生物化学 - 吴颜晖（暨南大学） - 第二章蛋白质的结构与功能

第二章 蛋白质的结构与功能

蛋白质（protein）是生物体的基本组成成分之一，也是含量最丰富的高分子物质，约占人体固体成分的45 ％，分布广泛，几乎所有的器官组织都含有蛋白质。生物体结构越复杂其蛋白质种类和功能也越繁多。一个真核细胞可有数千种蛋白质，各自有特殊的结构和功能。如酶、抗体、大部分凝血因子、多肽激素、转运蛋白、收缩蛋白等都是蛋白质，但结构与功能截然不同。在物质代谢、机体防御、血液凝固、肌肉收缩、细胞信息传递、个体生长发育、组织修复等方面，蛋白质发挥着不可替代的重要作用。可见蛋白质是生命活动的物质基础，没有蛋白质就没有生命。

第一节蛋白质的分子组成

组成蛋白质分子的元素主要有碳（50％－55％）、氢（6％－7％）、氧（19％一24％）；氮（13％一19％）和硫（0％－4％）。有些蛋白质还含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钻、铝等，个别蛋白质还含有碘。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。由于蛋白质是体内的主要含氮物，因此测定生物样品的含氮量就可按下式推算出蛋白质的大致含量。 每克样品含氮克数 X 6．25 X 100＝100样品中蛋白质含量（g％） 一、氨基酸

氨基酸（amino acid）是组成蛋白质的基本单位。蛋白质受酸、碱或蛋白酶作用而水解产生游离氨基酸。存在于自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属L-α氨基酸（除甘氨酸外）。

由图2－l可见，连在一COO-基上的碳称为α一碳原子，为不对称碳原子（甘氨酸除 外），不同的氨基酸其侧链（R）各异。生物界中也有D一氨基酸，大都存在于某些细胞产生的抗生素及个别植物的生物碱中。 （－）氨基酸的分类

组成体内蛋白质的20种氨基酸，根据其侧链的结构和理化性质可分成四类：①非极性疏水性氨基酸；②极性中性氨基酸；③酸性氨基酸；④碱性氨基酸（表2一1）。

20种氨基酸中脯氨酸和半胱氨酸结构较为特殊。脯氨酸应属亚氨基酸，但其亚氨基仍能与另一羧基形成肽链。脯氨酸在蛋白质合成加工时可被修饰成羟脯氨酸。此外2个半胱氨酸通过脱氢后可以二硫键相结合，形成胱氨酸（图2－2）。蛋白质中有不少半胱氨酸以胱氨酸形式存在。

（二）氨基酸的理化性质

1．两性解离及等电点 由于所有氨基酸都含有碱性的α一氨基和酸性的α一羧基，可

＋＋

在酸性溶液中与质子（H）结合成带正电荷的阳离子（－NH），也可在碱性溶液中与OH－－结合，失去质子变成带负电荷的阴离子（－COO）。因此氨基酸是两性电解质，具有两性解离的特性。氨基酸的解离方式取决于其所处溶液的酸碱度。在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的 pH称为该氨基酸的等电点（isoelectric point，PI）。

氨基酸的pI是由α一羧基和α一氨基的解离常数的负对数 pK1和 PK2决定的。pI计算公式为：pI= l／2（pK1＋PK2）.如丙氨酸pK－ COOH＝2·34，pK－NH2＝9·69，所以pI＝l／2（2·34＋9·69）=6.02。若1个氨基酸有3个可解离基团，写出它们电离式后取兼性离子两边的pK值的平均值，即为此氨基酸的pI值。

2．紫外吸收性质 根据氨基酸的吸收光谱，色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm波长附近（图2—3）。由于大多数蛋白质含有酪氨酸和色氨酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值，是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。

3．印三酮反应 氨基酸与印三酮水合物共加热，印三酮水合物被还原，其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨结合，再与另一分子印三酮缩合成为蓝紫色的化合物，此化合物最大吸收峰在570nm波长处。由于此吸收峰值的大小与氨基酸释放出的氨量成正比，因此可作为氨基酸定量分析方法。

二、肽

（一）肽（petide）

德国化学家Emil Fischer早已证明蛋白质中的氨基酸相互结合成多肽链（polypeptide chain），例如1分子甘氨酸和1分子甘氨酸脱去1分子水缩会成为甘氨酰甘氨酸，这是最简单的肽，即二肽。在甘氨酰甘氨酸分子中连接两个氨基酸的酰胺键称为肽键（peptide bond）(图2—4)。二肽通过肽键与另一分子氨基酸缩合生成三肽。此反应可继续进行，依次生成四肽、五肽??一般来说，由10个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽（oligopeptide），更多的氨基酸相连而成的肽称为多肽（polypeptide）。肽链中的氨基酸分子因脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基（residue）。蛋白质就是由许多氨基酸残基组成的多肽链。蛋白质和多肽在分子量上很难划出明确界限。在实际应用中，常把由30个氨基酸残基组成的促肾上腺皮质激素称为多肽，而把含有51个氨基酸残基、分子量为5733的胰岛素称为蛋白质。这是习惯上的多肽与蛋白质的分界线。多肽链有两端，

