多糖衍生物用于蛋白质复性及天然胶乳改性的研究

中山大学 博士后学位论文

多糖衍生物用于蛋白质复性及天然胶乳改性的研究 姓名：陈继平

申请学位级别：博士后 专业：高分子化学与物理 指导教师：张黎明

摘 要 环糊精和温敏聚合物聚Ⅲ．异丙基丙烯酰胺）（ＰＮＩＰＡ）对蛋白质的复性均有良 好的促进作用，那么经ＰＮＩＰＡ改性后的环糊精衍生物能否更有效促进变性蛋白 质的复性呢？为此，我们将氨基．１３．环糊精（ＥＤＡ．１３一ＣＤ）和带末端羧基的聚Ｎ一 异丙基丙烯酰胺（ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ）偶联得到了一种温敏Ｂ一环糊精衍生物 （１３．ＣＤ．ＰＮｍＡ），分别考察其在不同变性体系、不同１３－ＣＤ。ＰＮＩＰＡ浓度、不同复性 温度以及在表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）存在下对溶菌酶的复性 效果；通过与ＥＤＡ．１３．ＣＤ和ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ的对比分析，揭示了１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ分 子中的环糊精空腔与ＰＮＩＰＡ链段的协同作用，并使用荧光光谱法进行了验证。 实验结果表明：ｐ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ对盐酸胍变性溶菌酶的复性具有抑制作用，但对尿 素变性溶菌酶的复性具有促进作用；在常温下，０．４ｍｇ／ｍＬ的ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ可使ｌ ｍｇ／ｍＬ溶菌酶的复性率增加至８３．７％，而直接稀释法仅为５５．８％；１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ 对溶菌酶的复性温度应略小于１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的相转变温度（ＬＣＳＴ，３３．６。Ｃ）， 高于这一温度时会由于ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ发生相变而导致溶菌酶的复性率急剧降低； 将１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ在ＣＴＡＢ辅助溶菌酶复性一段时间（如１２ｈ）后再加入到复性体 系，溶菌酶的复性效果更佳。在辅助溶菌酶复性的过程中，１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ分子中 的环糊精空腔与ＰＮＩＰＡ链段可以同时促进溶菌酶的复性，荧光光谱实验结果证实了这～结论。 针对天然乳胶（ＮＲＬ）ＩｔｉｌＪ品蛋白质过敏及乳胶制品的生物降解问题，考察了海 藻酸钠、透明质酸及羧甲基纤维素的氧化产物氧化海藻

酸钠（ＯＳＡ）、氧化透明 质酸（ＯＨＡ）和氧化羧甲基纤维素（ＯＣＭＣ）对天然胶乳中的蛋白质的固定作 用，对比了这三种氧化多糖对乳胶蛋白质的固定效果，分析了加入氧化多糖后蛋 白质在乳胶膜中的分布情况，讨论了氧化多糖含量以及氧化多糖分子中的醛基含 量对乳胶膜的力学性能、热降解及生物降解过程的影响。实验结果显示，三种氧 化多糖对天然乳胶中蛋白质都具有很好的固定作用；以ＯＳＡ为研究对象表明，乳 胶膜中ＯＳＡ含量越多，乳胶膜中水溶性蛋白质（ＷＳＰ）析出率越低，当ＯＳＡ占干 乳胶的１．６７ ｗｔ％时，乳胶膜ＷＳＰ的溶出率即趋近于０；ＯＳＡ中醛基含量越多，ＷＳＰ 溶出率越低，当ＯＳＡ醛基含量为４．８ ｍｍｏｌ／ｇ时，仅用０．３３ ｗｔ％（以固含量计）的 ＯＳＡｔｉＰ可使乳胶膜中形孓晰出率低于５０｝ｌ眈。未加ＯＳＡ的乳胶膜在土埋２５天后的质量损失率为５叭％左右，之后质量不再发生明显改变；而含有ＯＳＡ的乳胶膜在 土埋２５天后质量继续下降，其质量损失率超过乳胶中非橡胶成份所占的百分率， 且ＯＳＡ用量越大，乳胶膜的质量损失率越大。同时，氧化多糖对乳胶膜的力学性能无明显的影响。 关键词：ｐ一环糊精，聚（Ｎ一异丙基丙烯酰胺），溶菌酶，复性，天然胶乳，多 糖衍生物，蛋白质固定，降解

第一章 温敏ｐ．环糊精衍生物用于蛋白质复性的研究 １．１引言

由于环糊精分子中含有疏水性空腔，客体分子能从宽口端进入其分子空腔形 成包络化合物。因此在使用表面活性剂辅助蛋白质复性时，常常需要加入环糊精 以剥离与蛋白质形成胶束的表面活性剂或去污剂【１?３１。Ｋａｎｌｐｐｉａｈ等人【４１发现，向 盐酸胍变性的碳酸脱水酶（ＣＡＢ）复性稀释液中加入适量ｐ一环糊精（Ｄ．ＣＤ）可使其复 性率超过９０％。他们认为这是由于环糊精的疏水性空腔与蛋白质复性中间体的疏 水性位点发生了相互作用。 聚烈．异丙基丙烯酰胺）（ＰＮＩＰＡ）是一种具有温度敏感性的聚合物，在一定温 度下能发生亲水／疏水（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｅ—ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）ｎ－Ｉ逆转变，在水溶液中表现为一 种可逆的溶解／沉淀行为【５１（在凝胶中则表现为一种可逆的溶胀／收缩行为【６】）。发生这一转变时的温度即为

相转变温度（Ｌｏｗｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ＬＣＳＴ），而ＰＮＩＰＡ水溶液的ＬＣＳＴ在３２℃附近〔７，８Ｊ。ＰＮＩＰＡ曾被用于蛋白质的复性 研究【９－１¨。如Ｌｉｎ等人【１０ｌ将ＰＮＩＰＡ用于辅助ｐ．１ａｃｔａｍａｓｅ的复性，发现其复性效率比ＰＥＧ更高，使用ＰＮＩＰＡ可使经盐酸胍变性的１３一ｌａｃｔａｍａｓｅ的活性率提高４ｌ％，而 ＰＥＧ只能提高２６％。Ｌｕ等人【１１】曾采用ＳＤＳ－－ＰＡＧＥ，圆二色谱和荧光光谱等方法研 究了ＰＮＩＰＡ对尿素变性溶菌酶的复性机理，认为ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性作用是因 为ＰＮＩＰＡ增强了蛋白质的二级结构并抑制了溶菌酶的聚集作用，从而促进蛋白质的复性。 将６．ＣＤ与ＰＮＩＰＡ耦联，制备具有温度敏感的１３一环糊精衍生物（１３一ＣＤ．ＰＮＩＰＡ） 主要被用于药物释放系统的研究?协１６１。虽然Ｌｕ等人四曾将该体系用于溶菌酶的复性，但偶联产物中的Ｂ．ＣＤ结构单元主要用于剥离表面活性剂ＣＴＡＢ，而未考察其对溶菌酶的复性作用。结合Ｋａｒｕｐｐｉａｈ等人１４】的研究，我们认为，ｐ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ 用于辅助蛋白质复性时，其分子中ＰＮＩＰＡ链段及环糊精的疏水性空腔应当可以同 时促进溶菌酶的复性，即具有协同辅助蛋白质复性的作用。 为验证这一假设，本研究采用端基耦联的方法，合成了具有温度敏感的Ｂ—ＣＤ 衍生物（１３．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ），比较研究了ｐ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ及其合成中间产物：氨基一ｐ一环糊 精（ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ）、带末端羧基的聚（Ｎ一异丙基丙烯酰胺）（ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ）对尿 素变性溶菌酶的复性效果，并采用荧光光谱分析了ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性 机理；同时探讨Ｔ?ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ与十二烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）结合使用时对溶 菌酶复性的协同作用。

