农药毒理学实验指导

昆虫乙酰胆碱酯酶活性的测定

一、实验目的：

了解乙酰胆碱酯酶的作用，掌握乙酰胆碱酯酶活性的测定方法。 二、实验材料

试剂:0.05mo1/L, pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS) ; ATCh液;称取ATCh75mg加pH7.2PBS 100m1即成。DTNB液:称取DTNB13mg加pH7. 2PB S 1 OOml即成。本试验选用残杀威杀虫剂作为抑制剂，在测试前按不同比例用乙醇充分溶解。 三、实验步骤

1、

样品制备:采用本所饲养的淡色库蚊Culex pipiens pallens

Coquillett敏感品系蚊虫和室内选育的抗残杀威品系淡色库蚊作酶源。将N龄幼虫或刚羽化3-4天未吸血雌性成蚊，放人1. 5m1离心管中，加100[1 pH7.2PBS碾碎混匀，10000r/min离心15min，取上清液再加900pl pH7.2PBS稀释，待用。 2、

实验方法:将100协1蚊虫混匀液，滴人%孔微滴定板孔中，

每孔再加混有1 x 10-4mol/L的残杀威ATCh液1 OOmhZ,，放30 C孵育30分钟后，每孔再加100ul DTNB液，待反应5分钟后，用酶标仪(北京新技术研究所提供MB- III型)进行比色。 四、结果分析

在410mu波长下读取光密度。每只蚊虫可测4-10孔取其OD平均值。

昆虫中肠淀粉酶活性测定

一、实验目的：

了解中肠淀粉酶的作用，掌握中肠淀粉酶活性的测定方法。 二、实验方法 1、 肠液的提取：

电刺激法取肠液,10Ｋ离心5ｍｉｎ,上清液为酶液,用0 85%生理盐水稀释5倍备用。 2：测定步骤：

α 淀粉酶及(α+β) 淀粉酶的活性测定每个重复区用5个试管,同时做等量对照试管,每个试管加酶液1ｍＬ,在70℃恒温水浴中加热15ｍｉｎ,取出后迅速用自来水冷却。各管加入1ｍＬｐＨ5.6柠檬酸缓冲液,对照管加4ｍＬ0 4ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ,纯化酶的活性。将对照与测试管置于40℃(±0 5℃)恒温水浴中保温15ｍｉｎ,各管加入40℃左右预热的淀粉液2ｍＬ,摇匀,立即放入40℃水浴中保温5ｍｉｎ,取出后迅速加入4ｍＬ0 4ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ,终止酶反应。 三、结果分析

在410mu波长下读取光密度。取其OD平均值。

昆虫中肠酯酶活性的测定

一、实验目的：

了解中肠酯酶的作用，掌握中肠酯酶活性的测定方法。 二、实验材料

供试物质与供试昆虫β 谷甾醇,含量95%;瑞香亭,含量95%;狼毒色原酮,含量95%。 三、实验方法

处理昆虫时,用β-谷甾醇等3种化合物(200μｇ ｍＬ)和印楝素(80μｇ ｍＬ)处理叶碟后连续饲喂菜粉蝶5龄幼虫,72ｈ后取样。每处理取中肠10条,放入玻璃匀浆器中,加1ｍＬ磷酸盐缓冲液(0 04μｍｏｌ ｍＬ,ｐＨ=7),在冰浴中匀浆,将匀浆液倒入离心管中离心(2100Ｇ,15ｍｉｎ)后取上清液用缓冲液稀释10倍作为酶液。用“Ｆｏｌｉｎ-酚”法测定酶液母液中蛋白质含量,即1ｍＬ酶液母液+5ｍＬＦｏｌｉｎ-甲液+0 5ｍＬＦｏｌｉｎ-乙液+1ｍＬ双蒸水,然后在30℃下反应30ｍｉｎ后,求出ＯＤ500值,从标准曲线上求出1ｍＬ酶液中蛋白质的量(ｍｇ),最后换算成ｍｇ蛋白质/ｍｉｎ水解α-醋酸萘酯的μｍｏｌ数作为酶活力指标。在具塞试管内加入5ｍＬ底物溶液(3×10-4μｍｏｌ ｍＬα-醋酸萘酯)置于25℃下平衡25ｍｉｎ, 加入酶液1ｍＬ,置25℃下温育30ｍｉｎ,立即加入1ｍＬ显色剂(1%固定兰盐Ｂ溶液和25%十二烷基硫酸钠溶液2∶5混合)摇匀,中止反应并显色,30ｍｉｎ后测

定ＯＤ600值。

四、结果分析

从标准曲线上求出α-萘酚的浓度。

昆虫谷胱甘肽过氧化物酶活力测定

一、实验目的：

了解中肠谷胱甘肽过氧化物酶的作用，掌握中肠酯谷胱甘肽过氧化物酶活性的测定方法。 二、实验材料

黑腹果蝇(dro soph ila melanogaster) , 野生型O r。将15天龄未交配果蝇随机分成4组, 每组1 000只, 雌雄各半, 分别给予含亚硒酸钠0、015、210和810Lg? g 的培养基,雌雄分开喂养。 三、实验方法

1、 前处理

各实验组雌雄果蝇给予不同浓度亚硒酸钠喂养16天后分别麻醉, 加入冷生理盐水, 在冰浴中制成7% 匀浆(每组雌雄果蝇匀浆一式5份) , 3 500r?m in 低温离心10 m in。 2、 测定

取上清液测定GSH2Px 活力(DTNB 比色法) 四、结果分析

在410mu波长下读取光密度。取其OD平均值。

农药毒理学实验指导

植物保护系化保教研室

2004.5

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