有自由氨基的一端称氨基末端（amino terminal）或 N一端，有自由羧基的一端称为羧基末端（carboxyl terminal）或C一端。

(二)生物活性肽

人体内存在许多具有生物活性的肽，有的仅三肽，有的属寡肽或多肽，在神经传导、代谢调节方面起着重要的作用。

1．谷优甘肽（glutathione，GSH）是由谷、半胱和甘氨酸组成的三肽。第一个肽键与一般不同，由谷氨酸γ一羧基与半脱氨酸的氨基组成（图2－5），分子中半胱氨酸的巯基是该化合物的主要功能基团。GSH的巯基具有还原性，可作为体内重要的还原剂保护体内蛋白质或酶分子中巯基免遭氧化，使蛋白质或酶处在活性状态。在谷胱甘肽过氧化物酶的催化下，GSH可还原细胞内产生的H2O2，使其变成H2O，与此同时，GSH被氧化成氧化型谷胱甘肽（GSSG）（图2—6），后者在谷胱甘肽还原酶催化下，再生成GSH。此外，GSH的巯基还有嗜核特性，能与外源的嗜电子毒物如致癌剂或药物等结合，从而阻断这些化合物与DNA、RNA或蛋白质结合，以保护机体免遭毒物的损害。

2．多肽类激素及神经肽 体内有许多激素属寡肽或多肽，例如属于下丘脑一垂体一肾上腺皮质轴的催产素（9肽）、加压素（9肽）、促肾上腺皮质激素（39肽）、促甲状腺素释放激素（3肽）等。促甲状腺素释放激素是一个特殊结构的三肽（图2－7），其N-末端的谷氨酸环化成为焦谷氨酸（pyroglutamic acid），C一末端的脯氨酸残基酸化成为脯氨酰胺，它由下丘脑分泌，可促进腺垂体分泌促甲状腺素。

有一类在神经传导过程中起信号转导作用的肽类被称为神经肽（neuropeptide）。较早发现的有脑啡肽（5肽）、β—内啡肽（31肽）和强啡肽（17肽）等。近年还发现孤啡肽（17肽），其结构类似于强啡肽。它们与中枢神经系统产生痛觉抑制有密切关系。因此很早就被用于临床的镇痛治疗。除此以外，神经肽还包括P物质（10肽）、神经肽Y等。随着脑科学的发展，相信将发现更多的在神经系统中起着重要作用的生物活性肽或蛋白质。 三、蛋白质的分类

蛋白质是由20种氨基酸组成的大分子化合物，除氨基酸外，某些蛋白质还含有其他非氨基酸组分。因此根据蛋白质组成成分可分成单纯蛋白质和结合蛋白质，前者只含氨基酸，而后者除蛋白质部分外，还含有非蛋白质部分，为蛋白质的生物活性或代谢所依赖。结合蛋白质中的非蛋白质部分被称为辅基。绝大部分输基通过共价键方式与蛋白质部分相连。构成蛋白质辅基的种类也很广，常见的有色素化合物、寡糖、脂类、磷酸、金属离子甚至分子量较大的核酸。细胞色素C是含有色素的结合蛋白质，其铁卟啉环上的乙烯基侧链与蛋白质部分的半胱氨酸残基以硫醚键相连，铁卟啉中的铁离子是细胞色素C的重要功能位点。免疫球蛋白是一类糖蛋白，作为辅基的数支寡精链通过共价键与蛋白质部分连接。 蛋白质还可根据其形状分为纤维状蛋白质和球状蛋白质两大类。一般来说，纤维状蛋白质形似纤维，其分子长轴的长度比短轴长10倍以上。纤维状蛋白质多数为结构蛋白质，较难溶于水，作为细胞坚实的支架或连接各细胞、组织和器官。大量存在于结缔组织中的胶原蛋白就是典型的纤维状蛋白质，其长轴为300nm，而短轴仅为1．5nm（详见第二十一章）。球状蛋白质的形状近似于球形或椭圆形，多数可溶于水，许多具有生理活性的蛋白质如酶、转运蛋白、蛋白质类激素及免疫球蛋白等都属于球状蛋白质。 第二节蛋白质的分子结构

蛋白质分子是由许多氨基酸通过肽健相连形成的生物大分子。人体内具有生理功能的蛋

白质都是有序结构，每种蛋白质都有其一定的氨基酸百分组成及氨基酸排列顺序，以及肽链空间的特定排布位置。因此由氨基酸排列顺序及肽键的空间排布等所构成的蛋白质分子结构，才真正体现蛋白质的个性，是每种蛋白质具有独特生理功能的结构基础。由于组成人体蛋白质的氨基酸有对种，且蛋白质的分子量均较大，因此蛋白质的氨基酸排列顺序和空间位置几乎是无穷尽的，足以为人体多达成千上万种蛋白质提供各异的序列和特定的空间排布，才能完成生命所赋予的数以千万计的生理功能。蛋白质分子结构分成一级、二级、三级、四级结构4个层次，后三者统称为高级结构或空间构象（conformation）。蛋白质的空间构象涵盖了蛋白质分子中的每一原子在三维空间的相对位置，它们是蛋白质特有性质和功能的结构基础。但并非所有的蛋白质都有四级结构，由一条肽链形成的蛋白质只有一级、二级和三级结构，由二条或二条以上多肽链形成的蛋白质才可能有四级结构。 一、蛋白质的一级结构