１．２实验部分 １．２．１原料与试剂

Ｎ．异丙基丙烯酰胺（ＮＩＰＡ，Ａｃｒｏｓ公司，美国），正己烷重结晶；巯基丙酸 （ＭＰＡ，Ａｃｒｏｓ公司，美国）；１．（３一二甲氨基丙基）一３．乙基．碳二亚胺（ＥＤＣ，Ａｃｒｏｓ 公司，美国）；偶氮二异丁腈（ＡＩＢＮ，上海试四赫维化工有限公司），甲醇重结晶纯 化；ｐ一环糊精（上海伯奥生物科

技有限公司），使用前于１１０℃干燥１２ ｈ；对甲苯磺 酰氯（中国医药集团上海化学试剂公司）；溶菌酶、盐酸胍、二硫苏糖醇（Ｄ订）、还原型谷胱甘肽（ＧＳＨ）、氧化型谷胱甘肽（ＧＳＳＨ）和微球菌均购自美国Ｓｉｇｍａ公 司。十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）购自日本Ｗａｋｏ公司；其余试剂均为分析纯。透析袋（Ｍｗ ３５００，华美生物工程公司上海分公司）。样品溶液用去离子水配制。

１．２．２ ＥＤＡ－ｐ．ＣＤ的制备与表征

ｇ ＩＢ－ＣＤ和１．３９ 参，照Ｎｏｚａｋｉ等人ｆ１３１的方法，在１００ｎ儿无水吡啶中依次加入１０ 对甲苯磺酰氯，于２５℃、搅拌条件下反应２ｈ。在４０℃减压蒸馏出吡啶后，向反 应混合物中加入２０ｍＬ水。过滤，水洗３次除去吡啶，真空干燥得到白色粉末。将２ ｇ上述制备的白色粉末与２０ ｍＬ无水乙二胺在４０℃反应４８ ｈ。在减压 蒸馏出无水二乙胺后，向油状物中加入３０ ｍＬ丙酮。过滤，将沉淀溶于２０ ｍＬ 甲醇．水溶液（体积比３：１）。往所得溶液中加入２００ ｍＬ丙酮，得白色沉淀。过 滤，真空干燥。产品为白色粉末。用核磁和红外光谱进行表征。

１。２．３ ＰＮＩＰＡ－ＣＯＯＨ的制备与表征ｇ 参照Ｎｏｚａｋｉ等人ｐ３〕的方法，将５ ＮＩＰＡ和２３．４ ｍｇ链转移剂ＭＰＡ溶解于 ２ ６０ ｍＬ甲醇中。通氮气２０ ｍｉｎ，加入５０．７ ｍｇ引发剂ＡＩＢＮ，在氮气保护下，于 ７０”Ｃ、搅拌条件下反应７ ｈ。减压蒸馏出大部分甲醇，用丙酮／正己烷体系纯化两 次。将所得沉淀过滤并真空干燥。产品为白色粉末。用核磁和红外光谱进行表征。

１．２．４ ｐＣＤ．ＰＮＩＰＡ的制备与表征ｇ 参照Ｎｏｚａｋｉ等人〔１３１的方法，将２ ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ溶解于２０ ｍＬ蒸馏水中，ｇ 加入４３５ ｍｇ ＥＤＣ。调整溶液ｐＨ值为５．５，加入２ ＥＤＡ－Ｄ—ＣＤ，在室温下搅拌 反应２４ ｈ。所得溶液装入到透析袋（Ｍｗ３５００），用水透析２４ ｈ以除去未反应的１３－ＣＤ 与小分子物质。溶液冷冻干燥得到一种淡黄色粉末。将所得的淡黄色粉末分散在 ＴＨＦ中，用ＴＨＦ－ｎ．ｈｅｘａｎｅ（体积比２：１）沉淀，真空干燥。所得产品为黄色粉末。 用核磁和红外光

谱进行表征。

１．２．５溶菌酶的变性 参照Ｄｅｓａｉ等人【１８】的方法，将一定量的溶菌酶分别溶于盐酸胍变性缓冲液和 尿素变性缓冲液（盐酸胍变性缓冲液：３０ｍ０１．Ｌ－１Ｏ．１ ｍｍｏｌ?Ｌ．１ ＤＴＴ、６ ｍｏｌ?Ｌ．１盐酸胍和０．１ Ｔｒｉｓ一硫酸，ｐＨ值８．５；尿素变性缓冲液：３０ ｍｍ０１．Ｌ－１ ＤＴＴ、８ ｍｏｌ?Ｌ－１尿素、 ｍｏｌ?Ｌ－１”Ｉｒｉｓ—ＨＣＩ，ｐＨ值８．６和１ｍｍｏｌ?Ｌ－１ ＥＤＴＡ）置于３７。Ｃ下反应３ｈ，使溶菌 酶彻底变性和还原，得到浓度为３０ ｍｇ?ｍｌ。的变性溶菌酶溶液，放置于４。Ｃ冰箱 中保存备用。

１．２．６溶菌酶复性将１ ００ ｌｘＬ浓度为１ ２ ｍｇ／ｍＬ的ＥＤＡ一１３．ＣＤ、ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ或ＩＢ－ＣＤ－ＰＮＩＰＡ 溶液分别缓慢加入到１００ ＩｘＬ浓度为３０ ｍｇ／ｍＬ的溶菌酶中，复性３０ ｍｉｎ后，加 入复性缓冲液至溶液总体积为３ ｍＬ，在室温下（３ ｌ℃）继续复性２４ ｈ。不含任 何辅助剂时溶菌酶的复性为空白样。复性缓冲液为ｐＨ为８．２的Ｏ．１ＥＤＴＡ、ｌ ｍｍｏｌ／Ｌ ｍｏｌ／Ｌ晡ｓ．ＨＣＩ溶液，该溶液还含有ｌ ｍｍｏｌ／Ｌ ＧＳＳＧ和１０ ｍｍｏＩ．Ｌ－１ＧＳＨ。

