专题5 课题1、2 DNA的粗提取与鉴定复习学案人教版

专题5 课题1、2 复习学案

编写：李宗彪 时间：2006-5-11

课题1、DNA的粗提取与鉴定

1、提取生物大分子的基本思路：选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。

DNA的粗提取的基本思路：就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等的物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 2、DNA 粗提取的实验原理：

( 1 ）本实验用鸡血为实验材料的原因是：鸡血的红细胞有 ，细胞核中有 DNA 和蛋白质组成的 ．因为哺乳动物（如兔子等）血液的红细胞中没有 ，因此不能用哺乳动物的血液为本实验的材料。

( 2 ）提取 DNA 的原理是：利用 DNA 在 的氯化钠溶液中溶解度最低，形成沉淀析出；再利用 DNA 不溶于 ，但细胞中的其他物质可溶于酒精的特点，进一步提取出含杂质较少的DNA 。

( 3 ）制备鸡血细胞液的原理：用质量浓度为0.1g /m L 的柠檬酸钠作抗凝剂。用吸管吸去上清液的目的是去掉血浆，留下 ，因为血浆中没有 DNA 。 ( 4 ) DNA 的析出与获取原理：利用 DNA 在浓度较低的氯化钠溶液中溶解度小的原理，向含有 DNA 的浓度较高的氯化钠溶液中加入 ，稀释氯化钠溶液，使 DNA 的溶解度下降。这时，加上不断的搅拌，溶解度下降的 DNA 逐渐呈 。再通过过滤，滤去蛋白质，就可获得 DNA 的黏稠物了。（5） DNA 鉴定的原理：在沸水浴的条件下，DNA遇到二苯胺会被染成蓝色；鉴定时溶液颜色的深浅与溶液中DNA 含量的多少有关。 3、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性

酶：蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA没有影响。

高温：大多数蛋白质不能忍受60~80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。 洗涤剂：洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。

4、动物细胞的破碎比较容易，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌；如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。 5、实验过程注意事项：

（１）血细胞液加水后，必须充分搅拌，否则血细胞核不会充分破碎，溶解出的DNA量就会减少，过滤时采用单层纱布；

（２）所用的酒精必须充分预冷才能使用，冷酒精与含有DNA的氯化钠溶液的体积比是１：１，提取DNA丝状物的方法是用玻璃棒缓缓沿一个方向搅拌；

（３）实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡全血的主要原因是遗传物质DNA主要存在于血细胞的细胞核内；

（４）试验过程中两次加入蒸馏水，操作目的各不相同：第一次加蒸馏水，目的是使血细胞通过吸水胀破，释放出核内的DNA；第二次加蒸馏水，目的是稀释氯化钠溶液，使其浓度降至0.14mol／L，最终使大量DNA析出；

（５）鉴定实验所得的丝状物的主要成分是DNA，除了可用二苯胺做鉴定试剂外，还可用甲基绿试剂直接滴在玻璃棒上的丝状物上，因甲基绿与DNA亲和力强，所以若丝状物被染成蓝绿色则证明该物质是DNA；

（6）盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器

吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。

6、如果实验材料是植物细胞，加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。

7、二苯胺试剂要现配现用（斐林试剂也是现配现用），否则会影响鉴定的效果。 ８、实验室提取高纯度的DNA时，通常使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）或吐温等化学试剂。

课题２、多聚酶链式反应扩增DNA片段 １、DNA分子复制的过程

复制时间、特点、条件、场所、过程

２、多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。被广泛地应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。 ３、

４、在８０－１００℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，

５、Taq DNA聚合酶的应用，解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化；寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找；实验室中微生物的筛选，是人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

６、PCR反应的条件：稳定的缓冲液环境、DNA模板、分别于两条模板链结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶、能严格控制温度变化的温控设备。 ７、PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性（９５℃）、复性（５５℃）、延伸（７２℃）三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应。DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 ８、实验操作步骤：

（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）

（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液） （3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合） （4）将微量离心管放在离心机上（离心）

（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应） ９、课本６２页“操作提示”、６３页“结果分析与评价”

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