骨髓间充质干细胞移植急性一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠星形胶质细胞及髓鞘的变化

中国组织工程研究与临床康复 第15卷 第6期 2011–02–05出版

Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research February 5, 2011 Vol.15, No.6

骨髓间充质干细胞移植急性一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠星形胶质细胞及 髓鞘的变化*★

邢红霞1，殷 闯2，王玉梅1，刘 胜3，史莉瑾1，李 杰1

Changes in astrocytes and myelin sheath in rat models of delayed encephalopathy due to acute carbon monoxide poisoning following bone marrow mesenchymal stem cells transplantation

Xing Hong-xia1, Yin Chuang2, Wang Yu-mei1, Liu Sheng3, Shi Li-jin1, Li Jie1

Abstract Xing HX, Yin C, Wang YM, Liu S, Shi LJ, Li J. Changes in astrocytes and myelin sheath in rat models of delayed encephalopathy due to acute carbon monoxide poisoning following bone marrow mesenchymal stem cells transplantation.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(6): 1035-1039. [ ]

摘要 邢红霞，殷闯，王玉梅，刘胜，史莉瑾，李杰. 骨髓间充质干细胞移植急性一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠星形胶质细胞及髓鞘的变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(6):1035-1039. [ ]

期”(2 d~8周)出现一系列神经精神症状，严重0 引言 患者表现痴呆或去皮质强直，称为急性一氧化

碳中毒迟发性脑病(delayed encephalopathy 一氧化碳中毒在中国北方是常见病、多发after acute carbon monoxide poisoning，病，部分中、重度一氧化碳中毒患者，昏迷时DEACMP)。DEACMP在急性一氧化碳中毒患间超过4 h以上，在治疗清醒后经过一段“假愈

者中的发生率为12%~30%，最高达52.15%[1]。

ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 万方数据

1

First Department of Neurology, 3Second Department of General Surgery, First Affiliated

Hospital of Xinxiang Medical College, Weihui 453100, Henan Province, China; 2Department of Neurology, Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College, Xinxiang 453003, Henan Province, China

Xing Hong-xia★, Master, Associate chief physician,

Associate professor, First Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College, Weihui 453100, Henan Province, China xhxwh02@

Supported by: the Grant of Department of Science and

Technology of Henan Province in 2007, No. 072102310077*

Received: 2010-09-29 Accepted: 2010-12-26

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.org 邢红霞，等. 骨髓间充质干细胞移植急性一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠星形胶质细胞及髓鞘的变化

新乡医学院第一附属医院，13神经内一科，普外二科，河南省卫辉市453100；2新乡医学院第三附属医院神经内科，河南省新乡市 453003

邢红霞★，女，1972年生，河南省扶沟县人，汉族，2005年华中科技大学同济医学院毕业，硕士，副主任医师，副教授，主要从事神经变性性疾病研究。xhxwh02@

中图分类号:R394.2 文献标识码:B

文章编号:1673-8225 (2011)06-01035-05

收稿日期：2010-09-29

修回日期：2010-12-26(20100726007/GW·Q)

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万方数据

DEACMP持续时间长，无明确的发病机制，有人认为是由脑血管继发性病变所致[2]。病理可见脑血管扩张、瘀滞、小血管周围出血及围管性细胞浸润、脑水肿，部分小血管内皮细胞肿大，管腔变窄甚至完全闭塞[3]，从而引起神经元凋亡、坏死。亦有人认为，迟发性脑病系脑缺氧对少突胶质细胞的损害，从而影响髓鞘代谢和形成的缘故，病理可见大脑白质广泛脱髓鞘改变[4]。

近几年， DEACMP是目前临床领域急需攻克的重大难题之一。而应用骨髓间充质干细胞移植治疗DEACMP却未见报道。骨髓间充质干细胞具有向非造血组织以外的多种组织细胞分化的能力[5]，尤其是向神经细胞分化的研究更成为近年研究的热点，本实验拟在DEACMP模型大鼠应用颈动脉注射移植骨髓间充质干细胞，观察移植前后星形胶质细胞、髓鞘再生的变化。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2007-12 /2010-02在新乡医学院基础医学院进行。

