固定化酶技术

固定化酶在食品中的运用

摘要:固定化酶有许多优点，尤其是稳定性和可重复使用性使其在许多领域得到广泛应用。固定化酶技术是一门交叉学科技术，目前已得到长足的发展。介绍了固定化酶制备的传统方法以及一些新方法，同时对酶在一些性能优良的载体上的固定进行了综述。 关键词：固定化酶；制备；载体

酶是由活细胞产生的一类特殊的蛋白质催化剂(核酶除外)，具有催化效率高、底物高度专一、反应条件温和、反应容易控制等特点。酶的最大缺点是其不稳定性，在酸、碱、热及有机溶剂中易发生变性，活性降低或丧失；而且酶反应后，会在溶液中残留，造成酶反应难以连续化、自动化，同时也不利于终产品的分离提纯，这些都大大阻碍了酶工业的发展，所以有必要采取酶工程技术改善这些缺点。酶工程技术措施较多，其中酶的固定化技术是重要举措之一。酶的固定化是用人工方法把从生物体内提取出来的酶固定在特定的载体上或使酶与酶相交联，酶被限定在一定区域内，但仍保持原有高效、专一、条件温和的催化功能。通常酶是游离的，而经过固定化以后，酶被束缚在一定区域内，因而这样的酶被称为固定化酶。固定化酶在生物、医药、农业、食品、化工、能源开发、环境保护等方面得到了广泛应用。本文介绍了固定化酶的制备方法和优缺点，对其在食品行业中的应用情况进行总结，最后对其应用前景进行展望。 1固定化酶的制定方法[1-5] 1.1吸附法

吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法。吸附法较简便，酶活损失小，但酶与载体作用力小，易脱落。

物理吸附法是通过非特异性物理吸附作用，将酶固定到载体表面。载体主要有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂白土、高岭土、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、陶瓷、金属氧化物、淀粉、白蛋白、大孔树脂、丁基或己基—葡聚糖凝胶、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。

离子吸附法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体通过静电作用相结合的一种固定化方法。载体包含阴离子交换剂(如DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、纤维素-柠檬酸盐、TEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、IRA-410、IRA-900等)和阳离子交换剂(如CM-纤维素、Amberlite CG-50、IRC-50、IR-45、IR-120、

IR-200、XE-97、Dowex-50等)两大类。 1.2包埋法

包埋法可分为网格型包埋和微囊型包埋。包埋法较简单，酶活回收率较高，但发生化学反应时，酶易失活，所以常采用惰性材料作载体；另外，包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶。

网格型包埋是将酶包埋在高分子凝胶细微网格中，载体材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂、淀粉、明胶、卡拉胶、火棉胶、胶原、大豆蛋白、壳聚糖、海藻酸钠和角叉菜胶等。微囊型包埋是将酶包埋在高分子半透膜中，载体材料有硝酸纤维素、乙基纤维素、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙膜、聚酰胺、聚脲等。 1.3共价结合法

共价结合法包括载体共价结合和非载体共价结合。共价结合法具有酶与载体结合牢固、不易脱落的优点，但反应条件苛刻、操作复杂、酶活回收率低，甚至酶的底物专一性有时也会发生变化。载体共价结合又可分为两种：一种是先将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生共价偶联反应，常用的载体有多糖类衍生物、氨基酸的共聚体、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、乙烯二马来酸共聚体，多孔玻璃、陶瓷、卤乙酰、二嗪基或卤异丁烯基衍生物等；另一种是先在载体上共价连接一个双功能试剂，然后将酶共价偶联到双功能试剂上去，常用的载体有氨基乙基纤维素、DEAE-纤维素、琼脂糖的氨基衍生物、壳聚糖、氨基乙基聚丙烯酰胺、多孔玻璃的氨基硅烷衍生物等。