１．２．７ ｐ－ＣＯ—ＰＮＩＰＡ浓度对溶菌酶复性的影响ｐＬ、１００ 将１０ ｌａＬ和１ ｍＬ浓度为１２ ｍｇ／ｍＬ ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液分别缓慢加入 到１００ ｇＬ浓度为３０ ｍｇ／ｍＬ的盐酸胍变性溶菌酶和尿素变性溶菌酶溶液中。复性 ３ ３０ ２４ ｍｉｎ后，加入复性缓冲液至溶液总体积为３ ｍＬ，在室温下（３１℃）继续复性 ｈ。不含任何辅助剂时溶菌酶的复性为空白样。

１．２．８复性温度对溶菌酶复性的影响 将１００｝ｌＬ浓度为１２ ｍｇ／ｍＬ雕ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液缓慢加入到１００ ｐＬ浓度为３０ ｍｇ／ｍＬ的尿素变性溶菌酶溶液中，然后将溶液在某一个特定温度条件下（２５℃、 ２８”Ｃ、３０”Ｃ、３２”Ｃ、３３。Ｃ或３４”Ｃ）复性３０ ｍｉｎ后，加入复性缓冲液溶液总体积为３ ｍＬ，继续复性２４ｈ。

１．２．９表面活性剂ＣＴＡＢ对溶菌酶复性的影响将１００ ＩｌＬ浓度

为１２ ｒａｇ／ｍＥ的１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液和１００ｌｘＬ Ｏ．０２ ｍｌＶｌ ＣＴＡＢ 溶液按照以下方式加入到１００ ｌｘＬ浓度为３０ ｒａｇ／ｍＥ的尿素变性溶菌酶溶液中：ａ） 仅加入ＣＴＡＢ溶液；ｂ）〔３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液和ＣＴＡＢ溶液同时加入；ｃ）在加入ＣＴＡＢ溶液１２ ｈ后再加入ｐ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ溶液。将这些溶液在室温（３１℃）下放 置２４ ｈ。以不含任何辅助剂时溶菌酶的复性为空白样。

１．２．１０相转变温度（ＬＣＳＴ）的测定 通过测定浓度为ｌ ｒａｇ／ｍＥ的ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ和〔Ｂ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液在５００ ｎｎｌ的 吸光度值确定聚合物的相转变曲线。所用仪器为ＴＵ一１８００ＳＰＣ ＵＶ分光光度计（中 国，北京）。吸光度一浓度曲线拐点的横坐标值即为该聚合物的ＬＣＳＴ平均值。

１．２．１１ 溶菌酶活性的测定 依据Ｊｏｌｌｅｙｔｌ９１提出的以微球菌为底物的方法测定溶菌酶的活性。将微球菌溶于ｐＨ为６．２４的０．１ Ｍ Ｎａ２ＨＰ０４一ＮａＨ２Ｐ０４缓冲液中，使该溶液在４５０ ｎｌｎ的吸光度为 １．３０。将０．５ ｍＬ溶菌酶溶液加入到２．５ ｍＬ底物溶液中，于２５℃混合３０ ｓ，每隔５ｓ 测定一次所得悬浮液在４５０ ｎｎｌ的吸光度，共测定１３次。所得吸光度与时间的关系 曲线为一直线。将该直线的斜率与同浓度的未变性溶菌酶溶液所得的直线进行对 比，即可得到溶菌酶的复性率，结果用百分比表示【２０１。

１．２．１２ 荧光光谱分析用Ｏ．０５ Ｍ ＰＢＳ缓冲液配制浓度分别为５０ ｒａｇ／ｍＥ、２０ ｍｇ／ｍＬ、１０ ｒａｇ／ｍＥ、５ ｍｇ／ｍＬ汞〕１ ｍｇ／ｍＬＩ拘ＥＤＡ．ＣＤ、ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨＪ阿Ｉ〔Ｂ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液，用黼表示。４ 另用０．０５Ｍ ＰＢＳ缓冲液配制浓度为Ｏ．０５｜ｌ ｍｇ／ｍＬ溶菌酶溶液，用拗表示。将５００ Ｌ黼和２ ｍＬ黼混合，所得溶液用ＲＦ一５３０１ＰＣ荧光分光计（日本）扫描。 设置激发和发射间距为１０ ｎｌｌｌ。在２８０ ａｍ激发蛋白质溶液，记录３００”－－－?４５０ｎｍ范围 内溶液的发射光谱。

１．３结果与讨论

１．３．１ 核磁和红外表征 （ｔ｝－ＣＤ） ｆｒｏｓｙｌ－Ｂ－ＣＤ） （ＥＤＡ—Ｉ？，－ＣＤ） （Ｉ孓－ＣＤ－ＰＮＩＰＡ） 图１．１ １３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的合成路线 一。一Ⅻ１３６０ 、．铺。厂、』一Ｉｒ人让小１０５０ｃ ｖ０８‰ ３５００ ３０００ ２５００ 懈洲黜７２２０００ １５００ １０００ ５００ ４０００ 图１．２ ＥＤＡ．１３．ＣＤ、ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ和Ｄ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的红外谱图 ａＩ ｊ ｂ —，Ｕ． …６ ＩＯ＿Ｏ咚Ｊ”－ＮＨｌ入 二上几 Ｌ…ｂ＼．．Ｌ叫汹、Ｊ－ 八 ４ ３ ２ 一．—√、．，／、、～，＼一 Ｊ＼ ｃ，‖晦、人人≥；人１６ ５ ４ ３ ２ ０ ｐｐｍ（ｆ１）图１．３ ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ、ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ和１３一ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的核磁谱图 〔Ｂ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的合成路线如图１．１所示。首先Ｂ－ＣＤ糖坏上的羟基氢被磺酰 基取代，然后磺酰基被乙二胺的氨基取代生成氨基化的环糊精，最后在水溶液中， 氨基环糊精与带末端羧基的ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ经ＥＤＣ催化缩水偶合得到 ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ。ＥＤＡ．ｐ—ＣＤ、带末端羧基的ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ以及最终产物１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的红外光谱图分别如图１．２ａ、图１．２ｂ和图１．２ｃ所示。在ＩＢ－ＣＤ—ＰＮ口Ａ 红外谱图（图１．２ｃ）中，～１０４３锄－１（ｓ，Ｃ．ＯＨ）峰对应为１３－ＣＤ上的羟基伸缩振动峰。～１６３７ ＣＩＩｌ－１和～１５４４锄＿１峰对应为酰胺Ｉ和酰胺ＩＩ的吸收（来自ＰＮＩＰＡ结 构单元）。～３３００伽．１～３５００ ｃｍ＿是一个很强很宽的谱带，对应为Ｎ．Ｈ、ｏ．Ｈ（包括醇羟基与羧羟基）的总吸收。ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ、ＥＤＡ一８一ＣＤ以及ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的核磁谱图分别如图１．３ａ、图 １．３ｂ和图１．３ｃ所示。在这三种结构中，各氢的化学位移分别为，科．９（７Ｈ，Ｃ（１Ｗ）３．３（５Ｈ，一ＣＨ２ＣＯ—ＥＤＡ－Ｂ—ＣＤ），２．５（Ｉ ＯＨ，?ＣＨ２Ｓ－），１．９６（３７Ｈ，ＣＨＣＯＮＨ一），１．４３（７０Ｈ， 一ＣＨＣＨ２ＣＨ一）?１．０３（７Ｈ，．ＣＨ３）。由图３ｃ看出，１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ既存在ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ 的特征峰，也存在ＥＤＡ—Ｂ—ＣＤ的特征峰。 ６ 通过ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ、ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ以及ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ红外及核磁谱图的对比， 证明ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ的末端羧基已成功与ＥＤＡ—ｐ．ｃＤ的氨基发生酰胺化反应。

