蛋白质、多肽等大分子的质谱分析
更新时间:2023-11-13 09:05:01 阅读量: 教育文库 文档下载
蛋白质、多肽等大分子的质谱分析
检测仪器:
1、基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)
2、基质辅助激光解吸附电离串联飞行时间质谱(Autoflex III MALDI-TOF/TOF) 3、纳升液相电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪(micrOTOF-Q II? ESI-Qq-TOF) 主要应用:
1、生物大分子的分子量检测 2、蛋白质、多肽的纯度鉴定 3、蛋白质的肽指纹图谱检测 4、混合组分的分子量分布检测 5、合成物质的分子量检测与纯度评价 6、重组蛋白的分子量检测与纯度评价 7、蛋白质的多肽谱检测 8、血清多肽谱的检测
9、PEG修饰的蛋白药物的研究 样品要求:
1、样品含量: 50-100Fmol (液体约5ul) 2、样品形式: 液体;干粉;胶粒/条带
3、非胶样品: 挥发性盐<20mM,无PBS、SDS和尿素等物质 4、胶类样品: 银染过程中未使用戊二醛作为固定剂 5、保存方式: 液体建议低温,胶类用去离子水防干
蛋白质及多肽质谱鉴定
简介
博奥生物有限公司蛋白质实验室于2006年开始对外提供多肽和蛋白质测试服务,包括多肽和蛋白质的分子量和序列测定,蛋白种类鉴定。博奥采用串联质谱法(Tandem Mass Spectrometry, MS/MS)鉴定蛋白,可靠性高。蛋白经胰酶消化形成的肽段进入质谱,一级质谱检测多肽分子的大小,然后再将肽段打碎,形成一系列离子即N端离子系列(B系列)和C端碎片离子系列(Y系列)。质谱再检测碎片离子的大小,即二级质谱。将质谱数据与蛋白数据库进行比对,获得肽段的序列,特定的多肽序列对应着特定的蛋白,从而鉴定出待检测蛋白。除了鉴定单个蛋白,我们的液相色谱和质谱联用平台(Liquid
Chromatography- Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS)还具有分析混合蛋白的能力。MALDI-TOF MS(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)是另一种常用的质谱平台,通过肽指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)来鉴定蛋白质。MALDI-TOF MS的鉴定结果没有没有氨基酸序列信息,最终得到的是蛋白数据库多个质量相同或相似的候选蛋白列表,相对而言可靠性较低,并且MALDI-TOF MS无法鉴定混合蛋白。
服务流程
1.单个蛋白鉴定
A)用于鉴定纯化的单个蛋白的溶液或粉末,或经过SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)的单个条带或二维电泳的单个点。 B)蛋白酶解成多肽。
C)液相分离多肽,离子化的多肽进入质谱,母离子检测,母离子裂解成一系列子离子,子离子检测。 D)数据库检索。
E)人工验证,输出报告。 2.蛋白混合物的鉴定
A)用于鉴定含多种蛋白的混合物,根据样品的复杂程度采取不同的策略分离后再进行质谱鉴定。 3.差异蛋白分析
A)相对定量:比较两组细胞/体液中的蛋白,找出差异蛋白。
服务优势
采用真正的纳流液相系统,具有更高的灵敏度。 串联质谱,提供序列信息,蛋白鉴定可靠性高。
采用LC-ESI-MS/MS(Liquid Chromatography Electrospray Ionisation Tandem Mass Spectrometry)配置,适用于复杂样品。
鉴定实例
图2为不同量Apomyoglobin蛋白(Sigma,A8673)SDS-PAGE图。将电泳后的蛋白条带切胶,酶解后使用我们的液相色谱和质谱联用平台检测,结果如表1。质谱结果显示的是红色箭头所指示的位置切下的胶条(32ng)的鉴定结果。即使是考马斯亮蓝染色微弱的条带,仍能得到很好的质谱鉴定结果[表1]。
图2 Apomyoglobin蛋白电泳图
表1 质谱鉴定Apomyoglobin蛋白条带(32ng)结果
Reference Myoglobin [Equuscaballus] Score 90.27 Coverage 49.35 MW 17072.0 Accession 255683511 Peptide 139
质谱分析的目的主要是确认分子量,当然采用MS/MS可以部分的了解多肽序列的信息,但是这个需要比较全的数据库作为基础,分析才能比较准确。由于多肽性质不稳定,需要采用软电离技术,目前多肽分析主要是使用电喷雾(ESI-MS),基质辅助激光解吸(MALDI_MS)其中电喷雾可以给出多电荷峰,电荷数目和多肽序列上的氨基,胍基,咪唑基的数目有关,因此,经常给出了双电荷,三电荷等离子峰。MALDI_MS可以分析蛋白大分子,而且通常情况下很少带多电荷,因此数据直接对应了分子离子峰,容易分析。此外,通常在分析长肽或蛋白质过程中,需要添加NH4、Na、K等离子,提高灵敏度,所以,一般在质谱中或出现一组峰,分别对应:(M+H)+、(M+NH4)+、(M+Na)+、(M+K)+
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