食品生物化学实验教案

食品生物化学实验指导

高建华 曹劲松 宁正祥 编

华南理工大学 二O O六 年 三 月

目 录

第一部分 普通试验

实验一 果胶的制备和特性测定------------------------------------------------------------------- 一、从果皮中提取果胶 ----------------------------------------------------------------------------- 二、果酱的制备 -------------------------------------------------------------------------------------- 实验二 卵磷脂提取、鉴定及乳化特性试验 --------------------------------------------------- 实验三 蛋白质的盐析透析 ----------------------------------------------------------------------- 一、蛋白质的盐析 --------------------------------------------------------------------------------- 二、蛋白质的透析 ---------------------------------------------------------------------------------

实验四 氨基酸纸电泳分离鉴定 ------------------------------------------------------------------- 实验五 激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响 ------------------------------------ 一、激活剂、抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响 ---------------------------------------------- 二、温度和pH值对а-液化淀粉酶活力的影响 -------------------------------------------- 实验六 果蔬中过氧化物酶活力测定 ------------------------------------------------------------- 实验七 酶催化转氨基反应的纸层析鉴定 -----------------------------------------------------

1

1 1 1 2 6

7 9 10 12 5 5 10 14

实验八 焦糖的制备极其性质 ---------------------------------------------------------------------- 17 实验九 酶促褐变的抑制及叶绿素的性质 ------------------------------------------------------- 19

第二部分 综合设计性实验：一、酵母蔗糖酶的分离纯化

实验一 活性干酵母蔗糖酶的提取 -------------------------------------------------------------- 23 实验二 蔗糖酶的分级沉淀提取 ----------------------------------------------------------------- 25 实验三 蔗糖酶的葡聚糖凝胶层析法脱盐 ----------------------------------------------------- 实验四 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 ----------------------------------------------------- 实验五 蔗糖酶的交联葡聚糖凝胶色谱分离纯化 -------------------------------------------- 实验六 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离测定蔗糖酶纯度 ------------------------------------------- 实验七 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 -------------------------------------- 实验八 蔗糖酶的酶活特性研究 ------------------------------------------------------------------

辅助性实验

实验一 蔗糖酶活力测定 -------------------------------------------------------------------------- 实验二 Folin-酚法测定蛋白质含量 ------------------------------------------------------------- 实验三 考马斯亮蓝染料比色法测定蛋白质含量 ---------------------------------------------- 实验四 紫外吸收法测定蛋白质浓度 -------------------------------------------------------------

附表： 调整硫酸铵溶液饱和度计算表

附表1 0℃下由S1提高到S2时每100mL样品加固体硫酸铵的克数 -------------------- 附表2 室温下由S1提高到S2时每升加固体硫酸铵的克数 ------------------------------- 二、天然活性物质植物黄酮的提取及应用

实验一 藤茶植物黄酮的提取 ------------------------------------------------------------------- 实验二 重结晶法纯化黄酮提取物--------------------------------------------------------------

2

38 43 45

48 50 51

53 54

55 56

28 30 35 46 实验三 植物黄酮重结晶晶体形态观察---------------------------------------------------------- 58 实验四 紫外分光光度法测定总黄酮含量------------------------------------------------------- 60 实验五 高效液相色谱法测定蛇葡萄属植物黄酮的含量----------------------------------- 62 实验六 植物黄酮稳定性试验-------------------------------------------------------------------- 66 实验七 植物黄酮在油脂中的抗氧化活性测定----------------------------------------------- 67 辅助性实验：

实验一 油脂过氧化物值的测定---------------------------------------------------------------- 实验二 油脂酸价的测定---------------------------------------------------------------------------

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实验一 果胶的制备和特性测定

一、果胶的制备

（一） 目的要求 了解果胶的基本结构、果胶的分类及提取原理和方法。 （二） 实验原理

果胶物质可分为三类，原果胶、果胶及果胶酸，其基本结构是不同程度甲酯化和被 钠、钾离子中和的α-半乳糖醛酸以1,4-苷键形成的聚合物，分子量高达200000左右。 原果胶不溶于水，主要存在于出生细胞壁中，在一定温度经稀酸长时加热条件下，果皮 层细胞壁的原果胶发生水解，由于结构甲酯化程度降低及部分苷键断裂而转变成水溶性 果胶。

水溶性果胶经脱水干制有利于保藏和运输，果胶干制有直接干燥法和沉淀脱水两种方 法。直接干燥通常是把浓缩的果胶水溶液通过喷雾干燥获得。沉淀脱水则是根据果胶不溶 于高浓度乙醇特性，采用乙醇沉淀提取。乙醇沉淀提取果胶，控制酒精浓度极为关键，浓 度太高或太低都是不利的，浓度过高等于水分减少，水溶性的非胶物质没有机会溶解在水 中，会随果胶一起沉淀出来，使果胶纯度降低；反之如果乙醇浓度太低，水分含量过高， 果胶沉淀不完全，因此用乙醇沉淀提取果胶，乙醇用量最好为55%—60%左右。果胶溶液 中存在有微量电解质时，加入乙醇果胶将以海绵絮状沉淀析出，反之不易聚集析出。 柑橘类果皮是提取果胶的优良原料，新鲜果皮含果胶约1.5%—3%，干果皮则含9%-18%，柠檬皮果胶含量更多，新鲜果皮内含2.5%—5.5%，干果皮内含量高达30%—40%。

（三）试剂及材料

1、0.5%HCl溶液 量取12mL浓盐酸，加水稀释至1000mL。

2、1mol/LNaOH溶液 称取40gNaOH，用水溶解并稀释至1000mL。 3、95%乙醇。

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4、柑桔皮和柚子皮。

（四）操作方法

1、称取50—100g果皮，分切，把果皮放入沸水中煮沸3分钟，而后用清水漂洗，以除 去色素、苦味等非胶物质，并把多余水分除去。

2、把上述处理后的果皮放入600mL烧杯中，加入0.5%HCl 200—300 mL，一般以浸没 果皮为度，在搅拌条件下保持微沸提取20min。

3、趁热用4层纱布过滤，用少量50℃的热水分次将滤渣洗涤2—3次，合并滤液，冷 却至室温。

4、用1mol/LNaOH调整滤液的PH值至3—4。

5、缓缓向提取液加入95%乙醇约300 mL，并略加搅拌，待果胶呈棉絮状沉淀后，用四层纱布过滤，压干除去大量水分，滤渣则为粗制的果胶产品。 二、果酱的制备

（一）目的要求 了解果胶的性质和用途 （二）实验原理

果胶是亲水性多糖， 在PH=3-3.5、蔗糖含量为65%—70%、0.7%—1%的果胶水溶液经煮沸冷却后，可形成具有一定强度的三维网状结构凝胶，其主要作用力是分子间的氢键及静电引力。在凝胶过程中，溶液中的水含量对凝胶影响很大，过量的水阻碍果胶形成凝胶。果胶水化后和水分子形成稳定的溶胶，由于氢键的作用水分子被果胶紧紧地结合起来不易分离，向果胶溶液中添加糖类，其目的在于脱水，糖溶解时形成夺取水分的势能，促使果胶粒周围的水化层发生变化，使原来果胶表面吸附水减少，胶粒与胶粒易于结合成为链状胶束，促进果胶形成凝胶。在果胶-糖溶液分散体系内添加一定量的酸，可起到中和果胶所带的负电荷，减少了果胶分子变成阴离子的作用，促进它聚结成网状结构，而形成凝胶。果酱、果冻等食品就是利用这些特性生产的。 （三）试剂及材料

白砂糖、柠檬酸、柠檬酸钠、自制果胶。 （四）操作方法 1、配方

蔗糖70g、柠檬酸0.5 g、柠檬酸钠0.4 g、水20 g、自制果胶适量。

2、将柠檬酸、柠檬酸钠溶解于20 g水中，用蔗糖把果胶充分拌匀，加入柠檬酸水溶液。 3、在不断搅拌下，小火加热至沸，保温熬煮约10—15min，待水分含量为一定时，以 溶胶糖液以挂珠为度，冷却、观察、描述形成凝胶的体态。

三、实验结果讨论分析。

四、思考题

1、提取果胶前，用沸水处理果皮的目的是什么？

2、沉淀提取果胶前，为何需调整果胶溶液PH值？

3、若提取的果胶溶液含水量过大，采用何种方法浓缩果胶提取液，以减少乙醇用量？ 4、提取果胶后，采用何种方法回收乙醇？正确绘制回收乙醇的实验装置图。

5、用什么简易方法测定回收乙醇的浓度？

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6、果胶形成凝胶所需的条件是什么？

实验二、卵磷脂提取、鉴定及乳化特性试验

一、目的要求 学习提取卵磷脂的方法，了解卵磷脂的乳化特性性质。 二、实验原理

磷脂是分子中含磷酸的复合脂，分为磷酸甘油脂和鞘氨醇磷脂类，其醇类物质分别为甘 油和鞘氨醇。磷脂酰胆碱属磷酸甘油脂，俗名为卵磷脂，在生物体内以及食品工业应用中起着重要的作用。

卵磷脂是一种在动、植物中分布及广的磷脂，如植物的种子、动物的卵、脑及神经组织 均含有之，其中大豆中含量约为2.0%、卵黄中含量高达8%—10%、。卵磷脂在细胞中以游离态或与蛋白质结合成不稳定的化合物存在，易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂，不溶于丙酮。本实验采用乙醇提取蛋黄中的卵磷脂。 纯卵磷脂为白色的蜡状物，与空气接触后，因结构含不饱和脂肪酸被氧化后而呈黄色至黄棕色，粗制品中色素的存在可使之呈淡黄色。卵磷脂中的胆碱基在碱性条件下可分解成三甲胺，三甲胺有特异的鱼腥味，利用此性质可鉴别卵磷脂。

在生物体中的作用是保持细胞膜的通透性，控制动物体内脂肝代谢，防止脂肪肝的形成。在食品工业中广泛充当乳化剂、抗氧化剂和营养添加剂。

使互不相溶的两种液体中的一种呈微滴状分散在另一种液体中的作用称为乳化剂。这两种不同的液体称为“相”，在体系中量大的称为连续相，量小的为分散相，能使互不相溶的两相中的一相分散在另一相中的物质称为乳化剂。由卵磷脂的分子结构可知：

OOR2COCH2CHCH2OOCOPOHOCH2CH2NCH3OH3R1

卵磷脂分子中的R1脂肪酸为硬脂酸或软脂酸，R2脂肪酸为油酸、亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸等不饱和脂肪酸。脂肪酸残基端具有憎水性，其胆碱残基端具亲水性，因此是一种天然的乳化剂。在乳化过程中，当少量的油与乳化剂一起在大量水中用高速搅拌混合机混合，油滴将以微滴状分散在水相中，在细滴的表面上乳化剂以亲油的非极性端相对，而以其亲水的极性端伸向水中。由于极性相斥，体系中微滴之间的斥力比相互间的引力要大，因而形成稳定的乳浊液。