蛋白质分子中氨基酸的排列顺序称为蛋白质的一级结构（primary structure）。一级结构中的主要化学键是肽键，有些蛋白质还包含二硫键即由两个半脱氨酸巯基脱氢氧化而成。图 2—8为牛胰岛素的一级结构。胰岛素有 A和 B二条链，A链有21个氨基酸残基，B链有30个。如果把氨基酸序列（amino acid saquence）标上数码，应以氨基末端为 1号，依次向羧基末端排列。牛胰岛素分子中有3个二硫键，三个位于A链内，由A链的中胰岛素的第6位和第 11位半胱氨酸的巯基脱氢而形成，另 2个二硫键位于 A、B二键间（图2—8）。

体内种类繁多的蛋白质，其一级结构各不相同，一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。但一级结构并不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。

二、蛋白质的二级结构

蛋白质的二级结构（secondary structure）是指蛋白质分子中某一段肽键的局部空间结构，也就是该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧键的构象。

20世纪30年代末L．Pauling 和R．B．Corey应用X线衍射技术研究氨基酸和寡肽的晶体结构，其目的是要获得一组标准键长和键角，以推导肽的构象，最终提出了肽单元(peptide unit)概念。他们发现参与肽键的 6个原子——Cα1，C，O，N，H，Cα2位于同一平面，Cα1和Cα2在平面上所处的位置为反式（trans）构型，此同一平面上的6个原子构成所谓的肽单元（图2-9）。其中肽键（C-N）的键长为0．132nm，介于C-N的单键长(0．149nrn)和双键长（0．127nrn）之间，所以有一定程度双键性能，不能自由旋转。而Cα分别与N和羰基碳相连的键都是典型的单键，可以自由旋转，Cα与羰基碳的键旋转角度以φ表示，Cα与N的键角以ψ表示（图2-9）。也正由于肽单元上Cα原子所连的两个单键的自由旋转角度，决定了两个相邻的肽单元平面的相对空间位置。

Pauling和Corey根据实验数据提出了两种肽链局部主链原子空间构象的分子模型，称为α一螺旋（α－helix）和β折叠（β—pleated sheet），它们是蛋白质二级结构的主要形式。在α螺旋结构（图2－10）中，多肽链的主链围绕中心轴呈有规律的螺旋式上升，螺旋的走向为顺时钟方向，即右手螺旋，其ψ为-47o，φ为-57o。氨基酸侧链伸向螺旋外侧。每3．6个氨基酸残基螺旋上升一圈，螺距为0．54nrn。α一螺旋的每个肽键的N－H和第四个肽键的羰基氧形成氢键，氢键的方向与螺旋长轴基本平行。肽链中的全部肽键都可形成氢键，以稳固α一螺旋结构。肌红蛋白和血红蛋白分子中有许多肽链段落呈α螺旋结构。毛发的角蛋白。肌肉的肌球蛋白以及血凝块中的纤维蛋白，它们的多肽链几乎全长都卷曲成α一螺旋。数条α—螺旋状的多肽链尚可缠绕起来，形成缆索，从而增强了其机械强度，并具有可伸缩性（弹性）。

β—折叠与α一螺旋的形状截然不同，呈折纸状。在β—折叠结构（图2－11）中，多肽链充分伸展，每个肽单元以Cα为旋转点，依次折叠成锯齿状结构，氨基酸残基侧链交替地位于锯齿状结构的上下方。所形成的锯齿状结构一般比较短，只含5－8个氨基酸残基，两条以上肽链或一条肽链内的若干肽段的锯齿状结构可平行排列，两条肽链走向可相同，也可相反。走向相反时，两条反平行肽链的间距为0．70nm（图2-11 A），并通过肽链间的肽键羰基氧和亚氨基氢形成氢键从而稳固β—折叠折叠结构。蚕丝蛋白几乎都是β—折叠结构，许多蛋白质既有α一螺旋又有β—折叠。 除α—螺旋和β—折叠外，蛋白质二级结构还包括β—转角（β—turn）和无规卷曲（random

o

coil）。β—转角（图2-11B）常发生于肽链进行180回折时的转角上。β—转角通常有单个氨基残基组成，其第一个残基的羰基氧（O）与第四个残基的氨基氢（H）可形成氢键。β—转

角的结构较特殊，第二个残基常为脯氨酸，其他常见残基有甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和色氨酸。无规卷曲用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。

在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个具有特殊功能的空间，被称为模序（motif）。一个模序总有其特征性的氨基酸序列，并发挥特殊的功能。在许多钙结合蛋白分子中通常有一个结合钙离子的模序，它由α—螺旋一环一α—螺旋三个肽段组成（图2-12A），在环中有几个恒定的亲水侧链，侧链末端的氧原子通过氢键而结合钙离子。近年发现的锌指结构（zinc finger）也是一个常见的模序例子。此模序由1个α—螺旋和2个反平行的β—折叠三个肽段组成（图2-12B）。它形似手指。具有结合锌离子的功能。此模序的N—端有1对半胱氨酸残基， C端有1对组氨酸残基，此4个残基在空间上形成一个洞穴，恰好容纳1个 Zn2+。由于 Zn2+可稳固模序中的α—螺旋结构，致使此α—螺旋能镶嵌于DNA的大沟中，因此含锌指结构的蛋白质都能与DNA或RNA结合。可见模序的特征性构象是其特殊功能的结构基础。有些蛋白质的模序仅有几个氨基酸残基组成，例如纤连蛋白中能与其受体结合的肽段，只是RGD三肽。 蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成α—螺旋或β—折叠，它就会出现相应的二级结构。例如一段肽链有多个谷氨酸或天冬氨酸残基相邻，则在pH7．0时这些残基的游离羧基都带负电荷，彼此相斥，妨碍个螺旋的形成。同样，多个碱性氨基酸残基在一肽段内，由于正电荷相斥，也妨碍α—螺旋的形成。此外，天冬氨酸、亮氨酸的侧链很大，也会影响α—螺旋形成。脯氨酸的N原子在刚性的五元环中，其形成的肽键N原子上没有H，所以不能形成氢键，结果肽链走向转折，不形成α—螺旋。形成β—折叠的肽段要求氨基酸残基的侧链较小，才能容许两条肽段彼此靠近。

