生物物理学-林东海-第五章生物物理技术-7-表面等离子体共振谱

第五章 生物物理技术

§6.6 表面等离子体共振谱SPR

内

容

一、全反射

二、SPR基本原理三、SPR关键技术

四、BIACORE仪器四、BIACORE应用

一、全反射现象入射光由光密介质射入光疏介质时，同时发生反射和折射，折射角大 于入射角，随着入射角的增大，反射光线越来越强，折射光线越来越 弱，当折射角增大到90°时，折射光线完全消失，只剩下反射光线， 这种现象叫做全反射。 N N n sin B 1 2 θ2 光疏介质 n2 sin 1 光疏介质 n2 O O n1 C θ3 θ1 N'光密介质 光密介质

θ3 C

θ1

A

A

N'

折射角θ2 为90°时，发生全反射现象.

空气 1.0003 冰 1.309 水 1.333 丙酮 1.36 酒精 1.39 玻璃 1.50–1.89 聚苯乙稀 1.55 翡翠 1.57 黄玉 1.61 蓝宝石 1.77 : 水晶因而 2.00 钻石 2.417对钠黄光而言 波长589. 3 nm

临界角折射角等于 90 °时的入射角叫做临界角，用符 号C 表示。光从折射率为n2的光密介质射到折射率 为 n1 的光疏介质 时的临界角 αc 就是折射角等于 90°时的入射角，根据折射定律可得：

n1 sin sin 90 n2 sin sin cn2 sin c n1C

N β O α α光疏介质 n2 光密介质 n1

A

N'

当α>αc时， 折射光消失，发射光能量等于入射光能量，称为全发

射。此时，入射光的电磁场仍能渗入光疏介质中， 其强度随渗入深度呈指数衰减，一般约为100-300 nm. 这一衰减的电磁波称为衰减波(evanescent wave)。

如果光疏介质中界面处有一金属薄层，衰减波将引起金属中自由电子振荡，产生一沿表面运动的等离子体矢量。若入射光是单色 p- 偏振光(即与界面平行),那么在某一入射角会与该矢量发生 共振。能量将从入射光子传递到等离子体，反射光消失。这种现 象称为表面等离子体共振，该反射光消失的角度称为SPR角。

衰减波电磁场受其渗入介质折射率的影响，因此金属薄层及其另一表面液体折射率的变化将导致等离子体矢量的变化， 从而改变 SPR角大小。

二、SPR的基本原理SPR是一种物理光学现象。当一 束p-偏振光在一定的角度范围内入射 到棱镜中，在棱镜与金属(Au或者Ag )的界面将发生反射和折射。 当入射光的频率与金属膜内表面 自由电子(称为等离子体)振荡频率 相匹配时，光线被耦合进入金属膜， 引起电子发生共振(表面等离子体共 振)。 入射光被金属表面电子吸收 , 使反 射光能量急剧下降。

Surface Plasmon Resonance

用SPR传感器测量样品折射率四种调制方式：角度调制，波长调制，相位调制，强度调制 商用仪器多数采用角度调制的方法 采用角度调制测量时，入射光波长固定，反射光强度是入射角的函数，其 中反射光强度最低时所对应的入

射角称为共振角(SPR角)。

SPR对附着在金属薄膜表面的介质折射率非常敏感 ,当表面介质的属性改变或者附着量改变时，共振角将发生变化。因此，SPR谱(共振角的变化vs 时间)能够反映与金属膜表面接触的体系的变化。 如果在金属薄膜外侧加上一层待测物质，分析物与金属薄膜的耦联影响了 结构的折射率，从而影响了反射光、衰减波以及等离子体共振。所以，只

要测得SPR谱，就可以得到样品折射率。

用SPR生物传感器(Biocore)研究生物分子相互作用 SPR 谱随金属表面折射率变化而变化，而折射率变化又与结合在金属表面的生物分子质量成正比，因而可通过生物反应过程中 SPR谱的动态变化获取生物分子相互作用的特异性信号。 能在不需使用荧光或同位素标记甚至无须纯化各种生物组分的天 然条件下，通过传感器芯片实时监测各类生物分子如多肽、蛋白

质、寡核苷酸、寡聚糖、类脂甚至全病毒、细胞之间相互作用的整个过程，并通过分析软件获取生物分子结合/解离、亲和性/ 特异性、协同/拮抗、反应速率/浓度变化等互作动力学参数。

Biocore 原理

当进行分子间相互作用分析时, 将其中一个反应物偶联在传感片上, 含有另一个反 应物(分析物)样品通过蠕动泵以恒定的流速通过传感片表面, 分子间有结合反应 而导致传感片表面分子浓度的变化，引起SPR 角的改变。

共振角单位规定为RU(共振单位),1RU=10-4度，测量经验表明，当有1ng/mm2的蛋 白质连接到表面时，约导致共振角增大1000RU。以时间对RU连续作图, 得到的传感图记录了整个反应过程包括结合和解离过程。

当一轮反应结束后, 结合在传感片上的反应物可以用洗脱液洗脱, 从而使传感片得 到再生进行下一轮反应。

Biocore 主要组成部分

SPR实验数据处理

Association equilibrium constant Ka = [AB]/([A][B]) = ka/kd Dissociation equilibrium constant

Kd = 1/Ka在SPR实验中，需要在其他条件相同的情况下设计一系列分析物 浓度进行结合反应，在得到传感曲线后，在评估软件中选用1:1 Langmuir 结合模型，设置加样起始点、终点和结合拟合区、解离

拟合区，软件会据此计算出各种动力学参数。

三、SPR的关键技术

监测器检测 相互作用

先固定相互作用的一种分子到 传感芯片表面

另一种分子通过溶液传送系统被 送到传感芯片表面

9种不同的传感芯片表面适合不同的应用CM5: 羧基化的葡聚糖SA: 连有链酶抗生物素的葡聚糖

NTA: 连有 NTA的葡聚糖HPA: 疏水表面 CM4: 带负电荷较低的葡聚糖 C1: 羧基表面 – 没有葡聚糖

CM3: 短链葡聚糖 Au: L1: 裸金表面 带有亲脂物质的葡聚糖

传感芯片

最常用

的传感芯片 CM5

羧基化的葡聚糖

可重复使用的羧基化葡聚糖表面

金膜

玻璃

通过羧基与蛋白质的氨基、巯基或醛基的共价反应将蛋白质固定在芯片表 面的。其结构为玻璃支持板上镀一层金膜，在金膜上连有 100nM 长的葡聚 糖。整个芯片与载玻片的大小和形状一样，芯片的有效面积为1平方厘米。

SPR技术的特点 可实时检测传感器表面生物分子之间结合或离解反应的整个过程， 进而获得有关分子结构变化和化学键合的信息，计算反应的动力学， 确定反应物的种类、浓度和质量，

能得到各种分子类型结合反应的结合速率常数Ka和解离数率常数Kd,特别容易研究结合得很弱或很快的反应 毋须荧光或同位素标记

不用对待测样品作任何标记和修饰，直接准确计算亲和力和动力学常数保持样品的天然特征 极大地节省了时间和劳力

抗干扰性强直接检测有色的或不透明的样品而不影响灵敏度和准确性 直接检测血清、细胞裂解液、组织匀浆等混合物

SPR分析的基本步骤

典型的感应图

加入的分析物与结合在传感片上的配体反应导致信号上升，记录复 合物的结合过程和平衡状态。 当样品加完后分析物被缓冲液代替, 此时信号下降显示了解离过程。 从结合量可反映出样品的浓度。

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