体外微核试验方法研究进展

体外微核试验方法研究进展

癌变 畸变 突变　　1999年第11卷第2期　　　　　　　　　　　　　　　CarcinogenesisTeratogenesisandMutagenesisVol11No21999

体外微核试验方法研究进展

吕晓华　综述　张立实　王瑞淑　审校

华西医科大学营养与食品卫生学教研室　成都　610041

微核是细胞有丝分裂后期仍滞留在细胞质中的淋巴细胞用于体外微核试验以来,研究者对实验方法染色体断片或染色单体。随着微核形成机理和意义不断改进完善,特别是Fenech等建立了加细胞松弛的阐明以及检测手段和实验技术的不断改进和完善,素B(CYB)的胞质分裂阻断法,将计数微核的细胞局目前微核试验已被公认为筛选致突变物的主要方法限于双核细胞后,提高了试验的灵敏度,并且使试验之一,在预测致癌危险性、检测非整倍体诱发剂及其程序标准化,已得到广泛的推广使用(1-3)。因为体它遗传危害方面也得到广泛应用。

外微核试验收获细胞时要低渗,而细胞经化学物质处

与体内试验相比,体外微核试验更加简便、快速、理后,细胞膜对低渗的耐受性发生改变,使低渗不易耗费低,不受动物个体差异等因素的影响,而且可以掌握,,用离心制测出某些较低浓度的化学物诱导的微核反应,灵敏度片机制片,,胞浆与胞核的比较高。经方法的改进和计数自动化的逐步实现,除去,了一些造成假阳性和影响实验结果准确性的人为因(4),素,使实验结果的可靠性不断增加。Giemsa染色,这种方法较适合骨,但对淋巴细胞染色不太理想,因为。1　111　人外周血淋巴细胞微核试验

淋巴细胞微核与淋巴细胞内的Gall小体、Kurloff小体及淋巴细胞经理化因素作用后产生的毒性颗粒难于鉴别,因此许多研究者对淋巴细胞染色方法进行了探讨。Iskandar建议用R66(Garr)2%Giemsa,也有人

培养人外周血淋巴细胞微核试验是近年来最常用Jenner-Giemsa、May-GrunwaldGiemsa染色,还用的体外短期测试方法之一,其方法简便,所需血量有人提出用瑞氏和苏木精染色等。Harleguin荧光染少,取材容易,实验结果准确可靠,在评价理化因素对色法和改良荧光Giemsa染色技术也曾应用在微核染人体细胞的遗传毒性及监测环境、职业接触中的有害色中,以提高微核的检出率,减少细胞增殖动力学的因子对人体的潜在致癌作用方面尤为适用。外周血影响。八十年代日本学者Hayashi等首先将A1O(即淋巴细胞是对电离辐射较敏感的细胞之一,故该试验吖啶橙,AcridineOrange)染色法应用于体内微核试还广泛用于急性辐射病的早期诊断。自从人外周血验(5),以后国内外学者又将其应用于各类体外微核

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(1998-12-01投稿;1999-01-30修回)

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试验。A1O能与DNA结合发绿色荧光,与RNA结突变型,而TK6细胞为P53野生型。最近的研究发合发红色荧光,还能与酸性多糖结合发鲜红色荧光。现,与TK6细胞相比,WTK1细胞对诱变因子(电离A1O染色的微核比Giemsa染色更易辨认,细胞内由

辐射等)的抵抗力较强,生存率高,而对其诱发的基因

于化学物处理而产生的微核样包涵体容易与微核区突变敏感(9-10)。有研究表明,WTK1和L5178Y细别开来,使结果更加可靠。A1O染色法用于微核试胞对诱变物的反应各有特点,如同时应用于一个短测验的主要缺点是:染色不持久,必须在染色后短时间系统,有利于提高筛检化学物诱变性和致癌性的准确内进行阅片和计数。