蛋白质空间构象的正确形成，除一级结构为决定因素外，还需要一类称为分子伴侣（chaperon）的蛋白质参与。蛋白质在合成时，还未折叠的肽段有许多疏水基团暴露在外，具有分子内或分子间聚集的倾向，使蛋白质不能形成正确空间构象。分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。此外，蛋白质分子中特定位置的两个半脱氨酸可形成二硫键，这是蛋白质形成正确空间构象和发挥功能的必要条件，如胰岛素分子中有3个特定连接的二硫键。如二硫键发生错配，蛋白质的空间构象和功能都会受到影响，而分子伴侣对蛋白质分子中二硫键正确形成起到重要作用。 三、蛋白质的三级结构 蛋白质的三级结构（tertiary structure）是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，也就是整条肽链所有原子在三维空间的排布位置。

肌红蛋白是由153个氨基酸残基构成的单个肽链的蛋白质，含有1个血红素辅基。图 2－13显示肌红蛋白的三级结构。它有 A至 H 8个螺旋区，两个螺旋区之间有一段无规卷曲，脯氨酸位于转角处。由于侧链R基团的相互作用，多肽链缠绕，形成一个球状分子，球表面主要有条水侧链，疏水侧链则位于分子内部。蛋白质三级结构的形成和稳定主要靠次级键——疏水作用、离子键（盐键）、氢键和 Van der Waals力等（图2－14）。 分子量大的蛋白质三级结构常可分割成1个和数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行其功能，称为结构域（domain）。如纤连蛋白（fibronectin），它由H条多肽链通过近C一端的两个H硫键相连而成，含有6个结构域，各个结构域分别执行一种功能，有可与细胞、胶原、DNA和肝素等结合的结构域（图2．15）。 四、蛋白质的四级结构

对蛋白质分子的二、三级结构而言，只涉及由一条多肽链卷曲而成的蛋白质。在体内有许多蛋白质分子含有二条或多条多肽链，才能全面地执行功能。每一条多肽链都有其完整的三级结构，称为蛋白质的亚基（subunit），亚基与亚基之间呈特定的三维空间排布，并以非共价键相连接。这种蛋白质分子中各个亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构（quaternary structure）。在四级结构中，各亚基间的结合力主要是疏水作用，氢键和离子键也参与维持四级结构。含有四级结构的蛋白质，单独的亚基一般没 有生物学功能，只有完整的四级结构寡聚体才有生物学功能。血红蛋白是由2个α亚基和2个β亚基组成的四聚体，两种亚基的三级结构颇为相似，且每个亚基都结合有1个血红素（heme）辅基（图2－16）。4个亚基通过8个离子键相连，形成血红蛋白的四聚体，具有运输氧和CO2的功能。但每1个亚基单独存在时，虽可结合氧且与氧亲和力增强，但在体

内组织中难于释放氧。

第三节 蛋白质一级结构与功能的关系 一、蛋白质一级结构与功能的关系

（一）一级结构是空间构象的基础

Arlfinsen在研究核糖核酸酶时已发现，蛋白质的功能与其三级结构密切相关，而特定三级结构是以氨基酸顺序为基础的。核糖核酸酶由124个氨基酸残基组成，有4对二硫键（Cys26和Cys84，Cys40和Cys95，Cys58和Cys110，Cys65和Cys72）（图2－17A）。用尿素（或盐酸脱）和β一巯基乙醇处理该酶溶液，分别破坏次级键和二硫键，使其二、三级结构遭到破坏，但肽键不受影响，故一级结构仍存在，此时该酶活性丧失贻尽。核糖核酸酶中的4对二硫键被β—巯基乙醇还原成一SH后，若要再形成4对二硫键，从理论上推算有105种不同配对方式，唯有与天然核糖核酸酶完全相同的配对方式，才能呈现酶活性。当用透析方法去除尿素和β巯—基乙醇后，松散的多肽链，循其特定的氨基酸顺序，卷曲折叠成天然酶的空间构象，4对二硫键也正确配对，这时酶活性又逐渐恢复至原来水平（图2－17B）。这充分证明空间构象遭破坏的核糖核酸酶只要其一级结构未被破坏，就可能回复到原来的三级结构，功能依然存在。

（二）一级结构与功能的关系

已有大量的实验结果证明，一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象以及功能也相似。例如不同哺乳类动物的胰岛素分子结构都由A和B两条键组成，且二硫键的配对和空间构象也极相似，一级结构也相似仅有个别氨基酸差异，因而它们都执行着相的调节血糖代谢等生理功能。（表2-2）