材料：4周龄SD大鼠若干只，雌雄不拘，体质量45~60 g，用于分离培养骨髓间充质干细胞；成年SD大鼠180只，雌雄不拘，体质量250~300 g，均由河南省实验动物中心提供，动物合格证号410116。

主要试剂及仪器：

试剂及仪器 来源

L-DMEM 培养基

美国Gibco公司 胎牛血清

(FBS) 杭州四季青生物工程

有限公司 兔抗大鼠CD44、兔抗大鼠CD34、北京博奥森生物技术

兔抗大鼠

GFAP多克隆抗体、生

有限公司 物素化羊抗兔 IgG、封闭用正常

山羊血清、荧光 FITC标记羊抗 兔IgG

荧光显微镜

尼康80I/90I

倒置相差显微镜 奥林巴斯CKX31

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离培养[6]：拉颈脱臼法

处死4周龄SD大鼠，置体积分数75%乙醇中浸泡5 min，无菌条件下取出双侧股骨和胫骨，剔除股骨和胫骨上附着的肌肉，剪断骨的两端，用D-Hank’s液冲洗骨髓腔，吹打冲洗液成单

细胞悬液，置离心管中1 500 r/min离心5 min，弃上清，加完全培养基1 mL吹打混匀，并把它加入到已有3 mL完全培养基的培养瓶中，将细胞培养瓶置于37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱内培养，待细胞铺满瓶底80%时加入0.25%的胰酶消化，按1∶2的比例传代。

骨髓间充质干细胞的鉴定[7-8]：

骨髓间充质干细胞的形态观察：对原代培养4 d、第1，2，3代的细胞在倒置相差显微镜下观察并拍照。

骨髓间充质干细胞表面标记物的检测：取第4代的细胞制作细胞爬片共10张，培养箱中培养2 d，取出细胞爬片以间接免疫荧光法检测，在每张爬片上随机取20个视野计算细胞总数、CD44及CD34阳性细胞数，计算CD44及CD34阳性细胞的构成比。

DEACMP的制作与动物分组：取180只模型大

鼠随机抽签法分为3组：对照组、假手术组及干细胞移植组，干细胞移植组又分为模型制备结束0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、72 h、1周移植组，每组20只。 适应性喂养1周后采用腹腔注射纯度为99.9%的一氧化碳气体方法制作动物模型，首次注射剂量为100 mL/kg，以后每隔 3 h以60 mL/kg的剂量维持，连续注射4次[9-11]。注射完毕后大鼠出现运动迟缓、睡眠增多等症状，表明动物模型成功。

骨髓间充质干细胞移植：将大鼠用10%水合

氯醛麻醉后固定在手术台上，剪毛、局部消毒、剪开皮肤、钝性分离肌肉组织，暴露颈总动脉，用玻璃分针分离出左侧颈总动脉、颈内动脉和

颈外动脉。在颈外动脉上两点结扎，从中间剪断，把消化收集到细胞浓度为1×109 L-1的骨髓间充质干细胞悬液1 mL经颈外动脉注入到颈内动脉内；假手术组用等量的0.1 mol PBS代替细胞悬液，扎闭颈外动脉，局部洒青霉素粉剂后缝皮，置笼中待苏醒后正常喂养。对照组不进行细胞移植。

取材：分别于骨髓间充质干细胞移植后第

1，2，3，4周用10%水合氯醛(400 mg/kg)深度麻醉大鼠，生理盐水灌注后，断头取脑，在视交叉处切断脑组织，标记后固定，冰冻切片。

免疫组织化学检测胶质纤维酸性蛋白表达情况：以SP法行免疫组织化学检测滴加兔抗大鼠

GFAP(1∶300)多克隆抗体，阴性对照用PBS代替一抗，4 ℃过夜后滴加二抗， DAB显色剂显色，适时终止显色反应，封固，照相。

P.O. Box 1200, Shenyang 110004

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.org

坚牢绿-FCF染色观察细胞脱髓鞘情况：切片在室温条 件下复温20 min，PBS洗3次，入体积分数95%乙醇 2 min，入坚牢绿-FCF染液，室温下作用20 min，体积分数95%乙醇浸洗5 s，用0.3%碳酸锂溶液分化5 s，蒸馏水终止分化，脱水、透明、封固，镜下观察拍照，照相。