乳浊液的稳定性与系统中各组分间的比例、乳化剂种类及其用量、乳化的机械条件等密

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切相关。食品工业中可从大豆油精练过程中获得廉价卵磷脂。

三、试剂及材料 1、95%乙醇

2、10%NaOH溶液 称取10g氢氧化钠，用蒸馏水溶解并稀释至100mL。 3、鸡蛋 4、花生油 四、仪器设备

1、电热恒温水浴锅

2、磁力搅拌器

3、高速电动搅拌机

4、摄像显微系统（由电脑、摄像头、显微镜、摄像控制软件组成） 五、操作方法

（一）卵磷脂的提取

选新鲜鸡蛋一个，轻轻在鸡蛋两头击破一小孔，让蛋清从小孔流出，破壳取出蛋黄置小烧杯内，捣烂，搅拌下加入50℃ 95%乙醇60 mL，，保温提取5min，冷却过滤，将滤液置于瓷蒸发皿，水浴蒸干，残留物即为卵磷脂。

（二）鉴定卵磷脂

1、三甲胺试验：取少量本实验提取的卵磷脂于试管内，加入2mL 10%NaOH ,混匀，水浴加热，嗅之是否产生鱼腥味。

2、丙酮溶解试验：加入约5m l丙酮于装有卵磷脂提取物的瓷蒸发皿，不断用玻棒搅拌卵磷脂观察其在丙酮中的溶解情况。同时也是提纯卵磷脂的过程。 （三）乳化试验：

1、乳化液制备：按下表选择乳化液制备方法。

序号 1 2 蒸馏水 100mL 100mL 花生油 1mL 1mL 卵磷脂 / 适量 乳化处理方法及处理时间

2、利用显微摄像系统观察油脂在水中的乳化效果并对乳化液与非乳化液进行摄像，根据油脂在水相中的分散情况，评价油脂乳化试验的效果。

乳化效果摄像操作步骤：

（1）水平放置显微镜，开启并调节照明光源，装上合适的目、旋上适当的低倍物镜。 （2）用点滴管取少量乳化液滴在载玻片上，小心把盛有样品的载玻片放上光学显微镜的物台，用标本固定夹固定。移动标本移动器，使观察的部位对准聚光器上面的透镜中心。 （3）上下移动显微镜的粗调选钮，使物镜下至距离标本片最低的位置，但不能接触载玻片以免损坏镜头或标本。 （4）用眼睛在目镜上观察，两手向上慢慢旋动粗调使显微镜上升至视野中出现较清晰的被检物。

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（5）移动载片标本，寻找具有代表性的被检物点放在视野中心，反复调整微调旋钮使被检物至最清晰为止。

（6）把摄像头放入摄像连接管，拉开摄像光路开关，进入电脑摄像软件应用程序，把鼠标移至USB2.0相机菜单，出现 连接 按钮，点击 连接 →调整显微镜微粗细调旋钮至要检测的图象在视屏中清晰为止 → 点击捉捕图象键，对图象进行摄像→ 对摄影像片进行保存。点击 视屏键 可以返回图象观察状态，重新对另一图象进行摄像。

（7）测量摄像图中物体的大小：进入DN-2应用软件→调处所存图片文件→点击 测量菜单→ 选择 线测量 键→ 从测定物的起点拉动鼠标把测量连线连至测定物终点，从屏幕中可直接读出物体相关长度值（单位：μm）→ 点击 融合 键，将测量值标注在图片中→保存测量图片结果。

（8）打印分析摄像图谱。 3、乳化结果记录

乳化液处理静置15min后，观察比较各乳化实验结果并记录。 乳化剂种类 无 卵磷脂

六、实验结果讨论分析 七、思考题

1、 向卵磷脂粗品添加丙酮的作用是什么？可去除何种杂质？ 2、乳化过程要形成稳定的乳浊液，可采用什么仪器方法实现？ 3、使用生物显微镜的操作要点是什么？

油水分散处理 方法及条件 描述油水乳化体系 感官分析 描述显微镜观察油水乳化体系情况（油滴分散、大小等） 实验三、蛋白质的盐析透析

一、蛋白质盐析

（一）目的要求 了解蛋白质的沉淀作用，加深对影响蛋白质胶体分子稳定性因素的认识。

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（二）实验原理

水溶液中蛋白质分子由于表面生成水化层及蛋白质分子上某些基团离子化而使蛋白质分子表面带有电荷，增加了水化层的厚度而成为稳定的亲水胶体颗粒，水膜和电荷一旦被除去，蛋白质颗粒将由于失去电荷和脱水而发生沉淀。

向蛋白质溶液中加入无机盐（如硫酸铵、硫酸镁、氯化钠等）后，蛋白质便从溶液中沉淀析出，这种沉淀作用称为蛋白质盐析。其过程是一个可逆过程，当除去引起蛋白质沉淀因素后，被盐析的蛋白质仍可重新溶于水中，其天然性质不发生变化。

用不同浓度的盐可将不同种类蛋白质从混合溶液中分别沉淀的过程，称为蛋白质的分级盐析。例如蛋清溶液中的球蛋白可被半饱和的硫酸铵溶液沉淀提取，饱和的硫酸铵溶液可使清蛋白沉淀析出。因此，盐析法常被用于分离和提取各种蛋白质及酶制剂。 （三）试剂及材料

1、10%蛋清溶液 选新鲜鸡蛋，轻轻在蛋壳上击破一小孔，取出蛋清，按新鲜鸡蛋清1份，九份0.9%NaCl 溶液的比例稀释配制蛋清液，混匀，用四层纱布过滤后备用。 2、饱和硫酸铵溶液 称取76.6g硫酸铵溶于100mL 25℃ 蒸馏水中。 3、固体硫酸铵。 （四）操作方法

1、取两支试管，分别加入10%蛋清溶液5 mL，饱和硫酸铵5 mL，静置5min，观察有否沉淀物产生，沉淀物为何物？

2、取其一试管，用点滴管弃去上清夜，加水至沉淀物，观察沉淀是否会再溶解，说明沉淀反应是否可逆。

3、用滤纸把另一试管的沉淀混合物过滤，向滤液中添加固体硫酸铵至溶液饱和，注意观察溶液有否蛋白质沉淀产生，此沉淀又为何物？

注意：把溶液中硫酸铵固体沉淀与蛋白质沉淀区别开来。 二、蛋白质的透析

（一）目的要求 学习透析的基本原理和方法

（二）实验原理

透析是利用小分子能通过，而大分子不能透过半透膜的原理，把不同性质的物质彼此分开的一种手段。透析过程中因蛋白质分子体积很大，不能透过半透膜，而溶液中的无机盐小分子则能透过半透膜进入水中，不断更换透析用水即可将蛋白质与小分子物质完全分开。蛋白质和酶的提取过程，常用此法使之脱盐。

如果透析时间过长，可采用低温条件下进行，以防止微生物滋长、样品变质或降解。 透析袋材料通常有火棉胶、商品化透析袋等。 利用硝酸银和双缩脲反应的透析结果进行检验：

ClAg加入试剂AgCl

来源于透析用水

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蛋白质二肽以上CuSO4OH有色复合物紫红色Na2SO4

（三）试剂及材料

1、氯化钠蛋清溶液 取一个鸡蛋清蛋白，加入30%NaCl溶液100mL、250 mL蒸馏水混合均匀后，四层纱布过滤。

2、1%AgNO3 称取1g AgNO3 ,溶解于100 mL水中，贮存棕色瓶保存。 3、1%CuSO4 称取1g CuSO4，用水溶解并稀释至100mL。 4、10%NaOH 称取10g NaOH，用水溶解并稀释至100mL。 5、5%火棉胶 分析纯。 （四）操作方法

1、透析袋的制备 直接把5%火棉胶试剂约10 mL倒入洁净、干燥的100mL三角锥瓶底部，然后徐徐转动三角瓶，使火棉胶由底部至瓶口均匀分布于瓶内壁，同时弃去多余的火棉胶，将三角瓶倒置，自然风干10min。小心剥离三角瓶口薄胶，引自来水沿瓶内壁与袋膜间流入，使透析袋与瓶壁逐渐分离，取出透析袋，同时检查透析袋的完好性。

2、透析 把10mL氯化钠蛋清液注入透析袋内，扎紧透析袋顶部，系于一横放在盛有蒸馏水的烧杯的玻璃棒上，调节水位使透析袋完全浸没蒸馏水中。 3、透析情况检验

（1）无机盐透析检验：透析10 min后，自烧杯中取透析用水2 mL于试管中，用1%AgNO3检验氯离子是否能被透析出。

（2）蛋白质透析检验：自烧杯中另取透析用水2 mL于试管中，加入2 mL 10%NaOH，摇匀，再加1%CuSO4数滴，进行双缩脲反应，检验蛋白质是否被透析出。

（3）不断更换烧杯中的蒸馏水以加速透析进行，经数小时侯烧杯中的水不再有氯离子检出为止，则表明透析完成。因为蛋清溶液中的清蛋白不溶于纯水，此时可观察到透析袋中有蛋白沉淀出现。

三、实验结果讨论分析。

四、思考题

1、制作透析袋时能否用采用热风干燥加速其成膜？为什么？ 2、高浓度的硫酸铵对蛋白质溶解度有何影响，为什么？

3、盐析与透析在蛋白质、生物酶提取纯化中的意义。

4、蛋白质可逆沉淀反应与不可逆沉淀反应的区别在哪里？举例说明。

实验四、氨基酸纸电泳分离鉴定

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一、目的要求 通过电泳分离氨基酸，了解氨基酸的性质以及电泳分离技术的应用。 二、实验原理

带电粒子（胶体或分子）在直流电场作用下，能向异性电极迁移，这种现象称为电泳。带电粒子之所以能在电场的作用下迁移，是因为在一定PH环境条件下，不同的物质所带的电荷种类、数量不同，在一定的电场作用下，就以不同的速度向不同的电极方向移动，从而达到分离混合物和鉴定未知物的目的。带电粒子在电场内移动的方向及电泳速度，除取决于粒子的分子量和电荷量外，还与电场强度、溶液PH、缓冲溶液的离子强度以及电渗等因素有关。

电泳是离子在电场中通过介质的移动，按支持介质的不同可分为：（1）纸电泳：以滤纸、玻璃纤维等为支持物。（2）凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、淀粉凝胶等为支持物。（3）薄膜电泳：醋酸纤维素为支持物。氨基酸分离选用滤纸为支持介质进行电泳。

氨基酸在水溶液中通常解离成两性离子，它在酸性和碱性介质中的变化可用下式表示：

RCHNH2COOHOHNH3RCHCOOHOHRCHNH3COOH 在酸性介质中，氨基酸主要以阳离子状态存在，电泳时向阴极移动；在碱性介质中，氨基酸主要以阴离子状态存在，电泳时向阳极移动，当介质的PH值为氨基酸的等电点时，氨基酸以中性偶极离子存在，电泳时不向阴阳电极移动。

实验在pH=5.9的缓冲溶液中进行，一张被PH5.9缓冲溶液所湿润的滤纸的两端加上直流电压，在电场的作用下，加在滤纸支持介质的各种氨基酸样品，由于所带电荷性质不同，分别向正负极方向移动，电泳体系缓冲溶液偏离氨基酸的等电点越远，氨基酸所带的电荷越多，离子移动的速度也就越快，因各氨基酸迁移的速度均不相同，从而达到分离的目的。 三、试剂及材料

