酶的固定化技术及其在食品工业中的应用

酶的固定化技术及其在食品工业中的应用

摘 要

酶的固定化是用人工方法把从生物体内提取出来的酶固定在特定的载体上，酶被限定在一定区域内，但仍保持其原有高效、专一、条件温和的催化功能。固定化酶在生物、医药、农业、食品、化工、能源开发、环境保护等方面得到了广泛应用。本文概述了固定化酶的制备方法及优缺点，总结了固定化酶在食品工业中的最新应用情况，并对其应用前景进行了展望。 关键词:固定化酶；制备；应用；食品工业

Technology of immobilized enzyme and its applications in

food industry

Abstract

Immobilization of enzyme is that enzyme, extracted from organic body, is fixed to a special vector.However,it has its original catalyzing functions with high efficiency, specificity and moderate reaction condition.Immobilized enzyme has been used in biology, medicine, agriculture, food industry, chemical industry, developing of energy source, environment protection and so on. In this paper, preparation methods, advantages and disadvantages of mi mobilized enzyme were introduced. And its applications in food industry were summarized.

Key words :mimobilized enzyme; preparation; application; food industry

酶是由生物体产生的具有催化活性的蛋白质，它能特定地促成某个化学反应而本身却不参加反应，具有反应效率高、条件温和、反应产物污染小、能耗低、反应容易控制等特点。这是任何无机催化剂都无法比拟的优点。但因为酶的化学本质是蛋白质，其最大弱点是不稳定性，对酸、碱、热及有机溶液容易发生酶蛋白的变性作用，从而降低或失去活性。而且酶往往在溶液中进行反应，反应以后会残留在溶液系统中不易回收，造成最终产品生化分离提纯操作上的麻烦。加之酶反应只能分批进行，难于连续化、自动化操作，这大大地阻碍了酶工程的发展应用。为克服上述缺点，要将游离酶固定化后进行应用。固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在载体上。由于固定化酶的运动被化学或物理的方法限制了，能将其从反应介质中回收，所以它原则上能在批量操作或连续操作中重复使用酶。固定化酶技术是酶工程的核心，它使酶工程提高到一个新水平。固定化酶不仅在食品、化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃，得到迅速发展和广泛的应用，而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求[1]。

1.固定化酶研究概况 1.1固定化酶的研究和概念

固定化酶的研究源于80年前，但真正开展大规模研究是从20世纪50年代初开始。1953年，Grubohofer等人将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶和345酶等结合固定在聚苯乙烯树脂重氮化载体上，实现实验室酶的固定化。1969年，日本人千火田一郎成功地把固定化氨基酰化酶反应应用于L，D-氨基酸的光学拆分上，这是国际上固定化酶应用于连续工业化生产的开端。1973年，千火田一郎等人采用固定化微生物细胞连续生产L-天冬氨酸。我国固定化酶研究开始于1970年，首先是中科院微生物所和上海生化所同时开始了固定化酶研究。此后，许多单位相继进行了固定化酶和固定化细胞的应用研究。近年来，固定化酶在食品、制药、化学分析、环境保护等方面的应用越来越广泛[2]。

酶的固定化就是通过化学或物理的处理方法，使原来水溶性的酶与固态的水不溶性支持物相结合或被载体包埋。因而，固定化酶一般可以被认为是不溶性酶。 1.2固定化酶性质

固定化酶具有如下性质：酶的稳定性提高、最适pH值改变、酶的活性和催化底物有所变化、最适温度有所提高。酶固定化处理后一般稳定性有较大提高，对温度适应范围增大，对抑制剂和蛋白酶的敏感性降低；反应完成后，可通过简单的方法回收酶，酶活力降低不多，这样可使酶重复使用；同时由于酶没有游离到产品中，便于产品的分离和纯化；实现批量或连续操作模型的可能，适于产业化、连续化、自动化生产。 1.3 固定化酶的优缺点[ 3-4]

固定化酶技术是将酶用人工方法固定在特定载体上，进行催化、生产，因而固定化酶一般可以被认为是不溶性酶。与水溶性酶相比，优点如下： (1)易于将固定化酶与底物、产物分开，方便后续的分离和纯化； (2)可以在较长时间内连续生产；