１．３．２ ＰＮＩＰＡ－ＣＯＯＨ和弘ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的温敏性质 浓度为０．１ ｍｇ／ｍＬ的ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ和ｐ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ水溶液在５００ ｎｍ处的吸光 度随温度的变化如图１．４所示。随着溶液温度的升高，ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ和 ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ水溶液的吸光度分别在溶液温度在３２．４℃或３３．６”０时急剧升高。根据 前述对ＬＣＳＴ的定义，此温度即对应为ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ和ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的ＬＣＳＴ。 ＰＮＩＰＡ在其ＬＣＳＴ附近会发生可逆的亲水／疏水转变，当溶液温度低于ＬＣＳＴ 时ＰＮＩＰＡ表现为亲水性，ＰＮＩＰＡ依靠氢键作用与水互溶：当溶液温度高于ＬＣＳＴ 时，ＰＮＩＰＡ由亲水性转为疏水性，与水脱离并发生聚集，从而导致溶液的吸光度 增大。图１．４ｃ显示，ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ的ＬＣＳＴ为３２．４”Ｃ，与文献报道接近【７?８】。ＰＮＩＰＡ 与亲水性基团结合以后会导致其ＬＣＳＴ升耐２１１，而氨基改性Ｂ．ＣＤ表现为亲水性，所以Ｂ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的ＬＣＳＴ略高于ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ，为３３．６”Ｃ。 ３．０ ２．５ ∞ Ｕ Ｃ ２．０ 至１．５ Ｌｏ 兰１．０《０．５ Ｏ．０ ２６ ２８ ３０ ３２ ３４ ３６ ３８ ４０ ４２ ４４ ４６ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉ。Ｃ 图１．４ ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ和ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的相转变曲线７

１．３．３肛ＣＤ－－ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性效果

将不同浓度的Ｂ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ分别用于盐酸胍变性溶菌酶和尿素变性溶菌酶的 复性，其活性收率如表１．１所示。从表１．１看出，随着复性体系中Ｂ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ浓度 的增大，盐酸胍变性溶菌酶的活性率逐渐减小，从５５．８％（直接稀释法复性）减 ／Ｊ，至ｌＪ３４．４％（ｔ３．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ浓度为０．８ ｍｇ／ｍＬ）；而尿素变性溶菌酶复性的活性率 则逐渐增大，从５５．８％（直接稀释法复性）增至８３．７％（１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ浓度为０．４ ｍｇ／ｍＬ）。即在盐酸胍变性溶菌酶的复性体系中，〔３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ不仅不能促进溶 菌酶的复性，反而对其复性有抑制作用。而与此相反的是，对于尿素变性溶菌酶 的复性体系，１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性具有较好的促进作用。导致这一实验 现象的原因有待进一步研究，

在后续实验中，为了验证Ｂ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的 复性作用，我们以尿素变性溶菌酶作为研究对象。 表１．１不同浓度的ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ对不同变性体系变性溶菌酶的复性

１．３．４ ＥＤＡ．争ＣＤ、ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ或ＩＶＣＤ．ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性效果 在３ｌ℃，变性溶菌酶（尿素变性溶菌酶，以下同）最终浓度为ｌ ｍｇ／ｍＬ时，将０．４ ｍｇ／ｍＬ的ＥＤＡ．Ｂ—ＣＤ、ＰＮＩＰＡ－ＣＯＯＨ和〔ｊ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液分别用于辅助 溶菌酶复性，其复性效果如图１．５所示。使用ＥＤＡ．Ｂ．ＣＤ辅助溶菌酶复性时，溶 菌酶的活性率为７１％，使用ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ辅助溶菌酶复性时，其活性率为７２．２％， 而使用１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ辅助溶菌酶复性时，其活性率为８３．７％。三者均高于直接稀 释法复性所得的活性率。这说明ＥＤＡ．ｐ—ＣＤ、ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ和１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对 尿素变性溶菌酶的复性均有促进作用，而〔３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的促进作用最大。 作为一种蛋白质的复性辅助剂，环糊精不仅可以抑制蛋白质的聚集作用，同 时还能有效地促进蛋白质折叠复性至其天然状态以恢复其活性瞄粕１。伸展的或部分折叠的中间体疏水性表面与环糊精疏水性空腔之间的相互作用降低了分子间８ 的疏水作用力，从而有效地消除或抑制了蛋白质的聚集作用ｆ２３Ｊ。而ＰＮＩＰＡ则通 过其疏水性链段与蛋白质复性中间体氨基酸的疏水性侧链之间的疏水作用促进 蛋白质的复性【１０１。显然，在本实验中，〔３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ分子中环糊精空腔和ＰＮ口Ａ一 乍 旷 引 乍 ｜｜ Ｉ 疏水性链段的同时对溶菌酶的复性起到了辅助作用。即Ｊ３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ分子中的 Ｉ匿－ＣＤ疏水性空腔和ＰＮＩＰＡ疏水性链段对溶菌酶的复性具有协同作用。 ／ ／ ／ ／ ／ ｌ“ ／／Ｚ／ ；｝ｚ嚣 ｌｌ 象 器 貉 瑟 簟．鼍？绻 爹 蓉? 誓瞄：§Ｌ。－矗矗。 赞黟一 蘑琵一 ｌ 筑 参 雠。 Ｕ ７罗．／

１．３．５争ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性机理 溶菌酶分子中含有能发出内源荧光的色氨酸及酪氨酸。当蛋白质与物质发生 物理碰撞或化学结合以后，蛋白质的荧光会发生一定的变化，这一规律常被用于 研究蛋白质与物质之间的相互作用机理ｌ硎。 图１．６是在变性溶菌酶溶液中加入一定量的ＥＤＡ—ｐｃＤ、ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ或 〔３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ后溶液的荧光光