此外，垂体前叶分泌的促肾上腺皮质激素（ACTH）和促黑激素（α－MSH，β—MSH）共有一段相同的氨基酸序列（图2－18），因此，ACTH也可促进皮下黑色素生成但作用较弱。

一些广泛存在于生物界的蛋白质如细胞色素 C（Cytochrome C），比较它们的一级结构，可以帮助了解物种进化间的关系（图2－19）。物种间越接近，则细胞色素C的一级结构越相似，其空间构象和功能也相似。例如猕猴与人类很接近，两者一级结构只相差1个氨基酸残基，即第102位氨基酸猕猴为精氨酸，人类为酪氨酸；人类和黑猩猩的细胞色素。一级结构完全相同。面包酵母与人类从物种进化看，两者相差极远，所以两者细胞色素C一级结构相差达51个氨基酸。灰鲸是哺乳类动物，由陆上动物演化，它与猪、牛及羊只差2个氨基酸。 但是，有时蛋白质分子中起关键作用的氨基酸残基缺失或被替代，都会严重影响空间构象乃至生理功能。例如正常人血红蛋白B亚基的第6位氨基酸是谷氨酸，而镰刀形红细胞贫血患者的血红蛋白中，谷氨酸变成了颁氨酸，仅此一个氨基酸之差，本是水溶性的血红蛋白，就聚集成丝，相互粘着，导致红细胞变形成为镰刀状而极易破碎，产生贫血。这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，被称之为“分子病”。但并非一级结构中的每个氨基酸都很重要，如细胞色素C，此蛋白质分子中某些位点即使置换数10个氨基酸残基，其功能依然不变。

二、蛋白质空间结构与功能的关系

体内各种蛋白质都有特殊的生理功能，这与其空间构象有着密切的关系。肌红蛋白 和血红蛋白是阐述蛋白质空间结构和功能关系的典型例子。 （一）肌红蛋白和血红蛋白结构

肌红蛋白与血红蛋白都是含有血红素辅基的蛋白质。血红素是铁叶琳化合物（图2－20），它由4个吡咯环通过4个甲炔基相连成为一个环形，Fe2+居于环中。Fe2+有6个配位键，其中4个与吡咯环的N配位结合， l个配位键和肌红蛋白的93位（F8）组氨酸残基结合，氧则与Fe2+形成第6个配位键，接近第64位（E7）组氨酸。

从X线衍射法分析获得的肌红蛋白（myoglubin，Mb）的三维结构（图2－13）中，可见它是一个只有三级结构的单链蛋白质，有8段α螺旋结构，分别称为 A、B、C、D、E、F、G及 H肽段。整条多肽链折叠成紧密球状分子，氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部，富极性及电荷的则在分子表面，因此其水溶性较好。Mb分子内部有一个袋形空穴，血红素居于其中。血红素分子中的两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中的两个碱性氨基酸侧链上的正电荷相连，加之肽链中的四组氨酸残基还与Fe2+形成配位结合，所以血红素辅基与蛋

白质部分稳定结合。

血红蛋白（hemoglubin，Hb）具有4个亚基组成的四级结构（图 2－16），每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。共结合4分子氧。成年人红细胞中的地主要由两条α肽链和两条β肽链（αβ）组成，α链含141个氨基酸残基，β链含146个氨基酸残基。胎儿期主要为αγ，胚胎期为αε。Hb各亚基的三级结构与 Mb极为相似。Hb亚基之间通过8对盐键（图2－21），使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。

〔二〕血红蛋白的构象变化与结合氧 Hb与 Mb一样可逆地与O2结合，氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。图2-22为Hb和Mb的氧解离曲线，前者为S状曲线，后者为直角双曲线。可见，Mb易与O2结合，而Hb与O2的结合在O2分压较低时较难。Hb与O2结合的S型曲线示Hb的4个亚基与4个O2结合时平衡常数并不相同，而是有4个不同的平衡常数。Hb最后一个亚基与O2结合时其常数最大，从S型曲线的后半部呈直线上升可证明此点。根据S形曲线的在。特征可知，Hb中第一个亚基与O2结合以后，促进第二及第三个亚基与O2的结合，当前三个亚基与O2结合后，又大大促进第四个亚基与O2结合，这种效应称为正协同效应（positive cooperativity）。协同效应的定义是指一个亚基与其配体（Hb中的配体为O2）结合后，能影响此寡聚体中另一亚基与配体的结合能力。如果是促进作用则称为正协同效应；反之则为负协同效应。

根据Perulz等利用x线衍射技术分析Hb和氧合Hb结晶的三维结构图谱，提出了解释O2与Hb结合的正协同效应的理论。

未结合O2时，Hb的α/β和α/β呈对角排列，结构较为紧密，称为紧张态（tense state,T态），T态Hb与O2的亲和力小。随着O2的结合，4个亚基羧基末端之间的盐键断裂，其二级、三级和四级结构也发生变化，使α/β和α/β的长轴形成15”的夹角（图2一23），结构显得相对松弛，称为松弛态（relaxed State，R态）。图 2－24显示 Hb氧合与脱氧时T态和R态相互转换的可能方式。T态转变成R态是逐个结合O2而完成的。在脱氧Hb中，Fe2+半径比卟啉环中间的孔大，因此Fe2+高出卟琳环平面0．075nrn，而靠近F8位组氨酸残基。当第1个O2与血红素Fe2+结合后．使Fe2+的半径变小，进入到卟啉环中间的小孔中（图2－25），引起F肽段等一系列微小的移动，同时影响附近肽段的构象，造成两个α亚基间盐键断裂，使亚基间结合松弛，可促进第二个亚基与O2结合，依此方式可影响第三、四个亚基与O2结合，最后使四个亚基全处于R态。此种一个氧分子与 Hb亚基结合后引起亚基构象变化，称为变构效应（allosteric effect）。小分子O2称为变构剂或效应剂，Hb则被称为变构蛋白。变构效应不仅发生在Hb与O2之间，一些酶与变构剂的结合、配体与受体结合也存在着变构效应，所以它具有普遍意义。系列微小的移动，同时影响附近肽段的构象。