1、PH5.9 0.025mol/L 邻苯二甲酸氢钾—氢氧化钠缓冲溶液 称取邻苯二甲酸氢钾 5.10g，加水溶液至950mL ,用氢氧化钠调整PH=5.9，补水至1000mL 。 2、氨基酸溶液 0.5%亮氨酸、0.5%赖氨酸、0.5%天门冬氨酸。 3、氨基酸混合液。

4、氨基酸显色液 0.1%茚三酮丙酮溶液。 四、仪器设备 中压电泳仪、电泳槽。

五、操作方法

1、 电泳滤纸的裁剪 取层析滤纸裁成250×25mm 的滤纸条，用铅笔在滤纸的中心位置

标记样品电泳时的起始位置，在滤纸的两端标上正负极符号。如下图所示。 （+） × （-） 2、 向电泳槽添加适量的缓冲溶液，要求两槽缓冲液液面保持同一水平。

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3、 接上电泳仪主机，中压条件下预热10min。关闭电泳仪电源。

4、 用PH5.9缓冲液湿润滤纸条，然后用电吹风把多余的缓冲液吹干，把滤纸条按正负 极方向横架于电泳槽的支位上，滤纸面尽量绷直，滤纸两端下垂紧贴在定位板，末端浸入缓冲液约10mm 深。注意滤纸条不应接触电极，两滤纸间应保持一定间距。

5、用微量进样器吸取氨基酸样品4μl ，一次把样品点在滤纸的起始点（×）上，然后正确连接主机与电泳槽的正负极连线，盖上电泳槽盖子。

6、开启主机电源，调整电泳电压至300V，记录电泳初始电压。注意电泳过程电流的变化，如电泳电流接近仪器的最大额定工作电流时，可把电压略调低使电流不超过20mA。 7、30min后电泳结束，记录电泳终止电压，关闭电源，迅速把滤纸条从电泳槽中取出，用电吹风挥干其缓冲溶液。

8、用喷雾器对滤纸均匀喷洒茚三酮显色剂，立即用热风吹干，在滤纸上可显示清晰的氨基酸显色斑点。

标记电泳图谱氨基酸斑点位置，分析判断为何种氨基酸。

注：在纸电泳中，由于滤纸常含有一定量的羧基而带负电荷，使与纸相接触的水溶液带正电荷，使液体向负极移动。此时，粒子实际电泳的速度是粒子本身电泳速度与由于水溶液移动而产生电渗速度的迭加。因此，若粒子原来向负极移动，则表面速度将比电泳速度快；若原来向正极移动，则表面速度将比电泳速度慢，所以，中性物质有时在电场中也可能向负极移动。

六、实验结果讨论分析

要求绘出电泳谱图，分析各氨基酸向正负极移动的原理。

七、思考题

1、 实验中若电泳缓冲液的PH改变为2.9，电泳图谱各氨基酸斑点的位置将发生什么变 化？

2、 蛋白质A的PI=5.5，蛋白质B的PI=6.9，电泳介质PH=7.0，电泳时各蛋白向哪个

电极方向迁移？为什么？

3、记录电泳过程电参数的变化有何意义？

4、实验中哪些步骤须除去滤纸多余的缓冲液或须对滤纸进行热风干燥，其目的是什

么？

实验五 激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响

一、目的要求 通过实验加深对酶性质的认识，了解测定α-淀粉酶活力的方法。 二、实验原理

酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。酶催化的反应称为酶促反应。生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化

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活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。

能提高酶活力的物质，称为激活剂。激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。

酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。同样，反应中某一PH范围内酶活力可达最高，在最适PH的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。

食品级α-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生。但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。

本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪α-淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。

三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响 （一）试剂及材料

1、1：30唾液淀粉酶配置 用蒸馏水漱口，1min后收集唾液，以1：30倍蒸馏水稀释。 2、0.2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉0.2g，预加20mL蒸馏水调匀，然后倒入80mL沸水中，继续煮沸至溶液透明，冷却后补水至100mL。

3、1%NaCl溶液 称取1.0 g氯化钠，加水溶解稀释至100mL 。

4、1%CuSO4溶液 称取1.0 g硫酸铜，加水溶解稀释至100mL。

5、标准稀碘液 称取11g碘，22g碘化钾，置研钵中，加入适量的水研磨至碘完全溶解，并加水稀释定容至500mL。吸取2mL 上述碘液，加入10 g碘化钾，用水稀释至500 mL。 （二）仪器设备 电热恒温水浴锅。 （三）操作方法

取试管3根，编号后按下表配置实验样液。 试管序号 1 2 3

0.2%可溶性淀粉 2.0 mL 2.0 mL 2.0 mL 1%NaCl 1.0 mL / / 1%CuSO4 / 1.0 mL / 蒸馏水 / / 1.0 mL 混匀，放入37℃水浴中保温10min。立即加入唾液淀粉酶。 1：30唾液淀粉酶 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 12

用点滴管并不断从试管中吸取样液于比色白瓷板，用稀碘液检验试管内淀粉被淀粉酶水解的程度，记录各试管内样液遇碘不显蓝色的先后顺序，解释实验现象的原因。 四、温度与PH值对α-液化淀粉酶活力的影响 （一）试剂与材料

1、2%可溶性淀粉溶液 称取可溶性淀粉2.0g（预先在105℃烘干），预加20mL蒸馏水调匀，然后倾入80mL沸水中煮沸至溶液透明，冷却后定容至100mL。

2、PH4.0 、5.0、6.0、7.0、8.0 磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲溶液

（1）0.2 mol /mL Na2HPO4 称取35.60g Na2HPO4.2H2O，用水溶解定容至100mL。 （2）使用酸度计，用柠檬酸调整至所需的PH值。

3、供试酶液的制备 称取固体α-液化淀粉酶1.00g，加入PH6.0磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲溶液100mL (缓冲液的加入量视酶活力大小而定，控制酶解反应在5-10min内完成)，于40℃恒温水浴中活化0.5小时，然后用3000rpm / min离心机离心分离5min，酶提取液于冰箱保存，供试验用。

4、标准比色液 甲液：称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2439g、干燥重铬酸钾0.4748 g，溶解并定容至500mL。 乙液：称取铬黑T 40.00mg，溶解并定容至100mL。

使用时取甲液40.0mL、乙液5.0 mL，混合。混合比色液宜放置冰箱保存，使用7天后重新配置。

5、标准稀碘液。

（二）仪器设备 电热恒温水浴锅。

（三）操作方法

1、用滴管吸取一定量标准比色液于白色瓷比色板空穴中，作为判断酶解反应终点的标准色。

2、不同温度对α-液化淀粉酶活力的影响

取4根Φ25×200mm 试管，按下表配制反应溶液。 试管序号 1 2 3 2%可溶性淀粉 PH6.0缓冲液 20.0mL 5.0mL 20.0mL 5.0mL 20.0mL 5.0mL 4 20.0mL 5.0mL 把四根试管分别放入50℃、60℃、70℃、80℃恒温水浴中预热10min 分别加供试酶液 反应完成时间记录（min） 0.5mL 50℃ 0.5mL 60℃ 0.5mL 70℃ 0.5mL 80℃

加入供试酶液后，立即用秒表或手表记时，充分要匀，定时用点滴管从各反应试管中分别吸取1-2滴反应液，滴入预先盛有2/3 稀碘液的比色白瓷板孔穴内 ，从淀粉遇碘显色的变化情况，跟踪淀粉在淀粉酶作用下被水解的过程，当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与

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标准比色液的颜色相同时，即达反应终点，记录酶解反应完成所需时间。 3、不同PH值对α-液化淀粉酶活力的影响

取5根Φ25×200mm 试管，按下表配制反应溶液。 试管2%可溶性淀粉 序号 1 3 4 5 20mL 20mL 20mL 20mL 缓冲溶液 PH4.0 5.0 mL PH6.0 5.0 mL PH7.0 5.0 mL PH8.0 5.0 mL 恒温水供试酶液 反应完成时间记录（min） 0.5 mL 浴60℃0.5 mL 预热0.5 mL 10min。 0.5 mL 其它操作与温度对酶活力影响实验相同。 五、结果计算和讨论

淀粉酶活力单位定义为 在一定条件下，1 g酶制剂1小时内液化可溶性淀粉的克数。

酶活力单位(U/g)=

60t?20?0.02?10.5?n

式中：20——可溶性淀粉的用量（mL）； t——酶解反应完成所需的时间（min）；

0.5——测定时稀释酶液用量（mL）； 0.02——可溶性淀粉溶液的浓度（g/mL）； n——酶制剂稀释倍数

1、不同温度对α-液化淀粉酶活力影响的结果记录 实验结果 酶活力（U/g） 50℃ 60℃ 70℃ 80℃ 2、不同pH值对α-液化淀粉酶活力影响的结果记录 实验结果 酶活力（U/g） pH4.0 pH6.0 pH7.0 pH8.0

分别以PH值、温度为横坐标，以酶活力单位为纵坐标，绘制PH值—酶活力单位、温度—酶活力单位图。讨论分析实验结果。 六、思考题

1、从实验操作技能方面考虑，做好本实验的操作要点是什么？

2、实验过程中若激活剂或抑制剂的作用不明显，如何调整实验方案？

3、进行酶的生化实验必须考虑控制哪些条件？为什么？

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4、生化反应用酶前对酶进行活力进行测定，对实验有何实际指导意义？ 5、酶在干燥状态下与在水溶液中保存，它的活性受温度的影响是否相同？

实验六、果蔬中过氧化物酶活力测定

一、目的要求了解过氧化物酶的生物氧化作用，学习过氧化物酶的测定方法。 二、实验原理

过氧化物酶属氧化还原酶，能催化底物过氧化氢对某些物质的氧化。反应中的供氢体可为各种多元酚（对–甲酚、愈创木酚、间苯二酚）或芳香族胺（苯胺、联苯胺、邻苯二胺）以及NADH2 NADFH2。其作用机理可分为以下几步： 第一步 形成酶–底物复合物Ⅰ

过氧化物酶 + H2O2 → 酶?复合物Ⅰ 第二步 酶?复合物Ⅰ转变成褐色的酶?复合物Ⅱ 酶?复合物Ⅰ + AH → 酶?复合物Ⅱ + A 第三步 酶?复合物Ⅱ被还原，释放酶

酶?复合物Ⅱ + AH → 过氧化物酶 + A + H2O2

AH 表示还原形供氢体。

在一定条件下，酶?复合物Ⅱ可生成产物（P）同时释放出酶，亦可与过量的过氧化氢形成稳定的复合物Ⅲ：

酶?复合物Ⅱ + H2O2 → 酶?复合物Ⅲ

本实验以愈创木酚为供氢体，H2O2为氢的受体，愈创木酚在过氧化物酶催化作用下被氧

化后，生成褐色的有色产物，根据酶活力大小与有色产物颜色的深浅成正比，在波长下测定其吸光值，可求出过氧化物酶的活力。

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A610nm—波长610nm时测定样品的吸光值； 0.076—0.1%焦糖标准色在波长610nm的吸光值； 4、实验结果记录 样 品 Ⅲ 号 Ⅳ 号 A610nm EBC单位