非载体共价结合又叫交联法，是通过双功能或多功能试剂，使酶与酶之间相交联的一种方法。此法不使用载体，作为交联剂的双功能或多功能试剂有戊二醛、甲苯-2，4-二异氰酸酯、双重氮联苯胺、N，N’-乙烯双马来亚胺、Tris等，其中最常用的是戊二醛。 1.4结晶法

结晶法是利用酶结晶而实现酶的固定化的方法。对于晶体来说，载体就是酶蛋白本身。结晶法提供了非常高的酶浓度，因此提高了单位体积的酶活力，对于活力较低的酶更具优越性；但在循环使用过程中，酶会有损耗，从而使得固定化酶浓度逐渐降低。

1.5分散法

分散法是使酶分散于水不溶相中，从而实现酶的固定化。对于在水不溶的有机相中进行的反应，最简单的固定化方法是将酶干粉悬浮于溶剂中；但如果酶分布得不好的话，会引起传质现象，导致酶活力降低。 1.6热处理法

热处理法是将含酶的细胞在一定的温度下加热一段时间，使酶固定在菌体内的固定化方法。热处理法只适合热稳定性较好的酶。在加热处理时，要掌握好温度和时间，以免引起酶的变性失活。 1.7 其它方法 1.7.1纳米技术处理

即将酶与纳米材料相结合，制备成纳米固定化酶。由于纳米材料的特殊理化效应，纳米固定化酶可以提高酶活性、优化酶的理化性质、加快酶反应速度、提高酶稳定性等，进而可提高酶的利用率和生产效率。 1.7.2超声波处理

利用超声波使高分子主链均裂，产生自由引发功能性单体，再聚合成嵌段共聚物载体来固定酶。 1.7.3 磁处理

磁性体Fe3O4与聚苯乙烯、含醛基聚合物等载体一起溶解混合后，再除去溶剂，可获得磁性载体。磁性高分子微球是指内部含有磁性金属或金属氧化物(如铁、钴、镍及其氧化物)，而具有磁响应性的超细粉末，也可作为磁性载体。磁性载体固定化酶具有磁响应性，可借助外部磁场简便地进行酶回收。 1.7.4 电处理

电聚合物作为酶固定化载体时，特别有利于酶电极类生物传感器的制备，这方面的应用目标主要是生物医学检测。 1.7.5辐射处理

γ射线引发丙烯醛与聚乙烯膜接枝聚合后，活性醛基可共价固定化葡萄糖氧化酶。CO60辐照冰冻态水溶性单体与酶的水溶液混合体时，将使单体聚合与酶固定化同步完成，其回到常温时，因冰融化而形成的多孔结构非常有利于底物与产物的扩散，并可提高酶的活性。

1.7.6等离子体处理

用等离子体活化处理聚丙烯膜接枝丙烯酸后，可用于固定化胰蛋白酶，等离子体引发的丙烯酰胺聚合可包埋固定葡萄糖氧化酶。此外，还有制备光敏载体、温敏载体、阵列式微囊载体等固定化酶的方法。上述各种方法各有其优缺点，实际应用时，常将两种或多种方法结合使用，例如吸附-交联法、包埋-交联法等。 2固定化酶的优缺点[1-2] 2.1固定化酶的优点

与游离酶相比，固定化酶具有以下优点：酶的稳定性提高，对温度和pH的适应范围增大，对抑制剂和蛋白酶的敏感性降低；酶反应条件容易控制，反应完成后，酶回收较简单，可重复使用，同时便于产品的分离和纯化，提高产物质量；可实现批量或连续操作，适于产业化、连续化、自动化生产。 2.2固定化酶的缺点

固定化酶也存在以下局限性：酶活力有所损失；较适合于小分子底物，大分子底物基本无法进行反应；不适于多酶反应体系。 3固定化酶在食品工业中的应用 3.1固定化酶在果汁中的应用

