结核分支杆菌耐链霉素分子机制的研究进展

结核分枝杆菌耐药机制

微生物学免疫学进展1998年第26卷第3期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　81

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(收稿　1997-12-19　　修回　1998-04-15)

结核分支杆菌耐链霉素分子机制的研究进展

吴雪琼　综述　王秉瑞　审校

(解放军三○九医院结核病研究室,北京　100091)

摘　要　链霉素(Streptomycin,SM)是一线抗结核药物,本文概要地介绍了结核分支杆菌耐链霉素的分子机制。最近的研究认为大多数结核分支杆菌分离株耐SM是由于核糖体蛋白S12编码基因(rpsL)和(或)16SrRNA编码基因(rrs)突变所致,少数菌株的耐药机制尚需进一步研究。

分类号　R378.911　　结核病一直是世界上较严重的传染病,由于有效的抗结核药物屈指可数,结核分支杆菌耐药使结核病的治疗更是雪上加霜。1992年美国发生了几起耐多药结核病的爆发流行〔1〕。1990年第三次全国结核病流行调查结果表明,我国的结核病疫情和耐药情况都相当严重,患病人数已由1985年的570万上升至1990年的593万,初始耐药率为28.1%,继发耐药率为41.1%〔2〕。耐多药结核分支杆菌大多对一线抗结核药物耐药,而传统的结核菌药敏试验需1至2个月时间,这必然延误耐药结核病人的诊治和管理。因此,对结核分支杆菌耐药机制、耐药性检定和防治等方面的研究已成为我们结核病防治工作者的一项重要课题。

SM是1945年发明的一种氨基环醇糖苷类抗生素,是第一种有效的抗结核药物,目前仍是结核病治疗的一线药物。在抗结核药物中,其耐药发生率高居榜首。1993年以来国内外陆续报道一些关于结核分支杆菌耐SM分子机制的研究结果,本文将对其进展情况作概要的介绍。

SM主要作用于结核分支杆菌的核糖体,诱导遗传密码的错读,抑制mRNA转译的开始,干扰转译过程中的校对,从而抑制蛋白质合成〔3〕。但结核分支杆菌SM的耐药机制尚未完全搞清楚,最近的研究认为大多白编因(rpsL)和(或)16SrRNA编码基因(rrs)突变所致。

核糖体蛋白S12的正常作用可能是维持读码过程中的一些轻微的不准确性,而突变的S12蛋白却严格要求核糖体只使用与每一密码对应的氨酰-tRNA,从而更准确地表达mRNA上的每一个密码,抑制了SM诱导的遗传密码错读而产生耐药性〔4,5〕。

16SrRNA的530环是整个16SrRNA上最保守的序列,它参与A-位tRNA核糖体的译码过程,在RNA转译中起重要作用。它的这种作用与530区域发夹环上的514～516位的碱基和毗邻510区域凸出环上的495～497位的碱基配对所产生的假结结构有关。Finken等〔4〕发现结核分支杆菌SM敏感株16SrRNA495～497位的碱基序列为5’-GGC,514～516位为5’-GCC,该结构位于RNA的重要功能区,是许多功能的辅助信号,如内含子的自动连接、mRNA表达的自动调节、移码译读和终止密码的阅读通过等。化学保护试验表明核糖体蛋白S12保护530干和环上的特异碱基,并使假结结构稳定。若S12蛋白突变,假结结构改变,在碱基514/497和515/496之间产生G-U变偶配对即会产生SM耐药。

根据国外文献报道〔4,6～

10〕

的资料统计,77株结核分

支杆菌SM敏感株在上述两上基因部位均未发现突变;而107株耐药分离株(单耐40株,多耐67株)中78.5%(,1。

结核分枝杆菌耐药机制

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由此可见,rpsL的突变率高于rrs突变,而且其第43位密码子突变的发生率最高。结核分支杆菌SM敏感株在43位是赖氨酸密码子(AAG),有限制性内切酶MboⅡ的识别序列[GAAGGA(8/7)],该位点若发生突变,酶切位点即消失,可通过PCR-RFLP方法检测这特异位点的突变;rrs突变常发生于905位和513位核苷酸,513位A→C点突变在大肠杆菌通过基因工程技术已被证明可导致SM耐药性产生。大肠杆菌已明确的SM耐药点突变位点有13位的U→A/C(相当于结核分支杆菌15位)、507位的C→U(结核分支杆菌497位)、532位的→C(结核分支杆菌513位)、525位的C→U(结核分支A