（三）不同条件下焦糖的色率比较试验

1、吸取上述制备的Ⅰ、Ⅱ号焦糖色稀释液10mL，分别定容至100mL，配成1%焦糖液Ⅴ号、Ⅵ号。

2、 取6根试管，按下表编号加入试剂。 1%焦糖1%焦糖 Ⅴ 10mL 10mL 10 mL 10mL 10 mL 10 mL 10 mL Ⅵ 水 10 mL 10 mL 30%NaCl 10 mL 10 mL 12%醋酸 10 mL 10 mL 80%乙醇 10 mL A510nm 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 10 mL 10 mL 3、把上表配置好的溶液，以蒸馏水调零，在510nm波长条件下测定其吸光值，比较不同介质条件中焦糖色的增色效果。 三、实验结果讨论分析 四、思考题

1、何为酶促褐变和非酶促褐变？

2、比较非酶褐变过程中，焦糖化反应与美拉德反应形成色素所需的异同点。 3、 焦糖色作为食品添加剂可能用于哪方面食品中？

4、 举例说明食品加工过程哪些工艺或措施是为了防止非酶促褐变发生的？

实验九 酶促褐变的抑制及叶绿素的性质

一、果蔬加工过程酶促褐变的抑制

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（一） 目的要求 了解酶促褐变的原理，学习抑制酶促褐变的方法。

（二）实验原理

植物组织中常含有一元酚和邻二酚等酚类物质，如桃、苹果中含有绿原酸，马铃薯中含有酪氨酸，香蕉的含氮酚类衍生物3,4-二羟基苯乙胺，均为多酚氧化酶的底物。 这些酚类物质，在完整的细胞中作为呼吸作用中质子的传递物质，在酚—醌之间保持着动态平衡，因此，褐变不会发生。但在果蔬加工过程中，当组织细胞受损，氧气进入，酚类物质将在多酚氧化酶的催化作用下氧化成为红色醌类物质，即而快速地通过聚合作用形成红褐色素或黑色素，影响食品色泽及风味。因此氧化酶类、酚类物质以及氧气是发生酶促褐变的必要条件，缺一不可。

酶促褐变的程度主要取决于酚类物质的含量，而氧化酶类的活性强弱似乎没有明显的影响，但去处食品中的酚类物质不现实，比较有效的方法是抑制氧化酶类的活性，防止酚类底物的氧化。常见控制酶促褐变的方法主要有热烫处理法、酸处理法、驱氧法等。热烫处理法，是利用短时高温破坏酶的细胞结构，达到钝化酶乃至酶失活的目的；酸水解法，则是用降低pH值的方法使酶失活，是果蔬加工过程最常用的一种方法；驱氧法是用真空方法将糖水、盐水渗入果蔬组织内部，驱除空气；或使用高浓度的除氧剂如抗坏血酸溶液浸泡以达到除氧的目的。本实验采用酸处理护色方法，通过对比实验了解酶促褐变的抑制原理。

（三）试剂与材料

1、0.5%柠檬酸与0.3%抗坏血酸混合液：称取0.5g柠檬酸、0.3g抗坏血酸，加水溶解至100mL。

5、 苹果。

（四）仪器设备 紫外-可见光分光光度计。

（五）操作方法 1、样品处理

（1）称取去皮苹果20.0g，迅速切碎后在研钵中充分研磨10min，加水15mL，过滤至透明，备用。

（2）另称取去皮苹果20.0 g，切碎置于研钵中，迅速加入0.5%柠檬酸与0.3%抗坏血酸混合液15mL，研磨10min，过滤至透明备用。

注意观察记录两个对比实验过程中汁液颜色的变化。

1、 汁液褐变色率测定 用1cm比色皿以蒸馏水为空白，在470nm波长条件下测定苹果

汁液的吸光值，以吸光值的大小表示褐变程度，随着褐变程度的增大，吸光值增加。

汁液颜色 A470nm (六) 结果记录与讨论

二、叶绿素的性质

（一） 目的和要求 了解叶绿素的分子结构以及性质，学习纸层析法分离色素的方法。 （二）实验原理

无护色汁液 护色汁液 22

叶绿素是以4个吡咯环组成的卟啉共轭体系，其卟啉结构中的金属原子是镁原子，由于连接卟啉结构侧基的差异，分为叶绿素a和叶绿素b，为植物叶绿体色素的主要组成。利用叶绿素不溶于水，而溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂的特性，本实验用乙醇作为提取叶绿素的溶剂。

游离的叶绿素很不稳定，对光、热、酸都很敏感，很容易脱色、变色等。如在酸性条件下，叶绿素分子中的镁离子可为氢离子取代，生成脱镁叶绿素，颜色呈暗绿色甚至黄褐色；向脱镁叶绿素加入铜盐，在加热情况下，分子结构中的铜离子取代了氢原子的位置，生成铜叶绿素，色泽呈亮绿色。

叶绿素在碱性条件下加入铜盐，经加热可生成叶绿素铜钠盐，色泽鲜亮且对光热均较稳定，在食品工业中可用作食品添加剂。主要反应为：

叶绿素光照裂解无色产物

2C55H72O5N4MgHC55H74O5N4 叶绿素脱镁OHMg

叶绿素

叶绿酸钠甲醇C55H72O5N4Mg叶绿素叶绿素醇

Cu2叶绿酸钠叶绿素铜钠鲜亮绿色Mg 2 分离色素的方法有很多种，其中纸层析是最简便的一种，当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合物中各种成分在流动相和固定相间具有不同的分配系数，所以它们在层析过程中的移动速度不同，从而使样品中的混合物得以分离。 （三）试剂及材料

1、0.1mol/L HCl 6、醋酸铜

2、乙醇 7、四氯化碳

3、碳酸钙 8、新鲜绿色植物叶片 4、1% NaOH 9、牛皮纸 5、石英砂

（四）仪器设备 紫外可见光分光光度计（软件控制系统）。 （五）操作方法

1、色素的提取 称取新鲜叶片7g，去除叶脉，切碎后放 入研钵，加入0.1g CaCO3,石英砂2g，10mL乙醇，研磨成匀浆，

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再加乙醇25mL，混匀，过滤，即为叶绿素提取液。

2、叶绿素的性质

（1）光对叶绿素的破坏作用 取叶绿素提取液数毫升，分别置于2根试管中，其中一根试管放在黑暗处（或用牛皮纸包裹），另一试管放在强太阳光下，经3—4小时后，观察两试管中色素颜色的变化。记录并说明原因。

（2）脱镁叶绿素实验 取叶绿素提取液5mL ，边摇动边滴加0.01 mol/L HCl，直至溶液出现褐绿色。向溶液中加入醋酸铜结晶1小块在沸水浴中加热2-3min，观察溶液颜色的变化。

（3）叶绿素铜钠盐制备 取叶绿素提取液5mL，加入1% NaOH 0.5mL，将试管置于80℃水浴中加热2-3min，然后加入醋酸铜结晶1小块在沸水浴中加热2-3min，观察溶液颜色的变化。并同时与脱镁叶绿素、叶绿素提取液色泽比较。 3、色素的分离

（1）取层析滤纸，裁剪规格长×宽为1.8 ×2.0cm，将其一末端剪去两侧，中间留一长约1.5 cm ×0.5 cm 窄条。

（2）用毛细管吸取10μl叶绿素提取液，分少量多次全部点于离窄条上方0.5cm位置，注意点样品的直径应控制在3-5mm，必要时可借助电吹风边吹风边点样。但不能造成局部过热，以免影响层析展开效果。

（3）在层析试管中加入四氯化碳5mL，及少量无水硫酸钠，然后将滤纸条固定于胶塞挂钩，放入试管内，要求滤纸窄条下端伸入四氯化碳展开剂中（但不能浸末色素样品点，滤纸条边缘不要接触试管壁），盖紧胶塞，试管直立于暗处进行层析。 （4）层析约0.5h后，取出滤纸条观察色素带分布情况。

4、不同叶绿素溶液紫外-可见光光谱扫描：分别用乙醇溶液稀释叶绿素溶液至一定浓度，用1mL石英比色皿，以乙醇作为参照液，对叶绿素提取液、脱镁叶绿素、叶绿素铜钠盐溶液进行紫外-可见光光谱扫描，了解其光谱特性。 紫外-可见光光谱扫描仪操作要点：

（1）对待测样品用乙醇进行稀释至一定浓度。

（2）开启仪器电源开光，进入UVin5.0软件，等待仪器自检完成。

（3）关闭检测光源，仪器预热30min。

（4）预热完毕，重新打开检测光源，3min后仪器进入工作状态。把参比对照液乙醇加入石英比色皿，并放置进1号比色槽；将需检测的样品加入另一石英比色皿并放进2号比色槽（注意要垂直小心放置比色皿，不要造成比色架移动，否则必须重新初始化校正仪器）。

（5）用鼠标选择波长扫描功能，点击工具栏 P 窗口，选择 仪器 按钮进入，进行光谱扫描波长参数的设置。

（6）把1号比色皿推进光路，点击工具栏 基线 按钮，对参比液乙醇进行基线扫描。然后把2号比色皿（样品液）推进光路，点击工具栏 开始 按钮，对样品进行特定波长范围内的光谱扫描。

（7）扫描完毕把检测样品保存在个人文件夹中。

（8）数据处理：把检测后的图谱数据以“Microsoft Excel”方式导出，做检测样品光谱图，

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比较三种叶绿素溶液吸收光谱特性。

（六）实验结果讨论分析。 （七）思考题

1、比较分析相关实验内容，保持叶绿素色素相对稳定的条件有哪些？ 2、叶绿素提取时，加入少量碳酸钙的作用是什么？ 3、了解叶绿素提取液光谱扫描的意义？

第二部分 综合设计性实验 酵母蔗糖酶的分离纯化

实验一 活性干酵母蔗糖酶的提取

一、目的要求 了解蔗糖酶的性质以及提取生物大分子常用的方法，确定从干酵母中取蔗糖酶的实验方法。通过蔗糖酶活力的测定，比较各提取方法的优缺点，提出实验方案的改进措施。

二、实验原理

生物大分子的提取过程是把生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）从生物材料的组织或细胞中，以溶解的状态释放出来的过程，以便再进一步分离与纯化。适合的提取方法的确立，与该生物大分子在生物体中存在的部位和状态有关。如一些细胞的胞外酶代谢过程中已分泌到细胞或组织的外部，它们的提取比较方便；对于胞内酶其活性物质是分布在细胞内部或是细胞的结构物中，提取这类物质，首先必须破碎细胞壁，将生物大分子有效提出并制备成无细胞的提取液后再分级分离。

生化实验中常用的细胞破碎法有：

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1、菌体自溶法：将欲破碎的细胞，置于一定温度、pH条件下，通过细胞自身存在的酶系作用，将细胞破坏，使胞内物质释放出来。

2、机械破碎法：包括机械捣碎，研磨，高压泵挤压法。研磨是最简单的破壁方法，直接或用少量石英沙或氧化铝与浓稠的菌泥相混后，置于研钵中研磨即可破碎细胞；挤压法是使微生物细胞在高压泵中，在几百公斤的压力作用下，通过一个狭窄的孔道高速冲出，由于突然减压而引起一种孔穴效应，致使细胞破碎。