(3)酶的稳定性和最适温度提高，最适pH值改变，对温度和pH值适应范围增大，对抑制剂和蛋白酶敏感性降低； (4)酶反应条件容易控制；

(5)较水溶性酶更适合于多酶反应； (6)可以增加产物的收率，提高产物质量； (7)酶的使用效率高，使用成本低； (8)适于产业化、连续化、自动化生产。

与此同时，由于酶的分离、固定化处理等原因，固定化酶也具有一些难以避免的缺点：

(1)在固定化过程中，酶活力会损失，尤其是胞内酶，预分离过程使酶活力损失

较大；

(2)生产成本提高，工厂初期投资大；

(3)只能用于水溶性底物，而且较适合于小分子底物，大分子底物基本无法进行反应；

(4)不适宜于多酶反应，部分酶还需要需要辅助因子的协助才可以有效反应。

2. 固定化酶制备方法[ 3-7] 2.1 吸附法

吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法。吸附法较简便，酶活损失小，但酶与载体作用力小，易脱落。物理吸附法是通过非特异性物理吸附作用，将酶固定到载体表面。载体主要有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂白土、高岭土、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、陶瓷、金属氧化物、淀粉、白蛋白、大孔树脂、丁基或己基—葡聚糖凝胶、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。离子吸附法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体通过静电作用相结合的一种固定化方法。载体包含阴离子交换剂(如DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、纤维素-柠檬酸盐、TEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、IRA-410、IRA-900等)和阳离子交换剂(如CM-纤维素、Amberlite CG-50、IRC-50、IR-45、IR-120、IR-200、XE-97、Dowex-50等)两大类。 2.2 包埋法

包埋法可分为网格型包埋和微囊型包埋。包埋法较简单，酶活回收率较高，但发生化学反应时，酶易失活，所以常采用惰性材料作载体;另外，包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶。网格型包埋是将酶包埋在高分子凝胶细微网格中，载体材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂、淀粉、明胶、卡拉胶、火棉胶、胶原、大豆蛋白、壳聚糖、海藻酸钠和角叉菜胶等。微囊型包埋是将酶包埋在高分子半透膜中，载体材料有硝酸纤维素、乙基纤维素、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙膜、聚酰胺、聚脲等。 2.3 共价结合法

共价结合法包括载体共价结合和非载体共价结合。共价结合法具有酶与载体结合牢固、不易脱落的优点，但反应条件苛刻、操作复杂、酶活回收率低，甚至酶的底物专一性有时也会发生变化。载体共价结合又可分为两种:一种是先将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生共价偶联反应，常用的载体有多糖类衍生物、氨基酸的共聚体、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、乙烯二马来酸共聚体，多孔玻璃、陶瓷、卤乙酰、二嗪基或卤异丁烯基衍生物等；另一种是先在载体上共价连接一个双功能试剂，然后将酶共价偶联到双功能试剂上去，常用的载体有氨基乙基纤维素、DEAE-纤维素、琼脂糖的氨基衍生物、壳聚糖、氨基乙基聚丙烯酰胺、

多孔玻璃的氨基硅烷衍生物等。非载体共价结合又叫交联法，是通过双功能或多功能试剂，使酶与酶之间相交联的一种方法。此法不使用载体，作为交联剂的双功能或多功能试剂有戊二醛、甲苯-2，4-二异氰酸酯、双重氮联苯胺、N，N′-乙烯双马来亚胺、Tris等，其中最常用的是戊二醛。 2.4 结晶法

结晶法是利用酶结晶而实现酶的固定化的方法。对于晶体来说，载体就是酶蛋白本身。结晶法提供了非常高的酶浓度，因此提高了单位体积的酶活力，对于活力较低的酶更具优越性；但在循环使用过程中，酶会有损耗，从而使得固定化酶浓度逐渐降低。 2.5 分散法

分散法是使酶分散于水不溶相中，从而实现酶的固定化。对于在水不溶的有机相中进行的反应，最简单的固定化方法是将酶干粉悬浮于溶剂中；但如果酶分布得不好的话，会引起传质现象，导致酶活力降低。 2.6 热处理法

热处理法是将含酶的细胞在一定的温度下加热一段时间，使酶固定在菌体内的固定化方法。热处理法只适合热稳定性较好的酶。在加热处理时，要掌握好温度和时间，以免引起酶的变性失活。 2.7 其它方法

2.7.1 纳米技术处理 即将酶与纳米材料相结合，制备成纳米固定化酶。由于纳米材料的特殊理化效应，纳米固定化酶可以提高酶活性、优化酶的理化性质、加快酶反应速度、提高酶稳定性等，进而可提高酶的利用率和生产效率。 2.7.2 超声波处理 利用超声波使高分子主链均裂，产生自由引发功能性单体，再聚合成嵌段共聚物载体来固定酶。

