTGAAGGAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGGTTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCA (19-20pb靶序列）

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT TTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGACCNNNNCGAGACCCACGCT

OsU6a-gRNA载体部分序列BamHIacccggGGATCCTAGCCGGGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCBsaIACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGAATTTTCCTCCGTTTTACCTGTGGAATCGGCAGCAAAGGATTTTTTCCTGTAGTTTTCCCACAACCATTTTTTACCATCCGAATGATAGGATAGGAAAAATATCCAAGTGAACAGTATTCCTATAAAATTCCCGTAAAAAGCCTGCAATCCGAATGAGCCCTGAAGTCTGAACTAGCCGGTCACCTGTACAGGCTATCGAGATGCCATACAAGAGACGGTAGTAGGAACTAGGAAGACGATGGTTGATTCGTCAGGCGAAATCGTCGTCCTGCAGTCGCATCTATGGGCCTGGACGGAATAGGGGAAAAAGTTGGCCGGATAGGAGGGAAAGGCCCAGGTGCTTACGTGCGAGGTAGGCCTGGGCTCTCAGCACTTCGATTCGTTGGCACCGGGGTAGGATGCAATAGAGAGCAACGTTTAGTACCACCTCGCTTAGCTAGAGCAAACTGGACTGCCTTATATGCGCGGGTGCTGGCTTGGCTGCCGAGAGACCTTCTGAAGATAACATACTAAGCTTggcact(pUC18骨架）BsaIHindIII

PCR扩增的U6a-gRNA单元序列（629 bp, BsaI酶切后599 bp）：

TTCAGAGGTCTCTNNNNCTCTGGAATCGGCAGCAAAGGATTTTTTCCTGTAGTTTTCCCACAACCATTTTTTACCATCCGAATGATAGGATAGGAAAAATATCCAAGTGAACAGTATTCCTATAAAATTCCCGTAAAAAGCCTGCAATCCGAATGAGCCCTGAAGTCTGAACTAGCCGGTCACCTGTACAGGCTATCGAGATGCCATACAAGAGACGGTAGTAGGAACTAGGAAGACGATGGTTGATTCGTCAGGCGAAATCGTCGTCCTGCAGTCGCATCTATGGGCCTGGACGGAATAGGGGAAAAAGTTGGCCGGATAGGAGGGAAAGGCCCAGGTGCTTACGTGCGAGGTAGGCCTGGGCTCTCAGCACTTCGATTCGTTGGCACCGGGGTAGGATGCAATAGAGAGCAACGTTTAGTACCACCTCGCTTAGCTAGAGCAAACTGGACTGCCTTATATGCGCGGGTGCTGGCTTGGCTGCCG(19-20碱基靶序列）GTTTTAGAGCTAGAAA TAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGACCNNNNCGAGACCCACGCT

OsU6b-gRNA载体部分序列acccggGGATCCTAGCCGGGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGAATTTTCCTCCGTTTTACCTGTGGAATCGGCAGCAAAGGATGCAAGAACGAACTAAGCCGGACAAAAAAAAAAGGAGCACATATACAAACCGGTTTTATTCATGAATGGTCACGATGGATGATGGGGCTCAGACTTGAGCTACGAGGCCGCAGGCGAGAGAAGCCTAGTGTGCTCTCTGCTTGTTTGGGCCGTAACGGAGGATACGGCCGACGAGCGTGTACTACCGCGCGGGATGCCGCTGGGCGCTGCGGGGGCCGTTGGATGGGGATCGGTGGGTCGCGGGAGCGTTGAGGGGAGACAGGTTTAGTACCACCTCGCCTACCGAACAATGAAGAACCCACCTTATAACCCCGCGCGCTGCCGCTTGTGTTGAGAGACCTTCTGAAGATAACATACTAAGCTTggcact(pUC18骨架）

PCR扩增的U6b-gRNA单元序列（515 bp, BsaI酶切后485 bp）：

TTCAGAGGTCTCTNNNNCTCTGGAATCGGCAGCAAAGGATGCAAGAACGAACTAAGCCGGACAAAAAAAAAAGGAGCACATATACAAACCGGTTTTATTCATGAATGGTCACGATGGATGATGGGGCTCAGACTTGAGCT