第四节 蛋白质的理化性质及其分离纯化

蛋白质既然由氨基酸组成，其理化性质必然与氨基酸相同或相关，例如，两性电离及等电点、紫外吸收性质、呈色反应等。但蛋白质又是生物大分子化合物，还具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点。细胞和体液中蛋白质都是数以百万计相混合，要分析单个蛋白质的结构和功能势必先要分离纯化蛋白质。蛋白质分离通常就利用其特殊理化性能，采取盐析、透析、电泳、层析及超速离心等不损伤蛋白质空间构象的物理方法，以满足研究蛋白质结构与功能的需要。

一、蛋白质的理化性质 （一）蛋白质的两性电离

蛋白质分子除两端的氨基和氨基可解离外，侧链中某些基团，如谷氨酸、天冬氨酸残基中的γ和β—羧基，赖氨酸残基中的ε—氨基，精氨酸残基的胍基和组氨酸的咪唑基，在一定的溶液水条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带负电行，反之则带正电荷。 体内各种蛋白质的等电点不同，但大多数接近于 pH5 .0所以在人体体液 pH 7．4的环境下，大多数蛋白质解离成阴离子。少数蛋白质含碱性氨基酸较多，其等电点偏于碱性，被称为碱性蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白等。也有少量蛋白质含酸性氨基酸较多，其等电点偏于酸性，被称为酸性蛋白质，如胃蛋白酶和丝蛋白等。 （二）蛋白质的肢体性质

蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的颗粒大小可达l

－100nm胶粒范围之内。蛋白质颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质颗粒的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出。除水化膜是维持蛋白质胶体稳定的重要因素外，蛋白质胶粒表面可带有电荷，也可起胶粒稳定的作用。若去除蛋白质胶粒两个稳定因素，蛋白质极易从溶液中沉淀。 （三）蛋白质的变性、沉淀和凝固

蛋白质的三级结构主要依赖于氨基酸残基R之间的相互作用，从而保持蛋白质的天然构象。但在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，称为蛋白质的变性（denaturation）。一般认为蛋白质的变性主要发生二硫键和非共价键的破坏，不涉及一级结构的改变。蛋白质变性后，其溶解度降低，粘度增加，结晶能力消失，生物活性丧失，易被蛋白酶水解。造成蛋白质变性的因素有多种，常见的有加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。在医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外，防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。

蛋白质变性后，疏水侧链暴露在外，肽链融汇相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出，这一现象被称为蛋白质沉淀。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性（renaturation）。图2－17所示，在核糖核酸酶溶液中加入尿素和β一巯基乙醇，可解除其分子中的4对二硫键和氢键，使空间构象遭到破坏，丧失生物活性。变性后如经透析方法去除尿素和β巯基乙醇，并设法使巯基氧化成二硫键，核糖核酸酶又恢复其原有的构象，生物学活性也几乎全部重现。但是许多蛋白质变性后，空间构象严重被破坏，不能复原，称为不可逆性变性。

蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能溶解于强酸或强碱溶液中，若将pH调至等电点，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍可溶解于强酸和强碱中。如再加热则絮状物可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用（protein coagulation）。实际上凝固是蛋白质变性后进一步发展的不可逆的结果。 （四）蛋白质的紫外吸收

由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。在此波长范围内，蛋白质的O．D．280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。

(五)蛋白质的呈色反应 1．茚三酮反应（ninhydrin reaction）蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应，详见本章第一节。

2．双缩脲反应（buret reaction）蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，称为双缩脲反应。氨基酸不出现此反应。当蛋白质溶液中蛋白质的水解不断加强时，氨基酸浓度上升，其双绩豚是色的深度就逐渐下降，因此双缩腺反应可检测蛋白质水解程度。

二、蛋白质的分离和纯化 （－）丙酮沉淀及盐析

这是两种常用的使蛋白质从溶液中沉淀的方法。蛋白质在溶液中一般含量很低，经沉淀浓缩，以利进一步分离纯化。使用丙酮沉淀时，必须在0－4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。

盐析（salt precipitation）是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，破坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素而沉淀。各种蛋白质盐折时所需的盐浓度及pH均不同。例如血清中的白蛋白及球蛋白，前者溶于 pH 7．0左右的半饱和的硫酸铵溶液中，而后者在此溶液中沉淀。当硫酸按溶液达到饱和时，白蛋白也随之析出。所以盐析法可将蛋白质初步分离，不过欲得纯品，尚需用其他方法。许多蛋白质经纯化后，在盐溶液中长期放置逐渐析出，成为整齐的结晶。