2.7.3 磁处理 磁性体Fe3O4与聚苯乙烯、含醛基聚合物等载体一起溶解混合后，再除去溶剂，可获得磁性载体。磁性高分子微球是指内部含有磁性金属或金属氧化物(如铁、钴、镍及其氧化物)，而具有磁响应性的超细粉末，也可作为磁性载体。磁性载体固定化酶具有磁响应性，可借助外部磁场简便地进行酶回收。 2.7.4 电处理 电聚合物作为酶固定化载体时，特别有利于酶电极类生物传感器的制备，这方面的应用目标主要是生物医学检测。

2.7.5 辐射处理 γ射线引发丙烯醛与聚乙烯膜接枝聚合后，活性醛基可共价固定化葡萄糖氧化酶。CO60辐照冰冻态水溶性单体与酶的水溶液混合体时，将使单体聚合与酶固定化同步完成，其回到常温时，因冰融化而形成的多孔结构非常有利于底物与产物的扩散，并可提高酶的活性。

2.7.6 等离子体处理 用等离子体活化处理聚丙烯膜接枝丙烯酸后，可用于固定化胰蛋白酶，等离子体引发的丙烯酰胺聚合可包埋固定葡萄糖氧化酶。此外，

还有制备光敏载体、温敏载体、阵列式微囊载体等固定化酶的方法。上述各种方法各有其优缺点，实际应用时，常将两种或多种方法结合使用，例如吸附-交联法、包埋-交联法等。

3 固定化酶在食品工业中的应用[8-23] 3.1 固定化酶在食品添加剂和配料中的应用

固定化酶技术广泛应用于生产食品添加剂和配料的行业中。如:低聚果糖、天门冬氨酸[8]、L-苹果酸、阿斯巴甜、酪蛋白磷酸肽(CPP) [9]等，举例如下:低聚果糖作为一种保健食品受到人们越来越多的重视，Jong等[10]等用固定化酶生产低聚果糖，30天后酶活性仅损失了8%，产率达到1174g/L.h，所用蔗糖浓度为600g/L，进料速率2.7h-1，反应温度50℃。Chantal等[11]进一步优化了固定化酶法生产低聚果糖的工艺: pH5.5，温度55℃，蔗糖浓度750g/L，酶浓度5U/g蔗糖，产物浓度达到588g/L。以富马酸为原料，天门冬氨酸和L-苹果酸都可以采用固定化酶生产。有文献报道，使用由大肠杆菌得到的天门冬氨酸酶催化富马酸与氨作用，可以得到L-天门冬氨酸，固定化富马酸酶将富马酸转化为苹果酸。一个10m3的固定化细胞柱每月可生产数吨L-天门冬氨酸和L-苹果酸。L-天门冬氨酸可以进一步生产阿斯巴甜，阿斯巴甜是二肽甜味剂，在工业上用化学合成。现在，已开始酶法合成，用固定化酶进行藕合反应，得到阿斯巴甜[12]。

吴思方等通过正交试验确定了固定化酶酶解酪蛋白生成活性肽CPP的最佳工艺条件，并生产得到了粗制CPP产品。作者使用自制的固定化胰蛋白酶，在酪蛋白浓度2%、pH7.5、温度50℃、时间2.5h条件下取得了最佳的水解效果。产品经过调整pH，离心等操作进行粗制，最终检测:α-CPP分子量为5000，含量11%，β-CPP分子量为3300，含量4%，总磷为3.64%，总氮为6.97%，氮磷比(N/P) 4.23。王筱兰等[13]固定了来源米曲酶的β-半乳糖苷酶，在纤维床反应器中连续生产半乳糖寡糖。并确定了连续生产半乳糖寡糖的最佳工艺条件为底物浓度400g/L，反应温度50℃，pH6.0，停留时间40min。在连续反应36h时，加入1.5%D-半乳糖，半乳糖寡糖的得率由39.6%提高到66.2%，固定化酶反应器能基本稳定地操作96h。吴定等[14]将壳聚糖溶解于20%的盐酸，配成25%的壳聚糖溶液，然后用注射器注射到含15%氢氧化钠和30%甲醇混合溶液中凝结成2mm左右的中空球形壳聚糖。经4%的戊二醛活化的中空球形壳聚糖分别与α-葡萄糖转苷酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、切枝普鲁兰酶在室温反应2h，4℃静置过夜，制备固定化酶。固定化酶的最适pH值约降低1单位，最适温度提高约10℃。固定化α-淀粉酶和β-淀粉酶的相对酶活力分别为7.2%和22.3%。四种不同的固定化酶重组构成酶催化反应器，生产低聚异麦芽糖含量达38.9%。采用生物酶法，还可以从D，L-氨基酸中生产L-氨基酸。D，L-氨基酸首先被转化为酰基-D，L氨

