微生物鉴定中常用的生理生化试验的观察 - 图文

微生物鉴定中常用的生理生化试验的观察

姓名：俞华军 班级：09生科三班 学号：200900140157 日期：2010/12/04

组别：四 同组者：谢英健 张刚刚 岳永胜 余振洋

一．实验目的

1．证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同

微生物有着不同的酶系统。

2．掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3．了解糖发酵的原理在肠细菌鉴定中的重要作用。 4．掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。

5．了解吲哚、甲基红试验的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法

二．实验原理

1.大分子物质的水解试验

微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质水解后，才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。

A．淀粉水解试验

某些细菌能够分泌一种胞外酶,即淀粉酶。它可将淀粉水解为小分子的糊精、麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用。

淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能产淀粉酶的微生物在含淀粉培养基上培养后，由于淀粉被细菌的淀粉酶水解，遇碘不再变蓝色，培养基上菌体周围会出现无色透明圈。据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。

如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小可初步判定该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。 B．油脂水解试验

脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。

培养基中菌苔出现红色斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。

2．糖发酵试验

糖发酵试验是最常用的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。

酸的产生可利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5．2（黄色）—6．8（紫色）]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。 3．吲哚和甲基红试验 A．吲哚试验

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吲哚试验是用来检测吲哚的产生。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。

色氨酸水解反应：

吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应：

大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。

B.甲基红试验

甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色(pH6.3)变为红色(pH4.2)，即甲基红反应。尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但这个试验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上仍然是有价值的。这两个细菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6。因此大肠杆菌为阳性反应，产气肠杆菌为阴性反应。

三．实验器材

1．菌种 ：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄杆菌、铜绿假单胞菌、

普通变形菌、产气肠杆菌。

2. 培养基 ：淀粉培养基、油脂培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培

养基 、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基。

3. 仪器或其他用具： 卢戈氏碘液、甲基红指示剂、乙醚、吲哚试剂、培

养皿、试管、接种环、试管架、德汉氏小管、酒精灯。

四．实验步骤

1．大分子物质的水解试验

A．淀粉水解试验

（1）将固体淀粉培养基灭菌熔化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。

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（2）用记号笔在平板底部划成四部分，并在四部分上本别写上枯草芽孢杆

菌、大肠杆菌、金黄色葡萄杆菌、铜绿假单胞菌四种菌的菌名。 （3）用无菌操作（点接种法）将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄杆

菌、铜绿假单胞菌分别接在平板指定的区域上。 （4）将平板倒置在37℃温箱中培养2d。

（5）两天后，观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈

氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板，观察出现的情况并记录。

B．油脂水解试验

（1）将固体淀粉培养基灭菌熔化后冷却至50℃左右，并充分摇荡，使油

脂分布均匀，无菌操作制成平板。

（2）用记号笔在平板底部划成四部分，并在四部分上本别写上枯草芽孢

杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄杆菌、铜绿假单胞菌四种菌的菌名。 （3）用无菌操作（点接种法）将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄

杆菌、铜绿假单胞菌分别接在平板指定的区域上，用十字划线法接在各自部分中央。

（4）将平板倒置。37℃温箱中培养2d。

（5）两天后取出平板，观察菌苔颜色，记录实验结果。 2．糖发酵试验

（1）去葡糖糖发酵培养基试管3支，分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，

第三支不接种，作为对照。另取乳糖发酵培养基试管3支，同样分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第三支不接种，作为对照，并贴上标签。

（2）在接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，倒置放入德汉氏小管，注意要

不留气泡。

（3）将所有的试管放在37℃温箱中培养2d。

（4） 两天后，观察各试管颜色变化及德汉氏小管有无气泡。 3．吲哚和甲基红试验 （1）将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入3支蛋白胨水培养基（吲哚试验）、

3支葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红试验）中，并置于37℃温箱中培养2d。 （2）结果观察

A．吲哚试验：往培养两天后的蛋白胨水培养基内加入3-4滴乙醚，

摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。观察现象并记录。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。

B．甲基红试验：培养两天后，往葡萄糖蛋白胨培养基培养物内加入

甲基红试剂2滴，观察现象并记录，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。

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五．实验结果记录

表一 大分子试验结果记录表

“+”表示阳性，表明淀粉被水解，“-”代表阴性。 菌种 淀粉水解试验 油脂水解试验 枯草芽孢杆菌 + + 大肠杆菌 - - 金黄色葡萄球菌 - - 铜绿假单胞菌 + +

铜绿 枯草

金葡 大肠

淀粉水解试验结果 油脂水解试验结果

表二 糖发酵试验结果记录表

“+”表示产酸或产气，小管内有气泡表明产气，颜色变为黄色表明产酸“-”表示不产酸或不产气 糖发酵类型 大肠杆菌 普通变形杆菌 对照组 葡萄糖发酵 + + - 乳糖发酵 + - - 对照 大肠杆

菌

产气肠杆菌

对照 产气肠杆菌

大肠杆菌

葡萄糖发酵培养基试验结果

乳糖发酵培养基试验结果

表三 吲哚和甲基红试验结果记录表

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“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应 菌种 吲哚试验 大肠杆菌 实验失败，无现象 产气肠杆菌 实验失败，无现象 对照组 - 甲基红试验 + - - 六．思考题

1．你如何解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？

答：淀粉是大分子物质，不能直接进入细菌等微生物体内，不能直接被

利用，而淀粉水解后产生的葡萄糖可以被利用，因为淀粉不能进入体内，所以微生物只能把淀粉酶分泌到体外从而使淀粉水解，从而可以利用淀粉，所以淀粉酶是胞外酶。

2．不利用碘液，你能否证明淀粉水解的存在？

答：淀粉水解产生的葡萄糖，可以利用葡萄糖的性质来检验，如加托伦

试剂或菲林试剂进行显色反应。

3．假如某些微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？ 答：不产气但产酸，有氧代谢消耗的氧气量与产生的二氧化碳量是一样

的，所以不产气，但产生的二氧化碳溶于水变碳酸，使培养液呈酸性。

4．解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的

存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？ 答：先是色氨酸在色氨酸酶的作用下水解：

再是吲哚与对二甲基氨基苯甲醛（吲哚试剂）反应：

产生玫瑰吲哚，为红色环状物。细菌呼吸第一步便是产生丙酮酸，所以若以丙酮酸作为色氨酸酶的指示剂，无法区别丙酮酸是来自色氨酸酶的分解作用还是呼吸作用。

5．为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？

答：尽管这两种微生物发酵葡萄糖都产生酸，但在培养后期，大肠杆菌

仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为费酸性末端产物，如乙醇、丙 酮酸等，时pH升至大约6。因此大肠杆菌为阳性，产

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