主要观察指标：骨髓间充质干细胞移植治疗一氧化碳中毒迟发性脑病动物模型前后星形胶质细胞及神经髓鞘变化。

_

统计学分析：各组数据结果均以x±s表示，由第二作者应用SPSS16.0统计学软件进行统计分析，采用两因素多水平重复测量的方差分析，两两比较采用q检验，以α=0.05为差异显著性水准。

2 结果 2.1 骨髓间充质干细胞的培养与鉴定 体外分离培养的骨髓间充质干细胞呈长梭形或者多角样，见图1，培养至第4代后细胞形状比较均匀，见图2，经CD44、CD34及免疫荧光显色后发现绝大多数细胞CD44呈阳性表达，见图3a，少数细胞CD34呈阳性表达，见图3b，阳性部位在细胞膜及细胞浆，细胞核不着色。CD44阳性细胞的构成比为92.0%，而CD34阳性细胞数的构成比为4.2%。

Figure 1

Bone marrow mesenchymal stem cells of primary

culture on d 7 (Inverted phase contrast microscope, ×200)

图1 第1代培养7 d时的骨髓间充质干细胞 (倒置相差显

微镜，×200)

Figure 2 Bone marrow mesenchymal stem cells of passage 4

on d 7 (Inverted phase contrast microscope, ×200)图2 第4代培养7 d时的骨髓间充质干细胞(倒置相差显微

镜，×200)

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万方数据

a: CD44 positive cells

b: CD34 positive cells Figure 3

CD44 and CD34-positive bone marrow mesenchymal

stem cells of passage 4 (Immunofluorescence staining, ×400)

图3 第4代骨髓间充质干细胞CD44、CD34阳性(免疫荧光

染色，×400)

2.2 大鼠染毒后的表现 大鼠在首次按100 mL/kg的剂量注射一氧化碳后2 min开始出现呼吸急促，5 min后呼吸明显加快，大鼠口唇、四肢及尾部呈樱红色，随后出现四肢肌张力降低，运动迟缓及运动不能，眼裂变小，瞳孔对光反射存在。20 min后大鼠全身软瘫，针刺无反应，角膜反射及瞳孔对光反射均消失。其中有5只大鼠死亡，个别死亡大鼠尸检发现，内脏重度充血伴散在出血点，脑组织充血水肿严重。上述症状体征持续至末次染毒后8 h方逐渐消失；此后21 d内观察，无特殊异常表现。最终175只大鼠进入结果分析。

2.3 各组干预后相关指标的检测结果 见表1。

6，12，24 h干细胞移植组大鼠脑内胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的平均吸光度值明显高于对照组及假手术组(P < 0.05)，0 h、3 h、72 h、1周干细胞移植组与对照组

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.org 邢红霞，等. 骨髓间充质干细胞移植急性一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠星形胶质细胞及髓鞘的变化

及假手术组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

a: 0 h transplantation group

b: 6 h transplantation group

c: 12 h transplantation group d: 24 h transplantation group

e: Sham operated group f: Control group

Figure 4 Expression of glial fibrillary acidic protein of each

group at 2 wk following treatment (×200)

图4 各组处理后2周胶质纤维酸性蛋白表达(×200)

干细胞移植各组移植后大鼠脑内胶质纤维酸性蛋白的表达在第1，2，3，4周之间差异无显著性意义(P > 0.05)。

大鼠脑内髓鞘的平均吸光度6，12 h干细胞移植组与其他组相比明显升高(P < 0.05)。见表2，图5。

其中6，12，24 h干细胞移植组移植后第2周髓鞘的平均吸光度表达高于第1，3，4周(P < 0.05)。而移植后第1，3，4周之间差异无显著性意义(P > 0.05)。

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万方数据

a: 0 h transplantation group

b: At 1 wk posttransplantationin 6 h transplantation group

c: At 2 wk posttransplantation d: At 3 wk posttransplantation in 6 h transplantation group

in 6 h transplantation group

e: At 4 wk posttransplantation f: At 2 wk posttransplantation

in 6 h transplantation group

in 12 h transplantation group

g: At 2 wk posttransplantation h: At 2 wk after treatment in

in 24 h transplantation group

control group

i: At 2 wk after treatment in sham operated group

Figure 5

Staining of myelin of each group at different time points after treatment (×200)