基酸，然后用固定化氨基酰化酶进行拆分得到光活性的L-氨基酸和完整的酰基-D-氨基酸。D-氨基酸再消旋化、重新拆分处理即可得到L-氨基酸。日本的TanabeSeiyaku公司有使用10m3的固定化氨基酰化酶柱，进行氨基酸拆分操作，每月可以生产5~20吨L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸。 3.2 固定化酶在乳制品中的应用

牛奶是人们熟悉的营养佳品，其中含有5%的乳糖。由于部分人体内缺乏乳糖分解酶(即乳糖酶或半乳糖酶)，饮用后会导致腹泻等症状，因此，无乳糖牛奶成为一种客观的需求。为了解决该问题，曾采用聚丙烯酰胺包埋法，将乳糖酶固定化后，于牛奶作用，去除乳糖。该研究在美国和日本极为盛行，在意大利，科学家从大肠杆菌的酵母中提取精制乳糖酶，用三乙酰纤维素膜包埋，生产无乳糖牛奶，该方法酶稳定性高，可以连续生产80天以上。此外，乳糖在温度较低时易结晶，用固定化乳糖酶处理后，可以防止其在冰淇淋类产品中结晶，改善产品口感，提高产品品质。

3.3 固定化酶在油酯工业中的应用

脂肪酶可以催化酯交换、酯转移、水解等反应，所以在油酯工业中有广泛应用。1，3-特异性脂肪酶可酶促酯交换反应，将棕榈油改性为代可可酯。代可可酯是生产巧可力的原料，价格甚高，而棕榈油价廉，因此该工艺受到重视。Blooner[15]等用脂肪酶将棕榈油转化成代可可酯，Goto等用表面活性剂处理固定化酶，使酶活性大幅度提高，并延长固定化酶的寿命。 3.4 固定化酶在果汁中的应用

柑橘类产品加工中出现苦味是柑橘加工中的重要问题。造成苦味的物质有两类:一类为柠檬苦素的二萜烯二内酯化合物(A环和B环);另一类为果实中的黄酮苷。脱苦的方法主要有吸附法和固定化酶法。吸附法是一次去除苦味物质，而固定化酶法主要是利用不同酶分别作用于柠檬苦素和柚皮苷，生成不含苦味的物质

[16]

。工业上采用固定化柚皮苷酶减少柑橘类果汁中的柚皮苷含量， Tsen等在

1989年使用甲壳素固定柚皮苷酶，并研究了固定化的动力学因子。Manjon等使用空心玻璃床作为载体，分别在1977年使用DEAE-Sephadex， 1978年使用单宁-2-氨基乙基纤维作为载体。1996年Puri等使用海藻糖， 1998年Soures等使用醋酸纤维和三醋酸纤维制成膜固定酶[17]。 3.5 固定化酶在茶叶加工中的应用

茶饮料质量的提高一方面是通过去除异味，提高适口性;另一方面是提高营养价值，提高人体对有益成分的吸收率。目前，固定化酶法已经开始应用于茶饮料中，并从上述两方面均取得了良好的效果。比如:固定化的单宁酶和果胶酶。单宁酶是一种水解酶，可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚酸键。将单宁酶应用于茶叶饮料可以改善茶饮料的品质[18]。Lauren等报道用固定化的单宁酶处理