蛋白质在高于或低于其pI的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动，这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术，称为电泳（electrophoresis）。根据支撑物的不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。薄膜电泳是将蛋白质溶液点样于薄膜上，薄

膜两端分别加正负电极，此时带正电荷的蛋白质向负极泳动；带负电荷的向正极泳动；带电多，分子量小的蛋白质泳动速率快；带电少，分子量大的则泳动慢，于是蛋白质被分离。凝胶电泳的支撑物为琼脂糖、淀粉或聚丙烯酸胺凝胶。凝胶置于玻璃板上或玻璃管中，两端加上正负电极，蛋白质即在凝胶中泳动。电泳结束后，用蛋白质显色剂显色，即可看到一条条已被分离的蛋白质色带。 （三）透析

利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法叫透析（dialysis）。透析袋是用具有超小微孔的膜，如硝酸纤维素膜制成。微孔一般只允许分子量为 10 000以下的化合物通过。蛋白质是高分子化合物故留在袋内。当透析袋内盛有蛋白质溶液，再置于水中，则小分子物质如硫酸铵、氯化钠等即透过薄膜。不断更换袋外的水，可把袋内小分子物质全部去尽。如果袋外放吸水剂如聚乙二醇，则袋内水分伴同小分子物质逐出袋外，袋内蛋白质溶液尚可达到浓缩的目的。 （四）层析

层析（chromatography）是蛋白质分离纯化的重要手段之一。层析种类很多，有离子交换层析。亲和层析等。其中离子交换层析应用最广。蛋白质和氨基酸一样，是两性电解质，在某一特定pH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离（图2-26）。

图2－26介绍的是阴离子交换层析，将阴离子交换树脂颗粒填充在层析管内，由于阴离子交换树脂颗粒上带正电荷，能吸引溶液中的阴离子（图2-26a）。然后再用含阴离子（如 －

Cl）的溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来（图 2-26b），增加 Cl浓度。含负电量多的蛋白质也被洗脱下来（图2-26C），于是两种蛋白质被分开。 （五）分子筛

又称凝胶过滤（gel filtration），是层析的一种，层析柱内填满带有小孔的颗粒，一般由葡聚糖制成。蛋白质溶液加于柱之顶部，任其往下渗漏，小分子蛋白质进人孔内，因而在柱中滞留时间较长，大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出，因此不同大小的蛋白质得以分离（图2-27）。

（六）超速高心 超速离心法（ultracentrifuation）既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。蛋白质在高达50万g（g为gravity，即地心引力）的重力作用下，在溶液中逐渐沉降，直至其浮力（buoyant force）与离心所产生的力相等，此时沉降停止。不同蛋白质其密度与形态各不相同，因此用上述方法可将它们分开。蛋白质在离心场中的行为用沉降系数（sedimentation coefficient，S）表示，系数与蛋白质的密度和形状相关（表2－3）。

dx／dt代表颗粒在离心场中的移动速率，。为离心头的角速度，X是距转动中心的距离，

-13

t为离心时间。沉降系数（S）使用Svedberg单位（1S＝10秒）。

应用超速离心法测定蛋白质分子量时，一般用一个已知分子量的标准蛋白质作为参照，因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，它的计算式如下： 这一算式对多数球状蛋白质都适用，但大多数纤维状蛋白质由于其分子形状的高度不对称性，无法使用上述简单算式。

三、多肽链中氨基酸序列分析

自从1953年Sanger首次完成胰岛素的氨基酸顺序测定以来，目前已有很大改进。当年Sanger花费多年才基本搞清胰岛素的一级结构，现今由于方法学改进及自动化分析仪器的产生，已有数万种蛋白质的氨基酸序列问世。当今的分析原则基本借用Sanger提出的方法，但具体方法已有很大改进。首先分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成、蛋白质经盐酸水解后成为个别氨基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分开，测定它们的量，算出各氨基酸在蛋白质中的百分组成或个数（图2－28）。第二步测定多肽键的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基，即肽链头、尾的氨基酸残基。Sanger当年用二硝基氟苯与多肽链的α一氨基作用生成二硝基苯氨基酸，然后将多肽水解，分离出带有二硝基苯基的氨基酸。目前多用丹酰氯使之生成丹酸衍生物，该物质具强烈荧光，更易鉴别。羧基端氨基酸残基可用羧肽酶将羧基端氨基酸残基水解下来。当鉴定了头、尾两端的氨基酸残基以后，此二头可作为整条肽链的标志点（表2-4）。

第三步是把肽链水解成片段，分别进行分析。方法甚多，常用者有胰蛋白酶法、胰凝乳

蛋白酶法、溴化氰法等。胰蛋白酶能水解赖氨酸或精氨酸的羧基所形成的肽键。所以如果蛋白质分子中有4个精氨酸及赖氨酸残基，则可得5个片段。

胰凝乳蛋白酶水解芳香族氨基酸（苯丙、酪及色氨酸）羧基侧的肽键，溴化睛水解甲硫氨酸羧基侧的肽键。由水解生成的肽段，可用离子层折或其他层析方法将其分离纯化；如用双向纸电泳，可以得到肽图（图2－29），由此明了肽段的多少。