Fenech和Surralles还先后报道了应用人外周血CYB的基础上,配合加阿糖胞苷(ARA-C)和/或加

性。

与其它体外试验一样,体外微核试验最大的缺陷活化才能表达其潜在的遗传毒性。应用具有代谢活

淋巴细胞微核试验来检测DNA的损伤。这是在加是缺乏体内代谢活化系统,而许多遗传毒物需经代谢羟基脲(HU)的方法,加ARA-C和/或HU的目的性的靶细胞进行体外短期试验成为近年来的研究热是抑制DNA多聚酶的活性,使DNA的损伤不能被点。SHE叙利亚仓鼠胚胎细胞保留有很高水平的代细胞内切除修复机制所修复,DNA断裂成两条,经过谢B(a)P的加单氧酶活性,所以B(a)P经SHE细胞一次细胞分裂后转化成微核。这样微核可以成为反代谢后,产生的活性物质可以直接作用于该细胞染色映在G0/G1期诱发的可切除修复的DNA损伤的生体产生微核。由小鼠胚胎制备的BALB/c3T3细胞、酰胺物学指标。但ARA-C和HU本身具有细胞毒性,能够代谢活化多环芳烃、

它们可能延长细胞周期,从而使微核率高峰的出现时间延长(6-7)。

112　培养哺乳类细胞系微核试验

物(1112)c3,该,是一种较好的体外

()

用培养细胞进行微核试验,13。细胞色素P450(CYP)是代

用于靶细胞,谢活化许多诱变剂/致癌物的主要酶系,然而建株细胞因表达较低或完全不表达CYP而丧失了代谢活化假阴性的缺点;、分化、代能力。近年来应用遗传工程技术,使检测细胞具有这谢模式及DNA,故结果类表达的基因,并在实验中取得了一定结果。我国学比微生物试验系统有更大意义。L5178Y小鼠淋巴者应用RT-PCR技术和DNA重组技术,分别从人瘤细胞是目前国际通用的TK位点基因突变试验的肝细胞和人羊膜FL细胞中克隆出CYP2B6基因和标准靶细胞系,TK6人类成淋巴细胞系也是近年发CYP1A1基因的cDNA片段,构建真核细胞表达重组展起来的用于检测TK位点基因突变的细胞,这二种体,导入FL、V79和CHL细胞中获得稳定表达,并用细胞均呈悬浮生长,营养要求不高,生长迅速。张立双核微核法,以转基因的CHL-2B6、CHL-1A1表实等将这两种细胞用于微核试验,其实验方法简便,达株为靶细胞,分析鉴定其对一组前诱变剂的代谢活稳定性好(8)。研究发现,一些典型诱变剂在较低浓化能力,结果显示,转基因细胞在遗传毒理试验代谢

()

度下即可诱导TK6细胞微核率增高,而在高浓度下活化研究方面具有重要的应用价值14-15。

则表现出明显的细胞毒性;另一方面,L5178Y细胞一些较严格的比较研究表明,常用于人外周血淋

对诱变剂的细胞毒性有较高的耐受性,较高浓度的诱巴细胞的胞质分裂阻断法的敏感性取决于受检因子,变剂在L5178Y细胞可诱导出比TK6细胞更高的微如检测电离辐射诱发的微核形成,胞质分裂阻断法明核率。两者的上述差异可能因为它们源于不同种属,显优于常规法;但对多数受检化学物,却未观察到这即人类细胞的细胞调控机制和DNA修复机制不同一优点。观察还发现,在双核细胞的胞质中,细胞通于啮齿类动物。WTK1细胞是新近发展的用于检测过各种途径形成的微核间或微核与主核间相互融合TK位点基因突变的细胞系,它与TK6细胞来自同

的机会增加,从而加大了微核的体积,减少了微核的

一母细胞,唯一不同之处是WTK1细胞为P53基因数目(16)。还发现加入CYB后,无论体内或体外微核—110

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被排出细胞的机会增多,故使胞质分裂阻断法的敏感细胞,经过培养分析微核来判断肿瘤对射线的敏感性下降(17)。而且Lindholm发现CYB可能诱发微核性。不过,微核率与对射线的敏感性之间有无良好的

()