谱图。由图看出，溶菌酶溶液的荧光光谱曲线的形 状未发生明显变化，但是荧光强度存在一定差异：加入含有Ｂ—ＣＤ结构单元的 ＥＤＡ．Ｂ．ＣＤ和ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ时，随着辅助剂浓度的增加，溶液的荧光强度逐渐降低， 且在辅助剂浓度相同时，加ＡＥＤＡ—Ｂ—ＣＤ后荧光强度降低幅度比Ｂ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ降低 幅度更大（图１．６（ａ，ｃ）；而对于不含１３．ＣＤ结构单元的ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ，即使辅助 剂的浓度高达５０ ｍｇ／ｍＬ时溶液荧光强度的变化仍不明显（图１．６（ｂ））。这表明 ９ 对于溶菌酶而言，ＥＤＡ．ＣＤ和ＩＢ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ是良好的焯灭剂，而ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ不具有荧光ｊ卒灭作用。 ９０ ６０ ３０ ０ ９０ ｃ，） Ｃ ３０ ＃０ Ｌ９０ ６０ ３０ Ｏ ３００ ３２０ ３４０ ３６０ ３８０ ４００ ４２０ ４４０ ａ） Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ图１．６不同浓度的ＥＤＡ—ｐ．ＣＤ、ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ或ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ加入变性溶菌酶溶液 后的荧光光谱图。ａ?ＥＤＡ．ＩＢ－ＣＤ；ｂ，ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ；ｃ，ｐ—ｃＤ—ＰＮＩＰＡ。ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ， ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ和ｐ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的浓度分别为①＝Ｏ；②＝ｌ ｍｇ／ｍＬ；③＝５ ｍｇ／ｍＬ； ④＝ｌ Ｏ ｍｇ／ｍＬ；⑤－２０ ｍｇ／ｍＬ；⑥＝５０ ｍｇ／ｍＬ； 如果溶菌酶被包络在ＥＤＡ．ｐ．ＣＤ或ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的ｐ—ＣＤ的疏水性空腔中，那 么由酪氨酸和色氨酸产生的天然荧光就可能被屏蔽，从而导致溶菌酶荧光强度降 低。特别地，当ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ浓度为５０ｍｇ／ｍＬ时，溶菌酶的荧光强度已接近于０，表 明溶菌酶分子基本上都被包络进１３．ＣＤ的疏水性空腔中。相对于相同浓度的 ＥＤＡ．ｐ．ｃＤ而言，由于ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ中ＰＮＩＰＡ链段的空间位阻效应以及相对较低的１０ １３－ＣＤ浓度，〔Ｂ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ可以包络溶菌酶的数量相对少：Ｊ：ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ，所以其荧 光强度的减弱程度略小于ＥＤＡ．ｐ—ＣＤ。复性体系的荧光光谱法实验证明了ＩＢ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ分子中ｐ．ＣＤ结构单元对溶菌酶分子的包络作用。 １．３．６不同温度时溶菌酶的复性 不同温度下０．４ ｍｇ／ｍＬ的Ｄ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性效果如图１．７所示。从 图中看出，随着温度的升高，溶菌酶的活性率逐渐增大。当温度达到３２℃时，溶 菌酶的活性率最大。但继续升高温度，溶菌酶的活性率反而降低。结合 〔Ｂ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的

相转变温度（见图１．４），发现溶菌酶的活性率最大时的温度与 ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的相转变温度接近。这是因为，当温度达到ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的相转变温 度时，１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ会由亲水性转变为疏水性而发生聚集，从而导致溶菌酶的活 性率急剧下降。因此，在将ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ用于辅助溶菌酶复性时，复性温度应低于Ｂ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的ＬＣＳＴ。 ９０ 邑８０勺７０ ６０ ５０ ４Ｏ ３Ｏ ２Ｏ Ｉ 名 ?一 ｈ １ 《 ∞矗州口一ｏｑ。篮 １Ｏ Ｏ 二《ｉ 鬻隧 ～艮 甏簪： 引 ‰妇ｊ，．ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃） Ｉｎｃｕｂａｔ ｉｏｎ 图１．７不同温度下Ｂ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ辅助溶菌酶复性的复性率（溶菌酶最终浓度为ｌ ｒａｇ／ｍＥ，１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的浓度为Ｏ．４ ｍｇ／ｍＬ）

１．３．７ ｐ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ和ＣＴＡＢ联合辅助溶菌酶复性 将１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ和ＣＴＡＢ按三种不同的添加方式：（１）仅加入ＣＴＡＢ； （２）１３一ＣＤ．ＰＮＩＰＡ和ＣＴＡＢ同时加入；（３）加入ＣＴＡＢ，复性１２ｈ后再加入 ｐ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ，继续复性１２ｈ。溶菌酶的复性率如图１．８所示。 从图１．８看出，〔３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ与ＣＴＡＢ同时加入到变性溶菌酶中进行复性时， 溶菌酶的复性率低于单独使用ＣＴＡＢ或Ｂ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ，而在ＣＴＡＢ复性１２ｈ后再加 入ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ，溶菌酶的复性率高于单独使用ＣＴＡＢ或ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ。 将１３一ＣＤ—ＰＮＩＰＡ与ＣＴＡＢ同时用于辅助溶菌酶复性时，ＣＴＡＢ的疏水链段与溶 菌酶分子竞争进入环糊精的疏水空腔，但由于ＣＴＡＢ的疏水链段的疏水性强于溶 菌酶分子，所以ＣＴＡＢ会优先进入环糊精的空腔内内【２１，这一竞争过程一方面导致部分环糊精的空腔被ＣＴＡＢ占据，使可以容纳溶菌酶的环糊精空腔减少；另一 方面也导致溶液中ＣＴＡＢ的浓度大大降低，从而降低ＣＴＡＢ对溶菌酶的复性率。 所以ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ与ＣＴＡＢ同时用于溶菌酶复性时，其复性效果较单独使用ＣＴＡＢ 和ｐ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ差。而在使用ＣＴＡＢ复性１２ｈ后，溶菌酶的复性过程已基本上完成， 此时再加入Ｂ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ可能使部分未复性的溶菌酶在环糊精的疏水性空腔的疏 水作用下继续复性ｆ４ｌ，从而使最终溶菌酶的复性率高于单独使用ＣＴＡＢ的复性效 果。实验表明，按这种方式（第三种加入方式）对溶菌酶进行复性，