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ACGAGGCCGCAGGCGAGAGAAGCCTAGTGTGCTCTCTGCTTGTTTGGGCCGTAACGGAGGATACGGCCGACGAGCGTGTACTACCGCGCGGGATGCCGCTGGGCGCTGCGGGGGCCGTTGGATGGGGATCGGTGGGTCGCGGGAGCGTTGAGGGGAGACAGGTTTAGTACCACCTCGCCTACCGAACAATGAAGAACCCACCTTATAACCCCGCGCGCTGCCGCTTGTGTTG(19-20碱基靶序列）GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATA AGGCTAGT CCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGA TGGACCNNNNCGAGACCCACGCT

OsU6c-gRNA载体部分序列acccggGGATCCTAGCCGGGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGAATTTTCCTCCGTTTTACCTGTGGAATCGGCAGCAAAGGActcattagcggtatgcatgttggtagaagtcggagatgtaaataattttcattatataaaaaaggtacttcgagaaaaataaatgcatacgaattaattctttttatgttttttaaaccaagtatatagaatttattgatggttaaaatttcaaaaatatgacgagagaaaggttaaacgtacggcatatacttctgaacagagagggaatatggggtttttgttgctcccaacaattcttaagcacgtaaaggaaaaaagcacattatccacattgtacttccagagatatgtacagcattacgtaggtacgttttctttttcttcccggagagatgatacaataatcatgtaaacccagaatttaaaaaatattctttactataaaaattttaattagggaacgtattattttttacatgacaccttttgagaaagagggacttgtaatatgggacaaatgaacaatttctaagaaatgggcatatgactctcagtacaatggaccaaattccctccagtcggcccagcaatacaaagggaaagaaatgagggggcccacaggccacggcccacttttctccgtggtggggagatccagctagaggtccggcccacaagtggcccttgccccgtgggacggtgggattgcagagcgcgtgggcggaaacaacagtttagtaccacctcgctcacgcaacgacgcgaccacttgcttataagctgctgcgctgaggctcagAGAGACCTTCTGAAGATAACATACTAAGCTTggcact(pUC18骨架）

PCR扩增的U6c-gRNA单元序列（924 bp, BsaI酶切后894 bp）：

TTCAGAGGTCTCTNNNNCTCTGGAATCGGCAGCAAAGGActcattagcggtatgcatgttggtagaagtcggagatgtaaataattttcattatataaaaaaggtacttcgagaaaaataaatgcatacgaattaattctttttatgttttttaaaccaagtatatagaatttattgatggttaaaatttcaaaaatatgacgagagaaaggttaaacgtacggcatatacttctgaacagagagggaatatggggtttttgttgctcccaacaattcttaagcacgtaaaggaaaaaagcacattatccacattgtacttccagagatatgtacagcattacgtaggtacgttttctttttcttcccggagagatgatacaataatcatgtaaacccagaatttaaaaaatattctttactataaaaattttaattagggaacgtattattttttacatgacaccttttgagaaagagggacttgtaatatgggacaaatgaacaatttctaagaaatgggcatatgactctcagtacaatggaccaaattccctccagtcggcccagcaatacaaagggaaagaaatgagggggcccacaggccacggcccacttttctccgtggtggggagatccagctagaggtccggcccacaagtggcccttgccccgtgggacggtgggattgcagagcgcgtgggcggaaacaacagtttagtaccacctcgctcacgcaacgacgcgaccacttgcttataagctgctgcgctgaggctcaG(19-20碱基靶序列）GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAA AAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGA TGGACCNNNNCGAGACCCACGCT

Background：

1. The original function of CRISPR:

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名词解释：crRNA: CRISPR RNA；tracrRNA: trans-activating CRISPR RNA；PAM : protospacer adjacent motif；

2. Cas9 can be guided by single chimeric RNA(gRNA):

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