3、超声波破碎法：超声波具有频率高，波长短，定向传播等特点。它在液体中传播时，能使液体中某一点一瞬间受到巨大的压力，而另一瞬间压力有迅速消失，由此产生了巨大的拉力，使液体拉伸而破裂并出现细小的空穴，这种空穴在超声波的继续作用下，产生可达几万个大气压的局部附加压强。介质中悬浮的细胞在这样大的压力作用下，产生一种应力，促使内部液体流动而使细胞破碎。

超声波破壁的效果与样品的浓度，仪器的频率，输出功率，超声波处理的时间，液体介质的性质，温度等因素有关。

蔗糖酶，属水解酶。蔗糖在蔗糖酶的作用下，水解为D–葡萄糖和D– 果糖。蔗糖酶分布广泛，在酵母，如产朊假丝酵母、啤酒酵母、面包酵母中的含量较高。酵母蔗糖酶是胞内酶，提取前必须进行预处理使菌体细胞破壁。

三、试剂和仪器

（一）试剂

1、pH5.5 0.2mol/L醋酸—醋酸钠缓冲溶液。 2、石英沙。

3、活性干酵母。

4、Folin–酚法或考马斯亮蓝法测定蛋白质试剂。 5、3, 5–二硝基水杨酸定糖试剂。 （二）仪器

1、超声波细胞破碎仪。

2、冷冻离心机。 3、721分光光度计。 4、电热恒温水浴锅。 5、秒表或手表。

四、操作方法

（一）细胞破碎：

1、研磨破壁：称取一定量的干酵母（记录），加入一定的石英沙，分次加入适量的水或缓冲液研磨至一定时间使之破壁。也可加入少量的甲苯溶剂一起研磨，以溶解细胞膜的脂质化合物，有助于加速细胞结构的破坏。

2、超声波破壁：称取一定量的干酵母，加入经预冷的蒸馏水或适宜的pH缓冲液，充分混匀。选择适宜的输出功率，破壁时间，进行超声波破壁处理。

3、自溶法破壁：设计酵母菌自溶的参数：自溶温度，pH，缓冲液的浓度，时间等。在恒温装置中完成实验。

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（二）离心分离：在冷冻条件下，选择合适的离心分离速度，去除母液中的菌体细胞，吸取中层清夜备用。

（三）测定酶提取液的酶活力、蛋白质含量。

五、计算结果及讨论

1、记录提取酶的方法、条件及粗酶提取液体积。测定酶液中蔗糖酶活力及蛋白质含量。 2、测定结果记录

干酵母实验序号 重量(g) 粗酶液提取体积(mL) 蔗糖酶活力（U/mL） 蛋白质含量（mg/mL） 总活力 酶比活力 （U/mg蛋白质） 3、根据设计的酶提取实验分析结果，总结评价所设计实验的效果及提出改进方案。

六、思考题

酶是一种有活性的大分子物质，在外界作用下容易发生变性，导致酶活力下降甚至失 活。故蔗糖酶提取实验中应注意那些问题？

实验二 蔗糖酶的分级沉淀提取

一、目的要求 了解酶分级沉淀提取分离的实验原理，确定分级沉淀纯化蔗糖酶的实验方

案，使用盐析法或有机溶剂法分级沉淀初步分级纯化蔗糖酶。通过酶比活力、提纯倍数、提取率的测定，评定分级沉淀纯化蔗糖酶的效果。

二、实验原理

经研磨或超声波等方法提取得到的酶液，仍含有其他杂蛋白、多糖等物质，与目的酶相比，不纯物含量较高，须进一步的分离纯化，才能获得纯度较高的酶制品。分级沉淀提取步骤，是酶的一个初步纯化过程，常用的分级沉淀提取方法有：

1、盐析法：是酶提纯的最早方法，目前仍在广泛使用，它适用于许多非电解质物质的分离纯化。常用于盐析的盐类有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、硫酸镁等，其中硫酸铵因其具有以下几个优点：（1）有利于盐溶液浓度提高；（2）浓度系数小，即不同温度下溶解度变化小，当温度降低时，不至于产生过饱和析出；（3）分离效果好，不影响酶活力；（4）价格便宜来源容易，而成为最常用的盐类。

盐析法的原理是，大部分蛋白质在低盐溶液中比在纯水中易溶—盐溶现象。但是，当盐浓度升高到一定浓度时，蛋白质的溶解度反而减少，称之为“盐析”。其原因是加入的盐在

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水中解离时，会夺走蛋白质颗粒表面的水分子，破坏水膜结构；同时，盐类解离后形成的带电离子如NH?4、SO4?，能中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质沉淀。不同的酶或蛋白质在同

一盐溶液中的溶解度不同，利用这一特性，先后添加不同浓度的盐，则可把其中不同的酶或杂蛋白分别盐析出来。

2、有机溶剂沉淀法：也是一种分级沉淀纯化酶的方法。作用机理是破坏蛋白质的氢键，使其空间结果发生某种程度的变形，致使一些原来包在蛋白质内部的蔬水基团暴露于表面，并与有机溶剂的蔬水基团结合，形成蔬水层，从而使蛋白质沉淀。另一方面，有机溶剂的加入，使蛋白质溶液的介电常数降低，增加了蛋白质分子电荷间的引力，导致蛋白质的溶解度下降。由于不同种类的蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同，故可用于酶或蛋白质的分级提纯。乙醇和丙酮是常用的有机沉淀剂。

三、试剂和仪器

（一）试剂

1、测定蔗糖酶活力试剂。 2、测定蛋白质含量试剂。 3、无水乙醇。 4、固体硫酸铵。 （二）仪器

同实验一。

四、操作方法

（一）乙醇分级沉淀提取蔗糖酶

乙醇分级沉淀蔗糖酶,其最适浓度可通过实验来决定,常采用逐步提高乙醇浓度来实现。为防止酶变性，有机溶剂浓度一般控制在60%左右。实验过程中乙醇的用量可按下式计算：

V?V0(S2?S1)(S?S2)

式中V为应加入乙醇的体积；V0为酶液的初始体积；S为乙醇试剂的浓度（%）；S1、S2分别为酶液初始的乙醇浓度（%）及酶液需要达到的乙醇浓度（%）。

取一定体积由实验一提取的粗酶液，边搅拌边缓慢加入所需的冷乙醇试剂，待酶液产生沉淀时，冷冻离心分离，记录上清液体积。

根据沉淀物溶解液中酶活参数测定结果，进一步对所分离得到的上清夜补加乙醇，反复操作，直至确定较佳的乙醇沉淀提取条件。记录各步需调整乙醇浓度时所添加的乙醇量。 （二）硫酸铵分级沉淀提取蔗糖酶

取一定体积待分离的粗酶液，在0℃或25℃的温度下，边搅拌边加入固体硫酸铵至一定的浓度，冷冻离心分离沉淀物，记录上清液体积。根据沉淀物溶解液中酶活参数测定结果，调整试验方案，向所分离的上清夜补加硫酸铵至一定浓度，直至获得较理想的酶分级分离提取效果。记录调整盐析浓度时，所添加的硫酸铵的数量。

分段盐析固体硫酸铵的添加量可查附表1。

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五、结果计算及讨论

（一）乙醇分级沉淀提取蔗糖酶结果记录

记录 序号 供试原粗酶液 乙醇一次沉淀 乙醇二次沉淀 乙醇三次沉淀 * —— 用乙醇分级沉淀提取蔗糖酶时，酶液体积指的是离心分离所得沉淀提取物溶解后的总体积。

乙醇浓度（%） 0 酶液体积 (mL) *蛋白质含量（mg） 酶活力(U/mL) 总活力 比活力(U/mg蛋白质) 提纯倍数 提取率（%）

（二）硫酸铵分级沉淀提取蔗糖酶结果记录

记录 序号 供试原粗酶液 一次沉淀试验 二次沉淀试验 三次沉淀试验 注：1、比活力指样品中单位蛋白质（mg蛋白质或mg蛋白氮）所含的酶活力单位。

2、提纯倍数指提纯后酶液的比活力与粗酶液的比活力之比值。 3、提取率指提纯后酶液的总活力与粗酶液酶的总活力之比。

硫酸铵浓度（%） 0 酶液体积* (mL) 蛋白质含量（mg） 酶活力(U/mL) 总活力 比活力(U/mg蛋白质) 提纯倍数 提取率（%） 29

4、总活力=酶活力（U/mL）×酶液总体积

5、用硫酸铵分级沉淀提取蔗糖酶时，酶液体积指的是离心分离所得沉淀提取物溶解后的总体积。

根据实验结果，选出较好的分级沉淀蔗糖酶的实验方案，或提出进一步改进分级沉淀提取蔗糖酶的实验方案。比较各分级沉淀提取方法的优缺点及注意事项。

留取少量的粗酶液，分级沉淀提取的酶制制作电泳分析。

六、问题讨论

1、酶提取过程中，添加有机试剂时搅拌的速度要适当，添加速度也不宜过快，以免局部溶剂浓度过高而引起酶失活。

2、硫酸铵分级沉淀时，盐的饱和度可由低向高逐渐增高，每出现一种沉淀应进行分离。加盐时要分次加入，待盐溶解后继续添加，加完后缓慢搅10-30min，使溶液浓度完全平衡，有利于酶的沉淀。

3、比活力是酶的纯度指标，比活力愈高，表示酶愈纯，即单位蛋白质中酶催化反应的能力愈大。但这仍是一个相对指标，并不说明酶的实际纯度，要了解酶的纯度，可通过电泳方法确定。

4、提取率表示提纯过程中酶损失程度的大小，提取率越高，损失越少。

5、提纯倍数量度提纯过程中纯度提高的程度，提纯倍数大，表示该法纯化效果较好。 6、理想的纯化方法是既要有相当的提纯倍数，又有较高的提取率；或者说既能最大限度地除去杂蛋白，又能尽量保护酶蛋白不受损失。但实际上是不容易做到，往往是提纯倍数较高，提取率则偏低，反之收得率较高的方法其提纯倍数低。因此，选择提纯方法，必须根据实际需要而定。一般来说工业用酶纯度要求较低，但用量大，成本，价格具有重要意义，故可选择提取率较高的方法；而试剂级、医用酶需要量少，但纯度要求高，应选用提纯倍数高的方法为宜。

七、思考题

1、高浓度的硫酸铵对蛋白质的溶解度有何影响？为什么？ 2、浓度较高的乙醇、丙酮对大部分蛋白质产生什么影响？

3、盐析时选用合适的pH值和酶浓度，对酶的分离有什么影响？

4、盐析沉淀得到的酶制品可直接用在食品工业上吗？需做那些处理？ 5、设计酶分级沉淀试验时，应注意那些问题？

实验三 蔗糖酶的葡聚糖凝胶层析法脱盐

一、目的要求 了解蔗糖酶在葡聚糖凝胶柱上的脱盐原理；学习其基本的操作技术。 二、实验原理

分子筛指的是一些多孔介质。当含有大小不同的分子的混合物流经这一介质时，小分

子能进入介质的孔隙，而大分子则被阻在介质之外，从而达到分离的目的，这种作用被称为分子筛效应。具有这种效应的物质很多，其中效果较好的有葡聚糖凝胶（Sephadex），琼脂