〔Ｂ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ与ＣＴＡＢ具有协同作用。 墓ｊ４Ｄ 甍 葺 名 莲 图１．８采用不同的添加方式１３一ＣＤ．ＰＮＩＰＡ和ＣＴＡＢ对溶菌酶的复性效果。 Ｍｅｔｈｏｄ（１）：仅加入ＣＴＡＢ；ｍｅｔｈｏｄ（２）：ＣＴＡＢ与ｐ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ同时加入复性液；ｍｅｔｈｏｄ（３）：ＣＴＡＢ复性１２ｈ后再加入ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ１２ 当复性完成以后，利用ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ相变功能，通过升高温度可将ＣＴＡＢ从 溶菌酶分子上剥离出去，从而为溶菌酶的后续纯化带来便利。同时，在 Ｄ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ剥离表面活性剂以后（或Ｂ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ单独使用），同样可利用其温 敏相变功能儿实现Ｂ，ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的循环使用（图１．９）。 图１．９ ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的循环使用示意图 １．４本章小结 〔ｊ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ及其合成中间产物ＥＤＡ．Ｄ—ＣＤ和ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ对尿素变性溶菌 酶的复性过程均有促进作用，而Ｄ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对盐酸胍变性溶菌酶的复性过程却 具有抑制作用，不能用于辅助盐酸胍变性溶菌酶的复性。ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ分子中的Ｂ．ＣＤ疏水性空腔及ＰＮＩＰＡ链段可以共同促进溶菌酶的复性，具有协同辅助溶菌 酶复性的作用，荧光光谱的研究结果证实了这一结论。Ｂ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的浓度对溶 菌酶的复性效果有一定的影响，当溶菌酶的最终浓度为１ ｍｇ／ｍＬ时，０．４ｍｇ／ｍＬ 的Ｂ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性效果最好：而复性温度应当控制在其ＬＣＳＴ以下。 １３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ与ＣＴＡＢ结合用于辅助溶菌酶的复性时，最好在ＣＴＡＢ作用一段时间 后（约１２ｈ）再加入复性体系，否则会对溶菌酶的复性产生不利影响。由于 ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ具有温敏相变功能，在复性完成以后，可通过升高体系温度实现 ｆｌ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ（或包络了ＣＴＡＢ的１３．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ）从复性体系中分离，为溶菌酶的后续纯化带来便利。并实现ｐ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的循环使用。

１６ 第二章 氧化多糖衍生物用于天然胶乳改性的研究 ２．１引言

天然橡胶乳液州ＲＬ）是一种生物合成的高聚物水基型胶体体系，以聚顺式一 异戊二烯为主体，并有十几种组分的物质。其主要成分为橡胶烃、水、非胶

物质， 其中非胶物质主要由蛋白质、类脂物、丙酮溶物、水溶物、无机盐等组成。天然 胶乳具有优异的工艺操作及物理性能，其湿凝胶强度高、弹性大、蠕变小等，就 其通用性而言，目前尚无其它材料能替代，仍然是医务工作者隔离病毒及感染性 微生物的最好选择。 上世纪以来，由于人们对预防艾滋病、肝炎等病毒感染的意识增强，导致了 乳胶制品特别是手套和避孕套需求量的急剧上升，但很快人们发现使用乳胶制品 会引发一种过敏症，其最先的症状是荨麻疹，表现为皮肤瘙痒、发炎、起疙瘩、 长水泡等症状，严重时会引起过敏性休克、甚至死亡【ｌ】。最初人们认为是乳胶制 品生产过程中加入的助剂，如秋兰姆、琉基苯并噻唑、氨基甲酸盐等引起的过敏 症，后来对乳胶制品的过敏性进行深入的研究，发现天然胶乳本身含有的水溶性 蛋白质（ＷＳＰ）是引起过敏的主要原因【２１。 鲜胶乳中蛋白质的含量占胶乳重的１－２％ｔ３１，其中约２０％被橡胶粒子所吸附， 是构成粒子保护层的重要物质，约２０％存在于胶乳底层的液体中，共余部分则 溶解于乳清。这些蛋白质是决定橡胶粒子胶体稳定性的主要因素【４，５１。为解决乳 胶制品中水溶性蛋白的过敏性问题，目前主要采取的方法是降低乳胶中的水溶性 蛋白的含量，国际上普遍认为，当乳胶手套中水溶性蛋白质质量分数小于０．０００１ 时，对胶乳过敏的人在皮肤刺激试验中几乎不显示过敏反应，但大多数国家要求其质量分数应小于０．０００５ １６１。 降低天然胶乳中水溶性蛋白质比较成熟的方法有：（１）氯化法ｆ７，８ｊ：利用浓 盐酸与次氯酸钠反应释放出的氯气与ＮＲ发生交联和环化反应，在乳胶表面形成１７ 防止蛋白质迁移的阻断层。同时使蛋白质变性而使其难以溶解。氯化法是降低胶乳手套水溶性蛋白质含量的一种非常有效的方法，也是目前工业上普遍采用的办法。但氯化处理产生的氯化废水会对环境造成污染。（２）沥滤法〔９１：有湿凝胶 沥滤和干胶膜沥滤。湿凝胶沥滤是指在干燥前洗涤附着在模具上的湿凝胶，干胶 膜沥滤是指在胶膜干燥和硫化后洗涤附着在模具上的胶膜。（３）多次离心法【ｌｏ】： 由于胶乳中的非橡胶物质绝大多部分分布在乳清相和小胶粒中，通过反复加水稀 释胶乳和离心浓缩可制成非橡胶物质含量极低的胶乳。（４）酶处理法【Ｉｌ－１４１：利用 蛋白酶分解破坏天然胶乳包括胶粒表面保护层中的蛋白质，将分解出来的蛋白质 转变成水溶性物质，再通过离心分离除去或在沥滤中洗掉，从而大大减少天然胶 乳制品中的含

量。（５）辐射硫化法１１５】：使用＾ｒ射线或电子束对离心浓缩胶乳进行 辐射硫化，稀释后再离心可得到蛋白质含量很低的低蛋白质胶乳。 上述方法虽然可以有效降低天然胶乳中的水溶性蛋白质含量，但一方面操作 复杂，生产成本高，且有的方法还会对环境造成污染；另一方面由于降低蛋白质 含量会影响天然胶乳的稳定性、生胶的干燥速率、降低生胶的抗氧化性能，同时 对乳胶制品的力学性能也有一定的不利影响【Ｉ ６Ｊ。因此，通过降低胶乳中水溶性 蛋白质（ＷＳＰ）含量的方法解决乳胶制品皮肤过敏问题并不是一个最好的选择。 本研究首次提出通过固定蛋白质的方法来解决乳胶制品蛋白质过敏问题。即 在天然胶乳中添加可生物降解的、具有良好生物相容性的氧化多糖（本研究选取 了海藻酸钠、透明质酸和羧甲基纤维素三种多糖），利用氧化多糖分子上的醛基 与蛋白质分子上的氨基的交联，增大蛋白质的分子量，使蛋白质失去水溶性，从 而将蛋白质固定在乳胶膜内。具体的实验内容包括：氧化海藻酸钠、氧化透明质酸和氧化羧甲基纤维素的制备和表征；三种氧化多糖对乳胶蛋白质的固定效果比 较；氧化多糖对乳胶中蛋白质分布的影响；添加氧化多糖后，乳胶膜的热重、力 学性能及生物降解性能的研究等。其中，水溶性蛋白质的析出实验通过改进的 Ｌｏｗｅｒｙ方法进行表征；乳胶膜蛋白质的分布情况通过考马斯亮蓝染色法进行评 价；生物降解性能通过室内土埋法进行考察。 １８