然后测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法。肽段先与异硫氰酸苯酯反应，该试剂只与氨基末端氨基酸的游离α一氨基作用。再用冷稀酸处理，氨基末端残基即自肽链脱落下来，成为异硫氰酸苯酯衍生物，用层析可鉴定为何种氨基酸衍生物。残留的肽链可继续与异硫氰酸苯酯作用。如是逐个鉴定出氨基酸的排列顺序（图2-30）。

如前所述，一条多肽链可被水解成若干片段，图2-29中，已被水解成27个片段。这些肽段经过分离纯化后，即可进行氨基酸顺序测定。但是获得了这些数据之后，还不能得出整条多肽键的氨基酸排列顺序，因为尚不清楚这些片段在多肽链中的前后次序。一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。兹举一个12肽为例以说明之。在实际工作中一个12肽在自动氨基酸顺序仪上就可测出氨基酸序列，不必经过酶解等步骤。经上述3种降解处理，获得8种肽段，根据它们的重复顺序排列，就可以正确地作出12肽的氨基酸排列顺序。 近年来，由于核酸的研究在理论上及技术上的迅猛发展，人们开始通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列。蛋白质中的氨基酸顺序是从信使RNA（mRNA）中核苷酸序列翻译过来的，因此只要找到相应的mRNA测出它的核苷酸顺序，氨基酸序列也就清楚了。此方法先分离编码蛋白质的基因，测定DNA序列，排列出mRNA序列，按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列。目前多数蛋白质的氨基酸序列都是通过此方法而获知的。 四、蛋白质空间结构测定 蛋白质的空间结构十分复杂，因而其测定的难度也较大。目前已知氨基酸序列的蛋白质多达20万个，而测得其空间结构仅8000个左右。通常采用X射线晶体衍射法（X一ray diffraction），首先将蛋白质制备成晶体。迄今为止，并非所有纯化蛋白质都能制备成满意的能供三维结构分析的晶体。例如糖蛋白，由于蛋白质分子中糖基化位点和某些位点的糖链结构存在不均一性，很难获得糖蛋白的晶体。X射线射至蛋白质晶体上，可产生不同方向的衍射，X线片则接受衍射光束，形成衍射图。这种行射图也即X射线穿过晶体的一系列平行剖面所表示的电子密度图。然后借助计算机绘制出三维空间的电子密度图。如一个肌红蛋白的衍射图有 25 000个斑点，通过对这些斑点的位置、强度进行计算，已得出其空间结构。此外，近年建立的二维磁共振技术，也已用于测定蛋白质三维空间结构。 由于蛋白质空间结构的基础是一级结构，近年来根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构，受到科学家的关注。预测蛋白质空间结构的方法主要有两类。第一类方法是采用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。第二类方法是通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。

小结

蛋白质是生物大分子，在体内分布广泛，含量丰富，种类繁多。每一种蛋白质都有其特有的生物学功能。

蛋白质的基本组成单位是α一氨基酸，有20种。氨基酸属于两性电解质，在溶液的pH等于其pI时，氨基酸呈兼性离子。氨基酸可通过肽键相连而成肽。小于10个氨基酸组成的肽称为寡肽，反之则称为多肽。体内存在许多如 GSH、促甲状腺释放激素和神经肽等重要的生物活性肽。

根据蛋白质的形状，可分成球状蛋白质和纤维状蛋白质。根据组成成分，还可分成单纯蛋白质和结合蛋白质，前者仅含有氨基酸，后者除氨基酸外，还含有非蛋白质的辅基成分。复杂的蛋白质结构可分成一级、二级、三级和四级结构四个层次。蛋白质一级结构是指蛋白质分子中氨基酸自N端至C端的排列顺序，即氨基酸序列，其连接键为肽键，还包括二硫键。形成肽键的6个原子处于同一平面，构成了所谓的肽单元。二级、三级和四级结构研究蛋白质的空间构象，分层次阐述蛋白质的三维立体结构。二级结构是指蛋白质主链局部的空间结构，不涉及氨基酸残基侧链构象。主要为α一螺旋、β折叠、β转角和无规卷曲，以氢键维持其稳定性。在蛋白质中，存在二个或三个具有二级结构的肽段所形成的特殊空间构象，

称为模序，发挥着特殊的生物学功能。三级结构是指多肽链主链和侧链的全部原子的空间排布位置。三级结构的形成和稳定主要靠次级键。一些蛋白质的三级结构可形成1个或数个球状或纤维状的区域，各行其功能，称为结构域。四级结构是指蛋白质亚基之间的缔合，也主要靠体级键维系。

体内存在数以千万种蛋白质，各有其特定的结构和特殊的生物学功能。一级结构是空间构象的基础，也是功能的基础。一级结构相似的蛋白质，其空间构象及功能也相近。若蛋白质的一级结构发生改变则影响其正常功能，由此引起的疾病称为分子病。

蛋白质空间构象与功能有着密切关系。血红蛋白亚基与O2结合可引起另一亚基构象变化，使之更易与q结合，所以血红蛋白的氧解离曲线呈S型。这种变构效应是蛋白质中普遍存在的功能调节方式之一。蛋白质的空间构象发生改变，可导致其理化性质变化和生物活性的丧失。蛋白质发生变性后，只要其一级结构未遭破坏，仍可在一定条件下复性，恢复原有的空间构象和功能。

分高纯化蛋白质是研究单个蛋白质结构与功能的先决条件。通常利用蛋白质的理化性质，采取不损伤蛋白质结构和功能的物理方法来纯化蛋白质。

（查锡良）

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