柑橘类产品加工中出现苦味是柑橘加工中的重要问题。造成苦味的物质有两类：一类为柠檬苦素的二萜烯二内酯化合物(A环和B环);另一类为果实中的黄酮苷。脱苦的方法主要有吸附法和固定化酶法。吸附法是一次去除苦味物质，而固定化酶法主要是利用不同酶分别作用于柠檬苦素和柚皮苷，生成不含苦味的物质。工业上采用固定化柚皮苷酶减少柑橘类果汁中的柚皮苷含量，Tsen等[6]在1989年使用甲壳素固定柚皮苷酶，并研究了固定化的动力学因子。Manjon等[7]使用空心玻璃床作为载体，分别在1977年使用DEAE-Sephadex，1978年使用单宁-2-氨基乙基纤维作为载体。1996年Puri等使用海藻糖， 1998年Soures等使用醋酸纤维和三醋酸纤维制成膜固定酶。 3.2固定化酶在食品添加剂和配料中的应用

固定化酶技术广泛应用于生产食品添加剂和配料的行业中。如：低聚果糖、天门冬氨酸、L-苹果酸、阿斯巴甜、酪蛋白磷酸肽(CPP)等，举例如下：

低聚果糖作为一种保健食品受到人们越来越多的重视，Jong等[9]等用固定化

[8]

酶生产低聚果糖，30天后酶活性仅损失了8%，产率达到1174g/L·h，所用蔗糖浓度为600g/L，进料速率2.7h-1，反应温度50℃。Chantal等[10]进一步优化了固定化酶法生产低聚果糖的工艺： pH5.5，温度55℃，蔗糖浓度750g/L，酶浓度5U/g蔗糖，产物浓度达到588g/L。

以富马酸为原料，天门冬氨酸和L-苹果酸都可以采用固定化酶生产。有文献报道，使用由大肠杆菌得到的天门冬氨酸酶催化富马酸与氨作用，可以得到L-天门冬氨酸，固定化富马酸酶将富马酸转化为苹果酸。一个10m3的固定化细胞柱每月可生产数吨L-天门冬氨酸和L-苹果酸。L-天门冬氨酸可以进一步生产阿斯巴甜，阿斯巴甜是二肽甜味剂，在工业上用化学合成。现在，已开始酶法合成，用固定化酶进行藕合反应，得到阿斯巴甜。

吴思方等[11]通过正交试验确定了固定化酶酶解酪蛋白生成活性肽CPP的最佳工艺条件，并生产得到了粗制CPP产品。作者使用自制的固定化胰蛋白酶，在酪蛋白浓度2%、pH7.5、温度50℃、时间2.5h条件下取得了最佳的水解效果。产品经过调整pH，离心等操作进行粗制，最终检测：α-CPP分子量为5000，含量11%，β-CPP分子量为3300，含量4%，总磷为3.64%，总氮为6.97%，氮磷比(N/P) 4.23。

王筱兰等[12]固定了来源米曲酶的β-半乳糖苷酶，在纤维床反应器中连续生产半乳糖寡糖。并确定了连续生产半乳糖寡糖的最佳工艺条件为底物浓度400g/L，反应温度50℃，pH6.0，停留时间40min。在连续反应36h时，加入1.5%D-半乳糖，半乳糖寡糖的得率由39.6%提高到66.2%，固定化酶反应器能基本稳定地操作96h。

吴定等[13]将壳聚糖溶解于20%的盐酸，配成25%的壳聚糖溶液，然后用注射器注射到含15%氢氧化钠和30%甲醇混合溶液中凝结成2mm左右的中空球形壳聚糖。经4%的戊二醛活化的中空球形壳聚糖分别与α-葡萄糖转苷酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、切枝普鲁兰酶在室温反应2h，4℃静置过夜，制备固定化酶。固定化酶的最适pH值约降低1单位，最适温度提高约10℃。固定化α-淀粉酶和β-淀粉酶的相对酶活力分别为7.2%和22.3%。四种不同的固定化酶重组构成酶催化反应器，生产低聚异麦芽糖含量达38.9%。

采用生物酶法，还可以从D，L-氨基酸中生产L-氨基酸。D，L-氨基酸首先

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/nd9v.html