红茶，提高茶汤中可溶性铁和钙的含量。若在绿茶加工中使用单宁酶，可以部分消除夏秋茶苦涩味道，提高茶饮料品质。

果胶酶是作用于果胶质的D-半乳糖醛酸残基之间的糖苷键，使高分子的聚半乳糖醛酸降解为小分子物质。茶叶中的水溶性果胶，与茶叶的品质密切相关。伊军峰[19]采用果胶酶对茶汁降解作用进行研究，找出果胶酶的最佳工艺，得到果胶酶提高茶汁膜分离性能的结论。刘新民等用海藻酸钠、二醋酸纤维、明胶分别作为固定化果胶酶的载体，比较载体的用量、交联剂的浓度、酶量、pH等，结果表明:选择15%浓度的明胶为载体， 5%浓度的戊二醛为交联剂，酶量5%，在pH3.5下制备固定化果胶酶，其活力回收率可以达到67.74%，重复回收使用10次后，酶活力还可以保留80%以上。张应玖等研究重氮化的对氨基苯磺酰乙基纤维素为载体制备固定化果胶酶的最佳条件。研究发现:在pH4.6，0.15M磷酸盐缓冲液中，按照每克载体加入2163活力单位的酶的比例进行偶联反应12h， pH4.6转移至pH4.2，最适温度变宽，酶热稳定性增强，半衰期为32.5天[20]。 3.6 固定化酶在生物传感器中的应用

生物传感器被认为是一种由受体、抗体或酶构成的生物感应层于换能器紧密连接而能提供环境组成信息的感应器[21]。如:测量电流以及电位的酶电极，酶热敏电阻装置，以场效应管为基础的生物传感器，及以生物发光及化学发光为基础的纤维-光学传感器，它们都应用不同类型的固定化酶。固定化葡萄糖氧化酶传感器是其中应用的为广泛的一种。1967年， Clark[22]采用固定化酶技术，把葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上再和氧电极结合，组装成第一个酶电极—葡萄糖电极。利用活蚕液状丝素蛋白的变性作用制备的葡萄糖氧化酶传感器，具有酶活性损失小，稳定性高，响应速率快及使用寿命长等优点。唐芳琼等[23]将纳米颗粒引入到葡萄糖电极研究中，并用易成膜的PVB作辅助膜基质，进行GOD的固定化研究。实验结果表明，利用纳米颗粒的表面效应可以显著提高GOD酶电极响应灵敏度。目前，制药厂将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和一种显色剂一起固定在试纸上，制成检验妇女是否妊娠的试纸，断定该妇女是有血糖、尿糖还是妊娠。这种检测技术十分简单，操作十分方便，应用极为广泛。用聚丙烯酰胺包埋葡萄糖氧化酶与氧电极组装成酶电极也可用来进行临床的血糖检测，并且可连续测定1000次血糖样品，低温存放180天保持90%的酶活力。

酶传感器的问世不仅使食品成分的快速、低成本、高选择性分析测定成为可能，而且生物传感器技术的持续发展将很快实现食品生产的在线质量控制，降低食品生产成本，给人们带来安全可靠及高质量的食品。有文献报道使用单胺氧化膜和氧电极组成的酶传感器测定猪肉的新鲜程度，反应时间4min，单胺测定线性范围为(2~5)×10-5mol/L。日本农林水产省研制出一种滋味传感器，可以品尝肉汤的风味，用于肉汤生产过程质量的控制。还可以采用电导型生物传感器检测

食品中有机农药的污染。另外，有报道显示用聚丙烯酰胺凝胶包埋细菌电极可快速测定污水中的BOD。 4 固定化酶的发展方向[24-25]

随着生物技术的迅速发展，固定化酶在工业中的应用日益广泛，从前述数例可见，固定化酶在上述的食品生产中起着举足轻重的作用，它简化了工艺、降低了成本、减少了污染，特别是用化学工艺很难进行的操作，用固定化酶较容易解决了。随着生物技术以及材料、化工等各相关学科的发展，相信固定化酶的工作会有新的突破，它的应用前景也将会更加美好。但是，并不是说一切可以使用酶的地方，都可以使用固定化酶来代替。即使可以使用固定化酶，也需要在经济方面进行核算，选择最佳的方案。鉴于目前已经取得的研究成果，下一步的研究可以从如下几个方面继续进行： 4.1 建立多酶固定化系统

固定化酶有许多粗酶液没有的特点，但制备固定化酶首先要经过大量复杂的分离、纯化工作，而且一种固定化酶只能用于特定的单步反应。应这种要求，工业生产中越来越多地应用了固定化细胞技术。这样就省去了酶分离纯化的时间和费用;并可同时进行多酶反应;而且可以保持酶在细胞中的原始形态，增加了酶的稳定性。

4.2 探索新型载体

进一步对天然高分子载体的不断挖掘和探究，对其进行改性，或利用超临界技术、纳米技术、膜技术等来固定化酶，解决固定化酶的稳定性和高效性。 4.3 开发新型、高效固定化酶反应器

一方面反应器还应该包括酶辅因子再生系统，保证需要辅酶的酶正常发挥作用;另一方面直接将使用遗传工程技术培养的优良菌株、固定化技术和连续反应器巧妙结合，简化生产过程。

参考文献：

[1]张斌，金莉.固定化酶及其在食品中的应用[J].中国食品添加剂，2006（1）：147～

150.