杆菌515位)、912位的C→U(结核分支杆菌904位)、913

位的A→G(结核分支杆菌905位)、914位的A→U/G(结核分支杆菌906位)和915位的A→G(结核分支杆菌907位)。491位和522位点突变虽未明确证明可产生SM耐药性,但二级结构分析显示491位是一个高度保守的干结构,而522位是一个高度保守的rRNA位点,它们的二级和三级结构距已发现的可产生SM耐药性的突变区域很近,因此491位或512位的C→T突变使C-G

对转变成T-G波动对,导致局部几何形状变形,可能影响了已知的耐药突变基因导致耐药性产生。SM是与结核分支杆菌905位碱基周围的区域结合的,并保护该区域免受烷化剂和核酸酶的作用。该区域若发生突变就会破坏SM的结合和SM诱导的错读。

表1　结核分支杆菌Sm耐药株基因突变情况

耐药株数107株　107

rpsL突变数(发生率%)、类型第43位氨基酸42(39.3)Lys→Arg1(0.9)Lys→Thr

52(48.6)

第88位氨基酸9(8.4)Lys→Arg

491位核苷酸3(2.8)C→T

512位

rrs突变数(发生率%)、类型

513位

516位

904位1(0.9)C→G1(0.9)C→A

1(0.9)23(21.5)

905位

双重突变

无突变　

1(0.9)C→T10(9.3)A→C3(2.8)C→T

1(0.9)A→T31(29)

11(10.3)A→G1(0.9)23(21.5)

Meier等〔7〕仅在一株结核分支杆菌SM耐药株中发现有双重突变,这两个突变rpsL88位Ays→Gln和rrs905位(相当大肠杆菌的913位)的A→G均已报道可导致大肠杆菌耐SM,这可能是由于16SrRNA905位突变只产生了部分耐SM,从而在S12基因上发生第二次突变来抵抗SM诱导的错读使菌细胞数量增多。鉴于

结核分支杆菌只有一个单一的rRNA操纵子,因此,证明这种解释的最好方法是通过分子生物学技术将结核分支杆菌突变的rrnB操纵子替代野生型16SrRNA基因,遗憾的是到目前为止这种同源重组未取得成功。

资料表明PCR-SSCP分析是一种快速监测结核分支杆菌SM敏感性的有效方法,但与检测耐RFP分离株不同,它需要进行几次PCR-SSCP分析来检测耐SM的突变位点。值得注意的是21.5%的结核分支杆菌耐SM分离株有正常的16SrRNA和S12蛋白,却仍显示对SM耐药,这提示存在其它耐药机制。某些细菌耐SM是由于氨基苷修饰酶的产生,其基因是来源于质粒或可转座成分,但结核分支杆菌任何分离株均未发现转座子和质粒,这种耐药机制似乎是不可能的。也许和鸟分支杆菌的耐SM机制相似,是细胞壁渗透性改变所致;但HonoreN.和ColeS.T.

〔8〕

其它成分可能有改变;当然也不能完全排除菌株获得了编码氨基糖苷修饰的基因的可能性,这需进一步研究证明。

此外,某些细菌对SM产生依赖性是与某些耐药

突变株核糖体有关的另一种表型。1955,Hashimoto从结核分支杆菌H2实验株中分离了一株SM依赖突变株18b,近40年来反复实验发现该株已产生SM依赖性,它不能在含<50μg/ml的SM罗氏培养基中生长。Honore等〔11〕的研究发现SM依赖株的rpsL为野生型的,而rrs基因存在突变,主要是512、513和516位的碱基插入。实验结果表明这些位置的碱基若有突变,就会产生高水平的耐药结果。16SrRNA512位以后的碱基插入可能是使530环产生一个凸出部分,而中断了30S核糖体亚单位内的不同成分之间的相互作用。

总之,通过PCR-SSCP、PCR-RFLP和PCR-直接测序法〔12〕分析结核分支杆菌rpsL和rrs基因可检测大多数结核分支杆菌耐SM基因型,少数结核分支杆菌耐SM分子机制仍需进一步深入研究以彻底了解清楚。

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支杆菌核糖体亚单位改变的菌株的MIC都较高(>160ug/ml),而无rpsL和rrs突变的SM耐药株的抗生素M(,

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