诱变方法

EMS的诱变处理方法：

① EMS 母液的配制：为了安全和防上失效，配制前将需用的器皿，置冰箱内预冷，然后在冰浴中进行配制。取0.5ml EMS原液，加人到10 ml pH7.2磷酸缓冲液中，加盖，并轻轻转动试管。由于在水溶液中易失效，故尽可能低温保藏，并要现用现配。

②取新鲜的菌体，经前培养至对数期．离心洗涤，用缓冲液制成8 ml菌悬液（107-108ml-1）。对于丝状菌孢子，则前培养至萌动期，悬液含 106 ml-1。

③取EMS母液2ml，加人到以8ml的菌悬液中。在适宜温度下处理一定时间（根据预实验绪果确定）。处理的最终浓度为0 .lmol／L。对于真菌孢子，则为0.2-0.5rnol／L。

④EMS处理一定时间后，用50倍生理盐水稀释或加入一定量的2%NaS2O3溶液或多次离心、洗涤，以终止反应。

EMS是剧毒的诱变剂，在整个诱变过程，包括配制药品、操作处理、保存等都要严守安全，不能接触皮肤，所有接触过EMS的器皿，单独用大量水冲洗洗涤，或用10％NaS2O3溶液浸泡过夜，再用清水冲洗干净。

亚硝酸是一稀常用的诱变剂，毒性小．不稳定，易挥发．其钠盐易在酸性缓冲液中产生NO和NO2

（一）亚硝酸的诱变机制

脱去碱基中的氨基变成酮基，引起转换而发生变异。A→H，C→U，G→X。 A：T→G：C和G：C→A：T。亚硝酸的诱变也可以发坐回复突变。

亚硝酸除了脱氨基作用外，还可引起DNA交联作用，DNA复制，从而导致奕变。 （二）亚硝酸的处理方法 1．试剂的配制

（1）1mol／L pH4.5醋酸缓冲液

（2）0.1mol／L亚硝酸钠溶液

（3）0.07mol／L pH8.6磷酸氢二钠溶液 以上试剂用前均要灭菌。 2．处理方法

取孢子悬液1 ml，pH4.5醋酸缓冲液2ml及硝酸钠溶液lml，最后处理浓度为0.025 mol／L ；25-26℃保温10-20min，加入的磷酸氢二钠溶液 20 ml，使出下降至pH 6. 8左右，以终止反应。稀释分离于平板。

如果是处理细菌，亚硝酸最后浓度以0.05 mol／L。

在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度，否则会影响诱变效果。

羟胺的简称HA，常以盐酸羟胺形式存在，为白色晶体，溶于水，不稳定易分解，具腐蚀性。 1.羟胺的诱变机制

当羟胺浓度为0.1-1.0mol／L pH6.0时，主要与胞嘧啶反应，使羟化的C与A配对，在0.1-1.0mol／L pH9.0，羟胺可以与鸟嘧啶反应，10-3 mol／L时，羟胺可以与胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶起反应。但据分析，羟胺与T、G反应的是它的产物，而不是它本身。此外，羟胺有时还能和细胞中其他物质作用产生过氧化氯，也具有诱变作用。 2．羟胺的处理方法

常用浓度为0.1％-5％，可直接在溶液中处理，时间1-2h，然后分离培养。但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中。然后接入孢 子或细菌，在适温下培养，生长过程中处理．所用浓度比直接处理时低些。 六、金属盐类

用于诱变育种的金属盐类主要有氯化锂、硫酸锰等。其中氯化理比较常用，与其他诱变剂复合处理，效果相当显著。

氯化锂称之为助诱变剂，氯化锂是白色粉末，易溶于水，使用时

通常加到培养基中。

为了速免受破坏．倒平板时，当培养基温度冷却到50-60℃时才加入制成平板，然后把细菌或孢子涂布分离，处理终浓度为0.3％-1.5%。

实验思路：出发菌株（酶活较大菌株编号）—紫外诱变——选透明圈较大（与未诱变的菌株进行对照）的进行化学诱变——EMS和DES诱变——选透明圈较大（与未诱变的菌株进行对照）的进行氯化锂诱变——最终获得突变菌株

注：每次均需要做对照，测酶活，目的菌株选择：透明圈直径：菌落直径（HC值）较大的菌株进行下一步的诱变。

一、紫外诱变方法： 1 培养基

高氏1号液体培养基 发酵培养基

蛋白酶鉴定培养基（脱脂奶粉培养基） 2 步骤

一、孢子液的制备

挑取纯化的斜面培养物（目标菌株）一环接种于50ml/250ml的高氏培养基中，25°180-200r/min培养5d-7d，离心6000r/min，10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次，制成一定浓度的菌悬液（OD600=0.5±0.15）进行紫外诱变。每种菌做2个。 二、紫外诱变处理

取一定量的菌悬液放入6cm培养皿中（培养皿中液体厚度为2mm）,30cm垂直照射，并用磁力搅拌器进行搅拌，分别照射2,3,4min，将处理的菌液用无菌生理盐水进行梯度稀释分别稀释至10-1，-2，-3浓度，分别取0.1ml在蛋白酶鉴定培养基上进行涂布，至少做3个重复，同时对未经紫外处理的对照菌液也进行同样的梯度稀释后平板涂布，计算致死率，致死率=（1－诱变处理后每0.1 mL 菌落数/对照每0.1 mL 菌落数）×100%，根据经验致死率在70%-80%之间时，正突变率最高。涂布后的平板在暗处培养3-5d后观察，选取HC比值（透明圈直径/菌落直径）

较对照明显大的单菌落进行发酵（同时进行斜面保种），25°，200r/min，50ml/250ml装量，做3个平行，测其酶活。

二、化学试剂诱变（DES和EMS） DES诱变

挑取经紫外诱变后的斜面保种突变菌株于液体高氏1号培养基，50ml/250ml接种，25度，180r/min培养5-7d（根据实际情况） 诱变处理将处于对数生长期的菌液在室温下6 000 r/min 离心10 min，弃上清液，收集菌体。用10 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.0）洗涤2 次，然后重悬于pH 7.0 的磷酸缓冲液中，调整菌液浓度为108 个/mL（调整OD600=0.5左右即可）。移取4 mL 菌液到16 mL 磷酸钾缓冲溶液（pH 7.0）中，加入0.2 mL 硫酸二乙酯，分别振荡处理20、40、60 min，最后加入0.5 mL 25%硫代硫酸钠中止反应。将诱变处理20、40、60 min 的菌液分别稀释为10-1、10-2、10-3 三个稀释度，每种浓度做3个重复，取0.1ml平板涂布， 以未经化学诱变处理的出发菌为对照，25 ℃恒温培养箱中培养5d。将培养好的平板取出，菌落计数，计算致死率。挑取HC比值大的单菌落进行发酵（同时斜面保种），做3个平行重复，测其酶活。 EMS诱变

孢子悬液的制备请参见DES方法，

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/nchd.html