图5 各组处理不同时间点髓鞘染色(×200)

3 讨论

到目前为止，DEACMP损伤的主要部位为苍白球及神经纤维的髓鞘，且以脑室周围的神经髓鞘为主[1-2]。目前，制作DEACMP动物模型的常用方法有密闭式气体吸

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入法和腹腔内气体注射法[12-13]，本实验采用腹腔内气体注射法制作动物模型，首次以剂量为100 mL/kg注射一氧化碳气体后大鼠很快昏迷，皮肤呈现樱红色，与急性重度一氧化碳中毒的临床表现相似，以后每隔3 h以 60 mL/kg的剂量维持，连续注射4次。

治疗DEACMP常用的方法包括：高压氧治疗、紫外线照射充氧自血回输治疗[14]、药物治疗及对症支持治疗，目前最常用的方法是高压氧治疗，它能迅速纠正机体缺氧状态、有效改善循环、加速细胞的再生和修复等积极作用，在一定程度上可以缓解DEACMP患者的临床症状。但是，高压氧治疗及对症支持治疗不能从根本上有效改善患者的病情。因此到目前为止还没有特别有效的治疗方法，这一问题仍需要进行探索。

骨髓间充质干细胞是骨髓细胞中除造血干细胞之外的具有自我更新及多向分化潜能的干细胞[15]，形态为成纤维细胞的形态，本实验培养的细胞形状为梭形或者多角形，在形态上符合其特点。骨髓间充质干细胞可表达多种细胞表面标记物，但到目前为止还没有发现那一种标记物具有特异性，到目前为止比较公认的表面标记物是缺乏CD34、CD45、CD31等的表达，而表达CD29及CD44等[16]，本实验选用CD44及CD34对细胞进行鉴定，结果显示：细胞表面标记物CD44表达阳性，而CD34阳性细胞偶有零星表达，符合该细胞的特点。有实验提示骨髓细胞体外培养、纯化至第3代或第4代经表面标记物标记显示骨髓间充质干细胞的纯度可达到90%以上，本实验结果提示培养至第4代时阳性细胞的构成比为92.0%，细胞活力好，与其他人的研究结果基本相符。

星形胶质细胞是哺乳动物脑内广泛存在的一种细胞，胶质纤维酸性蛋白是成熟星形胶质细胞的特异性蛋白。星形胶质细胞在正常生理状态下对神经元起支持，营养，保护和绝缘作用。在脑损伤后，星形胶质细胞会反应性升高，这有助于神经的保护和神经功能的恢复。本实验结果显示：胶质纤维酸性蛋白的表达在6，12，24 h干细胞移植组明显高于对照组(P < 0.05)，可能是骨髓间充质干细胞进入脑内以后上调了星形胶质细胞的反应性，同时通过分泌的多种因子增强了星形胶质细胞的Na+

依赖性转运体经过“谷氨酸-谷氨酰胺”循环清除兴奋性神经递质的功能，减轻了氧化应激反应而起到保护作用。同时本实验结果显示：6，12 h干细胞移植组大鼠脑内髓鞘的平均吸光度值明显升高，表明骨髓间充质干细胞移植以后通过细胞本身以及它与其他细胞的协同作用分泌了多种神经营养因子改变了局部微环境，改善了神经髓鞘的营养状态，抑制了自由基及各种兴奋性氨基酸的损伤，促进了脱髓鞘的再生。同时本实验发现，6，12，24 h干细胞移植组大鼠脑内髓鞘的平均吸光度在2周时比第1，3，4周高，说明细胞移植后的积极作用在一二周最明显，2周后作用开始减弱。

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本实验发现骨髓间充质干细胞经左侧颈动脉移植到DEACMP大鼠体内后可以增加星形胶质细胞反应性，促进髓鞘的再生。移植的最佳时机为发病后的6~24 h之间。细胞移植后的积极作用在一二周最明显，2周后作用开始减弱。

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