２．２实验部分 ２．２．１原料与试剂

高氨离心浓缩天然胶乳（Ｇｏｌｄ Ｔｈａｉ Ｒｕｂｂｅｒ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｂａｎｇｋｏｋ，Ｔｈａｉｌａｎｄ），其 部分指标见表２．１。海藻酸钠（ＳＡ，ＡＲ．，天津大茂化学试剂厂），福林酚试剂（ＢＲ， 北京鼎国生物技术有限责任公司），脱氧胆酸钠（ＤＯＣ，Ｂ心上海伯奥生物技术 有限公司），三氯乙酸（ＴＣＡ，ＡＫ天津福晨化学试剂厂），磷钨酸（ＰＴＡ，幔国药集团化学试剂有限公司），考马斯亮蓝（Ｒ ２５０，ＢＲ，上海伯奥生物技术有限公 司），盐酸羟胺（ＡＲ天津天新精细化工研发中心），其他试剂均为分析纯，水 为去离子水。 表２．１高氨浓缩天然胶乳的部分指标（厂家提供）

２．２．２氧化多糖的制备及表征

按照Ｇｏｍｅｚ〔１７】所报道的方法制备氧化海藻酸钠（ｏＳＡ）。将海藻酸钠（１０．００曲溶于６００ ｍＬ蒸馏水中，然后在搅拌下加入１００ ｍＬ高碘酸钠，用蒸馏水将溶液 稀释至总体积１ Ｌ。高碘酸钠的加入比例分别为３，５，１０ ｍ０１％。避光反应２４ ｈ后，１９ 加入３．５ ｍＬ ７，－－醇，继续搅拌Ｏ．５ ｈ终止反应。加入３ ｇ氯化钠和ｌ Ｌ乙醇使海 藻酸钠氧化产物沉淀出来。将所得沉淀重新溶于２００ ｍＬ去离子水，用去离子水 透析４８ ｈ以减少最终产品中的ＮａＣｌ含量和高碘酸钠含量。产物冷冻干燥得到一 种白色产品。用ＦＴ－ＩＲ进行表征。 参照上述方法制备和表征氧化透明质酸（ＯＨＡ）和氧化羧甲基纤维素（ＯＣＭＣ）。

２．２．３醛基含量的测定 在多糖的氧化过程中，糖环单元中的Ｃ＿２和ｃ＿３位置的羟基易转变为羰基。 生成的醛基可与盐酸羟胺发生希夫碱反应转变为含氮衍生物（肟）。通过与ＮａＯＨ 溶液的酸碱中和反应可测定在希夫碱反应过程中生成的ＨＣＩ〔１８，１９〕，并通过如下关 系计算醛基含量。相关的反应式（以海藻酸钠为例）和计算公式如下：Ａｌｇｉｎａｔ争－（ＣＨＯ）ｎ＋ｎ Ｈ２Ｎ－一ＯＨ?ＨＣＩ＝Ａｌｇｉｎａｔｅ－－（ＣＨ＝Ｎ－－ＯＨ）ｎ＋ｎｎ Ｈ２０＋ ＨＣｌ ＨＣＩ＋ＮａＯＨ＝ＮａＣｌ＋Ｈ２０ （１） （２） 【伽Ｄ】（肌。ｌ／ｇ）：—０．１ｘ１０—－３Ｗ ｘＶ （３） 其中，【ＣＨＯ〕为待分析的ＯＳＡ中醛基含量，ｍｏｌ／ｇ；ｙ为滴定ＨＣＩ时所消耗的Ｏ．１ ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液的体积，单位ｍＬ；Ｗ为待分析的ＯＳＡ的质量，单位ｇ。用ＡＶＡＴＡＲ一３６０ＦＩ—ＩＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｎｉｃｏｌｅｔ／Ｎｅｘｕｓ ６７０，ＵＳＡ），采用ＫＢｒ压片法ｇｉｎ～。 扫描室温下ＯＳＡ的红外光谱。扫描范围为４０００－４００ ｃｎｌ～，间距为２

２．２．４乳胶膜的制备

将高氨离心浓缩天然胶乳（５０９）与一定量的氧化多糖氨水溶液混合，然后将 混合物加入到直径为１５ ｔｉｎ的培养皿中，在室温下水平放置ｌ天，待胶乳凝固以后于５０”Ｃ干燥４８ ｈ成膜。乳胶膜中氧化多糖含量分别为０．０３３％，０．１６７％，０．３３％ 和１．６７％。 由天然胶乳（５００）与２５ ｗｔ％氨水溶液（１０９）形成的不含氧化多糖的乳胶膜 为空白样。

在成膜过程中乳胶膜朝向培养皿底面的那一面被定义为乳胶膜的底面（ｂｏｔｔｏｍ ｓｉｄｅ），另一面为顶面（ｔｏｐ ｓｉｄｅ）。

２．２．５ 水溶性蛋白质含量及分布

采用改进的Ｌｏｗｒｙ方法【２０１，利用Ｆｏｌｉｎ ｐｈｅｎｏｌ试剂测定乳胶膜中水溶性蛋白 质（ＷＳＰ）含量，并按照以下公式（４）和（５）计算： ＷＳＰ（ｇｇ／ｇ）＝黑Ｆ：—４ｍ—ＬＶｕ，，ｏＨ （４） （５） 这里，ｙ为抽提液（ｐＨ为７．４的０．０２ ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液）的体积，ｍＬ； ｃ是从标准曲线上测得的蛋白质浓度，ｇｇ／ｍＬ；Ｆ为浓缩因子；Ｗ为被抽提的乳 胶膜质量，ｇ；ＶＮａＯＨ为溶解蛋白质沉淀时所用Ｏ．２ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液的体积，ｍＬ。 通过蛋白质染色法考察乳胶膜中蛋白质的分布情况。制备大小为２０ ｍｉｎｘ３０ ｒａｉｎ的膜样，浸入盛有染色液（Ｏ．１９考马斯亮蓝Ｒ２５０，４５０ｍＬ甲醇，１００ｍＬ冰 醋酸，４５０ｍＬ蒸馏水）的培养皿中，置于摇床上每隔３０ ｍｉｎ将乳胶膜样翻转一 次，染色３ ｈ。染色完成后用脱色液（甲醇１００ｍｌ，冰醋酸１００ｍｌ，蒸馏水８００ｍ１） 对乳胶膜样进行脱色，脱色总时间为１２ ｈ，每隔３ ｈ将膜样翻转一次并重新加入新的脱色液。用去离子水冲洗脱色后的乳胶膜样，用滤纸吸干膜样表面的水分， 对染色的乳胶膜样的顶面、底面及侧面拍照。