30

除将甘油充分洗涤外，还应将所含有微量的硫化物及痕量的重金属除去。处理方法可用10mmol/L NaHCO3浸洗，也可用煮沸方法或用50%乙醇80℃浸泡2-3小时；10mmol/L EDTA可除去重金属，用EDTA处理过的透析袋要用去离子水或超纯水保存。

新的干燥透析袋应保存在密封聚乙烯袋中，需防潮防霉或避免被微生物蚀孔。最好能 保存在10℃的冷柜中。

用过的透析袋应将其充分洗净，或用含有NaCl的溶液清洗，以除去袋中粘附的蛋白 质，再用蒸馏水洗净，存于50%甘油或50%乙醇中。注意，已使用过的透析袋，因原来加入的保湿剂已被除去，故不允许使其再次干燥，否则极易脆裂破损，无法使用。 七、思考题

1、 离子交换柱层析能分离纯化蔗糖酶的主要依据是什么？

2、 影响离子交换作用的主要因素是什么？ 3、 梯度洗脱的分离效果与什么因素有关？

36

蔗糖酶 样品 干酵母 抽提液 上样酶液 干酵母蔗糖酶纯化表

蛋白质含量 （mg/mL） 比活力 (u/mg) 总活力 (U) 提纯倍数 回收率 (%) 体积 (mL) 洗脱液 pH值 洗脱液盐 洗脱液体积 洗脱液流速 酶活力 浓度变化 （mL/min） （U/mL） (mL) 离子交换纯 化收集酶液 凝胶纯化 收集酶液 注：比活力为样品中单位质量蛋白质所具有的酶活力单位数，一般表示为U/mg蛋白质。

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实验五 蔗糖酶的交联葡聚糖凝胶色谱分离纯化

一、目的要求 学习凝胶色谱法分离纯化物质的实验原理以及掌握其分离技术。 二、实验原理

凝胶色谱又称分子筛色谱，是六十年代发展起来的一种快速而简便的生物化学分离分 析方法，其基本原理是用柱层析方法把分子量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使物质得以分离。用作凝胶的材料有多种，如交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。

交联葡聚糖是以右旋葡聚糖为残基的多糖用交联剂环氧氯丙烷交联形成的有三维空间的网状结构物。控制葡聚糖和交联剂的配比及反应条件就可决定其交联度的大小（交联度大，“网眼”就小），从而得到各种规格的交联葡聚糖，即不同型号的凝胶。交联葡聚糖的商品名为Sephadex ，商品中“G””表示交联度，G越小，交联度越大，吸水量也就越小。 样品分离时，首先把经过充分溶胀的凝胶装入层析柱中，然后把样品加进凝胶柱，由于交联葡聚糖的三维空间网状的结构特性，分子量大的物质只是沿着凝胶颗粒间的孔隙随溶剂荡动，其流程短，移动速度快，先流出层析床。分子量小的物质由于不断进出微孔凝胶颗粒，流程长，移动速度慢，比分子量大的物质迟流出层析床，从而使样品中各组分按相对分子量大小得以分离。当两种以上不同分子量的分子均能进入凝胶颗粒内部时，则由于它们被排阻和扩散程度不同，在色谱柱内所经过的时间和路程不同，从而也得到分离。凝胶色谱分离原理示意图如图所示。

1

三、试剂与仪器

（一）试剂：

1、0.05mol / L醋酸-醋酸钠缓冲溶液：称取无水醋酸钠4.1g，加水溶解至950mL，借助酸度计用醋酸调pH=5.5，补水至1000mL 。 2、Sephadex G150。 3、聚乙二醇6000。

4、测定蔗糖酶活力试剂。 5、测定蛋白质含量试剂。 （二）仪器

1、凝胶色谱分离装置。

2、其他仪器与离子交换柱层析相同。 四、操作方法

1、 柱的装填：在玻璃柱先装入一定体积的水或分离缓冲溶液，在搅拌下缓缓加入已充分溶 胀的葡聚糖凝胶悬浮液，让其自然沉降，将多余的溶剂放出，适当补充凝胶液使凝胶体积达到所需的高度。

2、 柱的平衡：在凝胶床的表面加盖一小滤纸片，选1~2 mL / min的流速，用2~3倍凝胶床 体积的0.05mol / L 醋酸-醋酸钠缓冲溶液平衡凝胶柱。注意观察凝胶床的情况，不能有气泡或裂纹存在。 3、 上样和洗脱：色谱柱平衡后，吸去上层液体，打开出口，待平衡液流至床表面以下1~2mm 时，关闭出口，用吸管沿柱壁慢慢加入一定体积的蔗糖酶液（上样体积一般不超过为凝胶床总体积的10%），打开出口，调整流速使样品慢慢渗入凝胶床内，样品完全进入凝胶后，向凝胶顶部补加洗脱液至合适的高度，旋紧凝胶柱上盖，开启恒流泵，以一定的流速开始洗脱，每3 mL~ 5mL 收集一管。

2

4、 样品收集液的检测：在280nm波长下，测定分管收集液的A280nm值。以A280nm为纵坐标， 洗脱管数为横坐标，作洗脱曲线。

5、蛋白质溶液的收集及浓缩：根据A280nm的峰值大小，分别合并各组份的洗脱高峰管中的溶液，然后装入已处理的透析袋中，扎紧袋口。并于透析袋外铺撒PEG-6000粉末，在4℃中浓缩。按情况更换干燥的PEG-6000粉末，直至样品浓缩到所需的体积。

五、酶液纯化前后活力参数测定及结果分析 按干酵母蔗糖酶纯化记录表要求，对相应参数进行测定并记录。根据实验结果评价凝胶色谱纯化蔗糖酶效果，提出改进实验的意见和方法。

纯化后的酶液留作电泳分析。 六、问题讨论说明

1、色谱分离效果和填装起来的色谱床是否均匀有很大关系，因此使用前必需检查装柱的质量，最简单的方法是用肉眼观察色谱床是否均匀，有没有裂缝和气泡。也可用大分子有色物质蓝色葡聚糖-2000的溶液过柱，观察色带的移动情况，如色带狭窄，均匀平整，说明柱性能良好，色带出现歪曲，散乱变宽，则必须重新装柱。

2、Sephadex对碱和弱酸稳定（在0.1mol / L盐酸中可以浸泡1~2小时），在中性时可高压 灭菌。交联葡聚糖工作时的pH值稳定性在2~11的范围。

3、 葡聚糖G后面的数字代表不同的交联度，数值愈大交联度愈小，吸水量愈大。通常 Sephadex G-10 ~ G-50用于分离肽或脱盐，G-75 ~ G-200可用于分离分子量大于1000的蛋 白质。

5、样品的分离效果与色谱柱选用的大小也有一定的关系，通常对于高分辨率的柱则采用高的比率，即长度 / 直径（L / D）的比值较大。增加柱长虽然可提高分辨率，但同时也影响了流速和增加了样品的稀释度，所以在实际操作中应通过系统实验来确定色谱柱的大小和规格。

6、G系列交联葡聚糖凝胶亲水性强，只能在水中溶胀（仅有及少数的有机溶剂也可使之溶 胀），有机溶剂或含有机溶剂较多的水溶液会改变其孔隙，使之收缩失去或降低凝胶的分离能力。Sephadex G型葡聚糖凝胶在室温溶胀和在100℃溶胀所需时间如下表所示。

Sephadex G型葡聚糖凝胶溶胀所需时间（h） 凝胶型号 G-10 ~ G-200 Sephadex G-10 G-15 G-25 G-50 G-75 G-100 G-150 G-200 所需最小溶胀时间? 20 ~22℃（室温） 100℃（沸水浴） 3 3 3 3 24 72 72 72 1 1 1 1 3 5 5 5

3

以免破坏了它的颗粒尤其不能使用在电整磁个搅溶，拌胀过程中应避免剧烈溶地胀，搅时拌要将凝胶浸泡在过量的水或缓冲溶液。中

结，构

?

、7

产生许多碎末而影响洗脱时的。速度

洗脱缓冲系统中的任何在成一分般发生作。用柱子的顶端会出现一情些况杂下使但用凝过胶的柱柱经子过多只次要使经用，过后简单地重新平衡即可继续使。用

分离如效发差果现其流速减可，慢将然柱后顶重被新污平染衡的即部可使。分用适当地除去并加些凝胶，补充

凝胶的可再将生凝最 胶0.5好在不在柱上进，行则可需要对凝胶进行再生。处理

可恢复使用。

凝胶过滤介质的清：洗

，质

，时 mol / L氯化纳及0.5mol

/ L氢氧化钠的混合液中浸泡30min 以上，然后用蒸馏水洗至中性，最后用缓冲溶液平衡即

8、凝胶柱的保存：交联葡聚糖是多糖类物质，极易染菌，由微生物分泌的酶能水解多糖苷

键将改变色谱特性。抑制微生物的生长常用的方法是在凝胶中加入0.02%的叠氮化钠溶液。 9、部分Sephadex G型葡聚糖凝胶应用参数特性：

Sephadex G型葡聚糖凝胶应用参数参考表

粒度 范围(湿球) μm 得水值 (mL/g) 干胶 床体积 (mL/g)干胶 Sephadex 型号 有效分离范围 多 糖 球型蛋白 pH 稳定性(工作) 2~13 2~13 2~13 2 ~10 最大 流速? (mL/min) D D D D G-10 G-15 G-25粗 G-50粗 55~166 60~181 172~156 200~606 1.0?0.1 11.5?0.2 2.5?0.2 5.0?0.3 7.5?0.5 10.0?1.0 15.0?1.5 20.0?2.0 2~3 2.5~3.5 4 ~ 6 9 ~ 11 < 7?102 < 1.5?103 1?102 < 7?102 < 1.5?103 1?102 ~ 5?103 5?102 ~ 1?10 4 1?103 ~ 5?103 1.5?103 ~ 3?10 4 3?103 ~ 8?104 4?103 G-75 G-100 G-150 G-200 92~277 103~31 116~34 129~388 12 ~ 15 15 ~ 20 20 ~ 30 30 ~ 40 ~ 5?104 1?103 2 ~ 10 2 ~10 2 ~ 10 2 ~ 10 6.4 4.2 1.9 1.0 ~ 1?105 1?103 ~ 1.5?10 1?103 5~ 1.5?105 5?103 ~ 3?10 5?103 5~ 2?105 ~ 6?105 ?本表数据取自 Pharmacia Biotech Biodirectory 1996。流速值为2.6?30cm层析柱在25℃用蒸馏水测定之

4

值。D=Darcy’s law。

七、思考题

1、凝胶过滤色谱法分离纯化蛋白质的原理及适用范围。 2、样品分离要达到较好的结果与什么因素有关？

实验六 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离测定蔗糖酶纯度

一、目的要求 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直平

板电泳分离测定蔗糖酶纯度的操作方法。

二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N?–甲叉双丙烯酰胺（Methylence-bisacry-lamide，简称Bis）在催化剂和加速剂的作用下聚合交联形成的具有分子筛效应的三维网状结构凝胶。凡以此凝胶为支持物的电泳均称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）。凝胶筛孔大小、机械强度和透明度等物理参数，主要取决于凝胶浓度（T%）及交联度（C%），随着这两个参数的改变，可获得对待测分子进行分离、分辨的最适孔径。