[2]张超，高虹，李冀新.固定化酶在食品工业中的应用[J].中国食品添加剂，2006（3）：136～141.

[3]彭志英.食品酶学导论[M].北京：中国轻工业出版社，2002. [4]罗贵民，曹淑桂，张今.酶工程[M].北京:化学工业出版社，2002.

[5]李彦峰，李军荣，伏莲娣，等.固定化酶的制备及应用[J].高分子通报，2001(2): 13~17.

[6]钱军民，张兴，吕飞，等.酶固定化载体材料研究新进展[J].化工新型材料， 2002，30(10): 21~24.

[7]曾晓雄.纳米技术在食品工业中的应用研究进展[J].湖南农业大学学报，2007， 33(1): 90~95.

[8] 党辉, 张宝善. 固定化酶的制备及其在食品工业的应用[J]. 食品研究与开发, 2004, (03)

[9] 胡和兵,王牧野,吴勇民,何明中. 酶的固定化技术及应用[J]. 中国酿造, 2006, (07) .

[10] Jong Soo Lee， Young Jun Choi IlH an Kim， ByongH. Lee.Purification and characterization of beta-galactosidase from alkalophilic and thermophilic Bacillus sp. TA-11 [J]. Biotechnology&Applied Biochemistry. 1995，22，(2): 191~ 201. [11] ChantalC， Park Y S， Shi Z P， Shiba S， Iijima S， Kobayashi T. Application of fuzzy reasoning to control of glucose and ethanol concentrations in bakers' yeast culture [J]. Applied Micro biology& Biotechnology. 1992，38，(5): 649 ~655. [12] 张超, 高虹, 李冀新. 固定化酶在食品工业中的应用[J]. 中国食品添加剂, 2006, (03)

[13]王筱兰，王白杨，蔡友良.固定化酶连续生产半乳糖寡糖[J].南昌大学学报(工科版)，2001，23 (4): 87 ~90.

[14]吴定，邹耀洪，王云，陈爱英，姚明兰.固定化酶生产低聚异麦芽糖工艺研究[ J].食品科学，2005，26 (3):125 ~127.

[15] Bloomer S， Brody E P. Method of preparing a milk polar lipid and sphingolipid enriched concentrate [P]. United States Patent Application Publication. US 2004 /0047947 A1; 2004.

[16] 乔德亮，胡冰，曾晓雄. 酶固定化及其在食品工业中应用新进展[J]. 食品工业科技, 2008, (01)

[17] PuriM，Marwaha S S，KothariRM. Studies on the applicability of alginate-entrapped naringinase for the debittering of kinnow juice [J]. Enzyme&Microbial Technology. 1996，18，(4):281 ~285.

[18] 罗丽萍，熊绍员. 固定化酶及其在食品工业中的应用[J]. 江西食品工业, 2003, (03) .

[19] 尹军峰，钱晓军，罗龙新，陈泽洁.果胶酶提高茶汁膜分离性能的研究[J].食品工业科技，2000，21 (5): 16 ~18.

[20] 张慧. 固定化酶在食品工业中的应用研究[J]. 安徽农学通报, 2008, (16) . [21] 李炜炜，陆启玉. 酶工程在食品领域的应用研究进展[J]. 粮油食品科技, 2008, (03) .

[22] Clark TG，CraigheadHG. Avidin-biotinmicro patterning methods for biosensor applications [ J]. Biomedical Microdevices，2003，5 (1): 29 ~34.

[23]唐芳琼，孟宪伟，陈东，冉均国，苟立，郑昌琼.纳米颗粒增强的葡萄糖生物传感器[ J]，中国科学B辑， 2000，30 (2): 119~124.

[24] 乔德亮，胡冰，曾晓雄. 酶固定化及其在食品工业中应用新进展[J]. 食品工业科技, 2008, (01) .

[25] 韩文静. 固定化酶的新型制备方法及其在食品工业中的应用[J]. 食品工业科技, 2009, (02) .

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