形成(18)。为此,日本学者应用哺乳类细胞系发展了相关性,还未取得一致意见23。

其它细胞微核试验一种不需CYB的更为简便的体外微核试验技术,并116　认为该法可以代替体外染色体分析(19)。113　肝原代细胞微核试验

人和动物的胃粘膜、人的口颊上皮、人发毛囊、植物类的蚕豆根尖、紫露草等多种细胞的微核试验都有

肝脏是体内代谢功能最活跃的器官,利用肝原代报道。细胞作为靶细胞进行体外微核试验,一个非常突出的

体外微核试验的新应用优点是这种细胞仍保留了肝微粒体代谢酶系和其它2　酶系,靶细胞本身即具有转化前诱变剂和前致癌物为

体内非整倍体的形成与自发性流产、先天畸形、

活性分子的能力,因此在测试系统中不必另加代谢活智力发育迟缓和致癌过程有关,而许多从结构上分析化系统。但由于肝细胞分裂很缓慢,一般状态下不适为高度可疑的非整倍体诱发剂在环境及临床中正广于做微核试验,故长期以来一直未用作微核试验的靶泛使用,国际上对非整倍体形成机制及诱发因素研究细胞。直到近几年发展起来可使大鼠肝细胞分裂的已经获得很多有价值的成果。微核试验是目前非整细胞培养技术,才使肝原代细胞微核试验得以发展。倍体诱发剂的主要检测方法之一,微核可由无着丝粒已有应用该方法研究X线、二乙基亚硝胺、MMS、环,在鉴别微核来源的磷酰胺诱发肝原代细胞微核的报道(20)。但是,目前前提下,。目尚无有效方法在体外培养条件下维持肝细胞代谢酶:

　Sumner染色后检查微的活性,每次实验都需重新制备,使用不方便;另外,可能由于在分离肝细胞时会造成DNA,,据此判断微性对照组微核率较高,核是来自整条染色体或无着丝粒断片。由整条染色。114　人精子2Kamiguchi于年首次报道了用人精子与去

体形成的微核被认为是由非整倍体诱发剂引起的,而无着丝粒断片则是由断裂剂引发的。

212　微核DNA含量　Feulgen染色后分析测定微

透明带地鼠卵受精,培养至2细胞胚的微核试验(21),

核中DNA含量,通常非整倍体诱发剂诱导的微核

应用该技术研究γ射线体外照射健康人精子后的遗DNA含量高于断裂剂诱导的微核DNA含量。微核面积　Wright染色,一般断裂剂形成的微传效应,结果表明物理性诱变因子诱发的染色体断裂213　

损伤在人精子2细胞胚微核试验中得到了充分表达。核面积大约是非遗传毒物诱发微核面积的一半,据此陈壁锋等也应用该技术研究了不依赖S期的化学断就可判断是由非整倍体诱发剂还是由断裂剂诱发的裂剂平阳霉素对人精子的遗传效应,证实该方法的敏微核。

免疫荧光法　应用抗着丝粒抗体免疫染色法检感性和稳定性较好。这一新的检测系统能直接反映214　

诱变剂对人类生殖细胞的诱变效应,为研究化学物质测微核中的着丝粒。具体方法是CREST抗体同着对人精子染色体损伤作用提供了一种新的简便快速丝粒蛋白抗原相结合,再以作为第二抗体的荧光抗抗的手段,它在遗传毒理学、医学遗传学和优生学等多体同CREST抗体结合,根据检测结果确定微核来个学科领域中以及环境化学物质的遗传毒性监测和源,判断微核诱导剂是非整倍体诱发剂还是断裂职业人群的遗传危害监护方面具有广阔的应用前剂(24)。景(22)。

115　人原代肿瘤细胞微核试验

215　荧光原位杂交(FISH)法　同时用端粒DNA探

针和γ卫星DNA探针在细胞中进行FISH,分析微核

培养人原代肿瘤细胞微核试验是为评价放疗效的有着丝粒信息,仅含端粒DNA探针信号的微核由果而发展起来的。用射线照射直接取自患者的肿瘤无着丝粒染色体断片形成;含有2个端粒DNA探针

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及一个γ卫星DNA探针信号者,则由落后的染色单体形成(25)。

体外微核试验有简便、经济、快速和灵敏度较高等特点。随着研究的深入和新方法的不断发展完善,可望成为短期筛测的主要手段。参考文献

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