T%=[(丙烯酰胺g + 甲叉双丙烯酰胺g)/总体积]×100

C%=[甲叉双丙烯酰胺g/(丙烯酰胺g + 甲叉双丙烯酰胺g)]×100

丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类。在连续系统中缓冲溶液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场的作用下主要靠电荷及分子筛效应得以分离；而在不连续系统中，不仅具有前两种效应，还具有浓缩效应，使电泳具有良好的清晰度和分辨率。

电泳时样品的浓缩效应主要由以下原因产生：（1）凝胶孔径的不连续。在不连续的PAGE中，电泳凝胶由上下两层不同pH、不同孔径的浓缩胶和分离胶组成，在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔的浓缩胶中泳动的速度快，当进入小孔分离胶时，其泳动过程受阻，因而在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的这种不连续性造成样品位移受阻而压缩成很窄的区带。（2）缓冲体系离子成分及pH值的不连续性。在Tris-甘氨酸缓冲体系中，各胶层中均含有HCl，HCl在任何pH溶液体系中均容易离解出Cl-，它在电场中迁移率最大；甘氨酸等电点为6.0，在pH6.8的浓缩胶中，离解度很低，仅有0.1%~1%的NH2CH2COO-，因而在电场中的迁移速度很慢；大部分蛋白质pI在5.0左右，在此电泳环境中都以负离子形式存在。通电后，这三种负离子在浓缩胶中都向正极移动而且它们的泳动率按mdach > mpap > mqaq排序（有效迁移率等于迁移率m与离解度a的乘积）。于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被压缩成极窄的区带。（3）是由电位梯度的不连续性所至。电泳开始后，由于Cl_的迁移率最大，很快超过蛋白质，因此在快离子后面，形成一个离子浓度低的电导区，由此产生一个高的电位梯度，使蛋白质和慢甘氨酸离子在快离子后面加速移动，当快离子和慢离子的移动速度相等

-

5

的稳定状态建立后，由于蛋白质的有效迁移率正好介于快、慢离子之间而被浓缩形成一狭小的区带。

当样品进入分离胶后，凝胶pH变为8.8，此时甘氨酸解离度大大增加，其有效迁移率也因此加大，并超过所有蛋白质分子。这样，快慢离子的界面（由溴酚蓝指示剂标记）总是跑在被分离的蛋白质样品之前，不再存在不连续的高电势梯度区域。于是，蛋白质样品在一个均一的电势梯度和均一的pH条件下，通过凝胶的分子筛作用，根据各种蛋白质所带的净电荷不同，具有不同迁移率而达到分离目的。

垂直平板电泳凝胶是在两块垂直放置、间隔几个毫米的平行玻璃中进行的，所得的是垂直平板状的凝胶。垂直平板电泳有以下优点：一系列样品能在同一块凝胶板上进行，显色条件也相同；平板表面大，有利于凝胶冷却；易于进行光密度扫描测定。

采用连续或不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，选用合适的凝胶浓度，对各纯化步骤所收集的具有高活力蔗糖酶溶液样品进行电泳分析，可判断蔗糖酶的纯化效果。

三、试剂和仪器

（一）试剂

1． 30%单位胶储备液（Acr:Bis=29:1）

称58g丙烯酰胺（Acr）溶于180mL双蒸水，再加入2g甲叉双丙烯酰胺（Bis），溶解后定容至200mL，过滤备用。

2． 分离胶缓冲液（pH8.8，3mol/L Tris-HCl） 称取36.33g Tris溶于80mL双蒸水中，在pH计上用HCl调pH至8.8，然后定容至100mL。

3． 浓缩胶缓冲液（pH6.8，1mol/L Tris-HCl） 称12.11g Tris溶于80mL双蒸水中，在pH计上用HCl调pH至6.8，加水定容至100mL。

4． 10%过硫酸铵（AP，聚合用催化剂）

称5g AP溶解于50mL双蒸水中，最好临用之前新鲜配制。也可置于4℃冰箱中避光保存，7天后重配。

5． 10% N，N，N?，N?–四甲基乙二胺（TEMED）（聚合用加速剂） 移取0.1mL TEMED稀释至1.0mL。置于4℃保存。

6． Tris–Gly电极缓冲液

称取7.5g Tris和36g甘氨酸溶于双蒸水中，定容至500mL，使用时稀释5倍。

7． 50mmol/L Tris–HCl（pH6.8）缓冲液 称取0.606g Tris溶于80mL双蒸水，在pH计上用HCl调pH至6.8，然后加水至100mL。

8． 加样缓冲液 分别取50mmol/L Tris–HCl缓冲液4mL，溴酚蓝2mg，甘油5mL，用双蒸水溶解后定容至50mL。

9． 固定液

取50%甲醇454mL、冰醋酸46mL混匀。

10. 染色液

称取0.5g考马斯亮蓝R–250溶于甲醇和冰醋酸混合液（80mL/20mL）中，过滤备用。

6

11. 脱色液

取150mL甲醇与50mL冰醋酸混溶，加双蒸水至500mL。

12. 2%~3%琼脂溶液。

13. 低分子量或高分子量的标准蛋白质试剂。

（二）仪器

1．直流稳压稳流电泳仪，输出电流100mA，输出电压500V。

2．夹芯式垂直电泳槽，DDY Ⅲ 2A型。

四、操作方法

（一）电泳槽安装

夹芯式垂直电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两电极槽中间夹有一个由凹形硅胶框，长短玻璃板及样品槽模板组成（如图所示）。电泳槽分上贮槽（白金电极面对短玻璃板）、下贮槽（白金电极面对长玻璃板），回纹状玻璃管用于冷凝。两电泳槽与凝胶模间靠贮液槽螺钉固定。

夹心垂直电泳槽示意图 凝胶模示意图

1、导线接头；2、下电极缓冲液槽； 1、样品槽定位模扳；2、长玻璃板； 3、凹型橡胶板；4、样品槽模板； 3、短玻璃板；4、凹型橡胶框。 5、固定螺丝；6、上电极缓冲液槽； 7、冷凝系统。

图2 垂直板电泳槽结构示意图

1．组装前各部件应做彻底清洗，尤其是长短玻璃及凹形带槽橡胶框，须用少许洗衣 粉彻底清洗，晾干后才能使用。

2．把长短玻璃分别插入相应的凹形橡胶框，注意手指不要接触胶面的玻璃板。

7

3．用点滴管或进样枪，把已经融化的琼脂密封长、短玻璃板的间隙，琼脂以渗入长、 短两玻璃键间隙的高度1.0cm为宜，可略抬起胶框的一端在琼脂末凝固之前排去琼脂胶层的气泡。而后垂直放置胶框，让琼脂完全凝固。

4．把带正极的电泳槽有机玻璃板仰放于台面，将已经用琼脂密封好的玻璃板凝胶 模，以长玻璃板面对正极的方式，平放于玻璃板上方，然后把带有负极的另一侧电泳槽有机玻璃板按螺丝销钉装好，并以对角线的方式逐渐旋紧螺丝帽，松紧程度以电泳槽不渗漏电极缓冲液而样品槽梳子又能够方便插入为宜。

（二）灌胶

1．配制8%凝胶浓度的分离胶和4%凝胶浓度的浓缩胶。

试剂名称 分离胶缓冲液 浓缩胶缓冲液 单体胶贮备液 双蒸水 10% AP TEMED* 总体积

8%分离胶（mL）

3.15 / 6.7 14.57 0.2 0.04 25.0

4%浓缩胶（mL）

/ 2.5 2.7 14.4 0.2 0.04 20.0

*TEMED试剂应在临灌胶时最后加入，以免胶液凝固影响灌胶。

2．灌胶

（1）分离胶制备：将配制好的分离胶，连续缓慢地沿长玻璃板板壁注入凝胶模，直 至胶液的高度达到低玻璃板板面2/3左右，用注射器小心流加入2 cm左右高度的双蒸水覆

盖胶面，其加水速度应控制在不破坏胶层分度。约60min左右后，当凝胶与水层间出现折射率不同的分层面时，表明凝胶聚合完成。倾去胶层蒸馏水，再用双蒸水洗涤胶面，以除去未聚合胶液，并用滤纸吸干多余的水。

（2）浓缩胶置备：用微量的未加TEMED的浓缩胶洗涤分离胶面一次，倾去洗涤用 的浓缩胶液，用滤纸吸干多余的胶液。然后将配好的浓缩胶连续缓慢加到已聚合的分离胶的上方，直至距离短玻璃板上缘约1mm处为止，随后将样品槽梳子轻轻插入浓缩胶内。待凝胶聚合后，小心拔出槽梳板，注意不要弄断或弄裂胶层。用长针头轻而有序地将每个凹形样品槽修饰整理，加双蒸水清洗槽坑，最后用针筒抽干凹槽内的双蒸水。

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将稀释5倍的Tris–Gly电极缓冲液，倒入上、下贮槽中，缓冲液高度以浸泡短玻璃板0.5cm以上为宜，即可准备加样。 （三）加样

将一定量的待测酶液、标准蛋白质样品分别与一定量的加样缓冲液混合。蛋白质的最后浓度尽可能控制在3~5?g/?L左右。

上样前若样品槽出现气泡，可用注射器剔除。然后用注射器吸取20~25μL样液，然后把装有样液注射器的针头小心伸进样品槽内，并尽量接近其底部，切勿捅穿胶层，轻轻推动注射器将样液注入样品槽底部，由于加样缓冲液中含有甘油，从而使样品液的比重增加并可自动沉将于样品槽的底部。一般以上样体积≤样品槽总体积2/3为宜。

为防止玻璃板两边缘样品点产生“边缘效应”，出现电泳分离效果不理想现象。一般胶板首、末样品槽只加溴酚蓝缓冲溶液。 （四）电泳

正确联接电泳槽与电泳仪的正负极，接通冷凝水，开启电泳仪开关，采用稳流电泳，首先把电压调整电位器向右旋6~7圈，使电泳过程电压有足够的上升区间，而后调整电流旋钮将电流调至25mA后开始电泳。当蓝色染料泳动迁移至距离橡胶框前沿约1.5cm时，将电流回调至零，关闭电源及冷却水，电泳结束。

（五）凝胶剥离

旋松电泳槽固定螺丝，取下凝胶模，卸下硅橡胶框，用不锈钢小铲撬离短玻璃板，弃去浓缩胶，小心剥离分离胶，并在凝胶片基线处切下一角作为加样基线标记，用双蒸水略冲胶面。

（六）染色与脱色

把胶片移入染色液中，染色6小时以上，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，更换脱色液直到电泳区带清晰为止。

五、结果分析与讨论

将脱色的凝胶片平放在玻璃板上，观察并记录实验结果，判断蔗糖酶的纯度。计算出 各蛋白带的位置，与已知分子量的蛋白带比较估算柱层析分离物的分子量大小。

六、问题讨论

1．Acr及Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，使用时应予注意。

Acr和Bis的贮液在保存过程中，会由于水解作用而产生丙烯酸和NH3，虽4℃置于棕色瓶内保存可有效防止水解作用，但也只能贮存1~2个月。可通过pH值（4.9~5.2）来判断检查试剂是否失效。

2．由于玻璃板表面的不洁净，可能会导致电泳时发生凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥 离，产生气泡或滑胶；剥胶时胶板极易断裂。所以所使用的电泳槽组件务必彻底清洗。 为保证样品槽平整，槽梳子使用前必须用95%乙醇 洗净，风干后才使用。

3．用琼脂密封长短玻璃间隙及灌胶时，胶层不能包裹有气泡，以免影响系统导电性。

4．为防止电泳后区带拖尾，影响分辨率，样品中盐离子强度应尽量低，含盐量高的 样品可经脱盐后再作电泳分析。

5．电泳分析时，不同分子量的样品应选用不同的分离胶浓度。蛋白质分子量在

9

65~200KDa可选用7.5%；21~200KDa，可选用10%凝胶；14~100KDa，可选用12%凝胶；6.5~200KDa，可选用15%凝胶。浓缩胶浓度均可选4%。操作时，若不知分子量也可先选用7.5%分离胶浓度尝试，因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳，均可取得较满意的电泳效果，而后根据分离情况选择适宜的浓度进一步取得理想的分离效果。

七、思考题

1．在不连续电泳体系中，样品在浓缩胶中是怎样被压缩成“层”的？ 2．加样缓冲液中甘油和溴酚蓝的作用是什么？可用何物代替甘油？ 3．根据实验过程，做好电泳的关键步骤有哪些？

4．脱色液可否重新使用？应如何处理？处理时应注意什么问题？ 5．电极缓冲液电泳后，能否重新使用，重新使用应做什么处理？ 6．酶样品电泳染色图谱中出现多条谱带意味着什么？

实验七 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量

一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的实验原理，掌握相应的实验技术。 二、实验原理

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是聚丙烯酰胺凝胶电泳的一种特殊形式。实验证明，在蛋白质溶液中加入十二烷基硫酸钠（SDS）这阴离子表面活性剂和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质–SDS复合物。大约每克蛋白质可结合1.4克SDS，蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子，所带负电荷量远远超过了它原有的电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间原有电荷的差别。同时，SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的变化，使它们在水溶液中的形状近似于长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度均为1.8mm，而长轴则随蛋白质的相对分子量成正比的变化。

这样的蛋白质–SDS复合物，在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的

影响，仅取决蛋白质分子量的大小。故可根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所做的标准

曲线，求出未知物的分子量。 三、试剂与仪器

（一）试剂（所用水为重蒸水）

1、30%单体胶贮备液（配置与聚丙烯酰胺凝胶电泳相同）。

2、pH8.8，3mol / L Tris-CHl 分离胶缓冲液（配置与聚丙烯酰胺凝胶电泳相同）。 3、pH6.8，1mol / L Tris-CHl 浓缩胶缓冲液（配置与聚丙烯酰胺凝胶电泳相同）。 4、10% SDS：称取10g SDS，在65℃下用水溶解并定溶至100mL。

10

5、10%过流酸铵：称取5.0过硫酸铵用水溶解并定容至50mL，临用时配置。放置冰箱

避光保存7天。

6、N, N, N，N–四甲基乙二胺（TEMED）。

7、Tris-Gly电极缓冲溶液：称取7.5g Tris盐和36g甘氨酸用水溶解，再加入10%SDS 25mL，用水定容至500mL，备用。临用时稀释5倍。

8、50mmol / L Tris-HCl (pH6.8)缓冲溶液（配置与聚丙烯酰胺凝胶电泳相同）。

9、加样缓冲溶液：吸取50mmol / L Tris-HCl (pH6.8)缓冲溶液3.2mL、10%SDS 溶液

11.5mL、 β-巯基乙醇2.5mL、溴酚蓝2mg以及甘油5 mL，用水溶解并定容至50mL。 10、染色液（配置与聚丙烯酰胺凝胶电泳相同）。 11、脱色液（配置与聚丙烯酰胺凝胶电泳相同）。 12、3%琼脂溶液。

13、标准分子量蛋白（电泳专用试剂）。 （二）仪器

1、直流稳压稳流电泳仪，电流100mA，电压400V—500V。 2、夹芯式垂直电泳槽，DYYⅢ 2A型，1.0mm梳槽。 四、操作方法

（一）电泳槽安装（参考聚丙烯酰胺凝胶电泳操作）。 （二）灌胶（参考聚丙烯酰胺凝胶 电泳操作）。

1、配胶

由于SDS电泳分离不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于所形成SDS—蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的正确选择尤为重要。如凝胶浓度太大，孔径太小，电泳时样品分子不能进入凝胶。如凝胶浓度太小，孔径太大，则样品中各种蛋白质分子均随着凝胶缓冲液流向前推进，而不能得以很好地分离。因此实验中可根据分析样品的分子量大小选择合适的凝胶配比。不同浓度分离胶配比参考如下：

表 不连续缓冲系统电泳中不同网孔凝胶溶液配方参考表

试剂 分离胶缓冲液 浓缩胶缓冲液 单体胶储备液 10%SDS 重蒸水 10%过硫酸铵 TEMED? 总体积 分离胶凝胶浓度 （12.5 T%） 分离胶凝胶浓度 （10 T%） 分离胶凝胶浓度 （7.2 T%） 浓缩胶凝胶浓度 （4 T%） ，

，

3.15mL / 10 mL 0.25 mL 11.2 mL 0.2 mL 40μL 3.15 mL / 8.5 mL 0.25 mL 12.7 mL 0.2 mL 40μL 3.15mL / 6.0 mL 0.25 mL 15.2 mL 0.2 mL 40μL / 2.5mL 2.7 mL 0.25 mL 14.2 mL 0.2 mL 40μL 20 mL 25 mL 25 mL 25 mL ?此溶液在灌胶前最后加入，以避免胶体凝固无法灌胶。 2、灌胶

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按需要配制分离胶和浓缩胶后，与聚丙烯酰胺电泳灌胶方法灌制实验用胶板，最后向电泳槽中加入Tris-Gly缓冲液，备用。 （三）样品处理与上样 1、电泳样品前处理

（1）标准蛋白样处理：按购置标准蛋白样品说明书操作，取一定体积标准蛋白样品溶液于1.5mL离心管，加入适量加样缓冲液，混匀，在100℃沸水中浴中加热3~5min，取出冷却后上样。若上样液中浑浊，离心后备用。

（2）待分析蛋白样品前处理：根据待测样品蛋白含量，加入适量的加样缓冲溶液溶解，使样品浓度约为0.5~2mg/mL，混匀，按上述方法加热处理，冷却，离心后备用。处理后的样品可放在4℃的冰箱中短期保存，-20℃冰箱中保存6个月，使用前在仍需在沸水浴中加热3~5min后上样。 2、加样

向样品槽加入20~25μL样品，一般以上样体积≤样品槽总体积2/3为宜。如样品槽出现气泡，可用注射器剔除。加样时把装有样液注射器的针头小心伸进样品槽内，并尽量接近其底部，切勿捅穿胶层，轻轻推动注射器将样液注入样品槽底部，由于加样缓冲液中含有甘油，从而使样品液的比重增加并可自动沉将于样品槽的底部。

由于两端样品槽的样点易产生边缘效应影响，影响分子量分布的分析结果，所以凝胶板两端的样品槽一般不作点样用，仅注入溴酚蓝指示液跟踪样品在电场中的泳动情况。 （四）电泳

正确联接电泳槽与电泳仪的正负极，接通冷凝水，开启电泳仪开关，采用稳流电泳。首先把电压调整电位器向右旋转6~7圈，使电泳过程电压有足够的上升区间，调整电流旋钮将电流调至25mA后开始电泳。当溴酚蓝指示液泳动迁移至距离橡胶框前沿约1.5cm时，将电流回调至零，关闭电源及冷却水，电泳结束。

（五）凝胶剥离（操作与聚丙烯酰胺凝胶电泳操作相同） （六）染色与脱色（操作与聚丙烯酰胺凝胶电泳操作相同）

五、结果计算与分析

由电泳实验结果，记录标准蛋白质分子以及样品蛋白分子相对迁移加样端距离(cm)、溴酚蓝染料相对迁移加样端距离(cm)。 根据下式计算各标准蛋白质分子的相对迁移率： 相对迁移率

=

标准蛋白质分子迁移距染料迁移距离离(cm)(cm)

以标准蛋白质相对分子质量的对数（lgMw）为纵坐标，标准蛋白质分子的相对迁移率为横坐标做标准曲线，根据样品蛋白的相对迁移率从标准曲线中求出其相对分子量。 注意：记录溴酚蓝染料相对迁移加样端距离(cm)应在凝胶脱色前完成。 六、思考题

比较聚丙烯酰胺凝胶电泳与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点及适用范围。

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实验八 蔗糖酶的酶活特性研究

一、目的要求 通过检测不同温度、pH对蔗糖酶活力的影响，了解蔗糖酶的酶活特性，

学习设计测定蔗糖酶动力学参数的方法。

二、实验原理

酶是生物体中具有催化功能的蛋白质，其催化作用受反应温度的影响。一方面与一般

化学反应一样，提高温度可以增加酶反应的速度；另一方面，酶是一种蛋白质，温度过高会引起酶蛋白的变性，导致酶钝化甚至失活。在一定条件下，反应速度达到最大值时的温度称为某种酶的最适温度。同样酶的活性受环境pH的影响极其显著，每一种酶都有一个特定的pH值，在此pH值下酶反应速度最快，而在此两侧酶反应速度都比较缓慢。因为酶是两性电解质，在不同的酸碱环境中酶结构中可离解基团的解离状态不同，所带电荷不同，而它们的解离状态对保持酶的结构、底物与酶的结合能力以及催化能力都起着重要作用。因此，酶表现最大活性的pH值即为该酶的最适pH值。

蔗糖酶酶促反应的底物和产物均为非极性物质，无离解基团，所以实验测出的pH值对蔗糖酶活力影响的实验值，可以反映出酶蛋白上相关基团的解离对酶活力的影响。

三、试剂与仪器

（一）试剂

1、蔗糖酶（纯化后产品）。 2、0.2mol/L NaAc溶液。

3、不同pH醋酸-醋酸钠缓冲溶液：取一定体积0.2mol/L NaAc溶液，用pH计监控，加醋酸调pH至所需pH值，然后加水至100mL。 4、 蔗糖酶活力测定试剂。 （二）仪器：用蔗糖酶活力测定。

四、操作方法

（一）pH值对蔗糖酶活力的影响

选取一定pH值范围，在一定的底物浓度、温度和酶浓度下，测定蔗糖酶活力随pH的变化。 （二）温度对蔗糖酶活力的影响

测定方法与pH-酶活力关系测定类似，即把酶浓度、底物浓度和pH值固定在较适状态，在不同温度条件下测定蔗糖酶活力。

以上实验步骤及结果还均需要以表格形式记录。

五、结果分析与讨论

根据实验结果，作pH-酶活力曲线、温度-酶活力曲线。确定实验条件下蔗糖酶催化蔗糖水解反应的最适pH及最适温度。

六、思考题

1．什么是酶的最适温度？pH对酶活力有何影响？

2．实验中必须注意控制哪些实验条件才能较好地完成实验？

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