２．２．６力学性能的测试

根据ＡＳＴＭ Ｄ４１２Ｅ２１１，用ＨｏｕｎｓｆｉｅｌｄＴＨＥ １０Ｋ．Ｓ（ＵＳＡ）自动拉力机测定了 室温下乳胶膜的拉伸强度（弼）和断裂伸长率（％Ｅ）。剪取乳胶膜测试样（１１０ｍｍｘｌ０ ｍｍｘｌ．２ ｍｍ），用夹具夹持固定。夹具的初始间距为７０ ｎｌｌｎ，拉伸速度 为２００ ｍｍ／ｍｉｎ。

２．２．７热降解性能分析

采用ＮｅｔｚｓｃｈＴＧ一２０９型热重分析仪于Ｎ２氛围测量乳胶膜的热失重曲线。测 量范围为５０－５００ ｏＣ，升温速率为１０ ｏＣ／ｍｉｎ，保护气的流量为２０ ｍＬ／ｍｉｎ，载流 气的流量为４０ ｍＬ／ｍｉｎ。测

试前将复合膜于４０ ｏＣ下真空干燥２４ ｈ。

２．２．８室内土埋降解性能分析

根据Ｇｏｈｅｅｎ描述的方法【２２１，通过监测乳胶膜质量的变化分析膜的降解情况。 将氧化海藻酸钠含量不同的乳胶膜（海藻酸钠含量分别为：０，０．１６７ ｗｔ％，０．３３２ｌ ｗｔ％和１．６７叭％）剪成７块实验所需的面积２ｃｒｎ Ｘ３ ｃｍ的条状样片，烘干至 恒重，记录质量州ｏ）。将取来的普通园艺土，仔细去除其中的板结土块、植物残片等杂物，然后用孔径为０．９ｍｍ（２０目）的筛子过筛后放入自制的塑料容器中， 将降解膜片垂直埋入土壤中，并保持土壤疏松及瓶内外空气循环流通，用去离子 水保持潮湿，放置于环境温度和湿度的条件下，定期取出一个样品，将其泡入去 离子水中，沉淀泥浆，洗涤、过滤、烘干、称重，记录质量（ｗｆ）。按下式（６） 计算乳胶膜的质量损失率（％ｗ，，ｆ），绘制降解曲线。 ｗ，，ｆ％：—ＷＯ－－—Ｗｔ×１００％（６） ＷＯ其中，ＷＯ和ｗｆ分别为降解前后乳胶膜样的质量，ｇ；ｔ为土埋的时间，ｄ； Ｍ，为土埋ｔ天后膜的质量损失率。

２．３结果和讨论 ２．３．１氧化多糖的表征

Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ（ｃｍ。）图２．１ ＯＳＡ、ＯＨＡ和ＯＣＭＣ的ＦＴ－ＩＲ光谱。１７３０ ｅｒａＪ处为醛基的伸缩振动峰 表２．２多糖与高碘酸钠按不同的摩尔比（，ｌ多糖／，ｌ Ｎ。１０４分别为３％、５％和１０ ％）氧化得到的氧化多糖的醛基含量 在避光的条件下将氧化多糖溶液用高碘酸钠氧化２４ ｈ，多糖和高碘酸钠按照 不同的氧化比例反应后得到的不同氧化程度的氧化多糖的醛基含量见表２．２。数 据显示，氧化多糖的醛基含量与高碘酸钠的用量成正比。图２．１显示的是按高碘酸钠的加入比例为５ ｍ０１％氧化得到的三种氧化多糖的红外谱图。从红外谱图中 看出，三种氧化多糖红外吸收峰中在１７３０ｃｍ。１处出现了醛基的的伸缩振动峰， 表明多糖已成功被氧化为氧化多糖【２引。

２．３．２氧化多糖乳胶膜中蛋白质的析出率以及乳胶膜力学性能的比较

取一定量醛基含量约为２．３ ｍｍｏｌ／ｇ的ＯＳＡ、ＯＨＡ和ＯＣＭＣ（即按反应时多 糖与高碘酸钠的摩尔比均为５％氧化得到的氧化多糖）与一定量的天然胶乳共混，得到的乳胶膜蛋白质的析出率及乳胶膜的力学性能如表２．３所示。 从表中看出，水溶性蛋白质的析出率按对比样、ＯＳＡ、ＯＨＡ和ＯＣＭＣ的顺 序逐渐减小，表明ＯＳＡ、ＯＨＡ和ＯＣＭＣ对蛋白质的固定效果为ＯＣＭＣ＞ＯＨＡ＞ ＯＳＡ，即ＯＣＭＣ效果最好，且三种氧化多糖均好于对比样；相对于未加氧化多糖 的乳胶膜，添加了氧化多糖的乳胶膜的拉伸强度和断裂伸长率均未发生明显变 化。 以上实验数据表明，本研究所制备的三种氧化多糖都能有效地固定蛋白质。 同时对乳胶膜的力学性能影响不大。但在这三种氧化多糖中，ＯＣＭＣ对蛋白质的 固定效果最好，其次是ＯＨＡ，然后是ＯＳＡ。但由于使用ＯＣＭＣ后，乳胶膜的颜 色泛黄，呈棕黄色，且ＯＣＭＣ含量越高，乳胶膜的颜色越深。而透明质酸的价格 偏高，在工业应用时会增加生产成本。因此，在工业应用时，建议使用ＯＳＡ固定 天然乳胶中的蛋白质。在本研究的后续实验部分我们也以ＯＳＡ为研究对象进行研究。 表２．３不同氧化多糖乳胶膜水溶性蛋白质的析出率及力学性能

２．３．３水溶性蛋白析出率及其在乳胶膜中的分布

用改进的Ｌｏｗｒｙ法测定的不同ＯＳＡ含量的乳胶膜水溶性蛋白质析出情况见图２．２。图２．２（ａ）为固定ＯＳＡ的醛基含量（醛基含量为１．１ ｍｍｏｌ／ｇ），改变ＯＳＡ 用量时水溶性蛋白质的析出率。由图２．２（ａ）看出，ＷＳＰ随着ＯＳＡ含量的增加而 急剧减小，当ＯＳＡ在乳胶膜中的含量为１．６７ ｗｔ％时，ＷＳＰ已下降至２ ｇｇ／ｇ。图 ２．２（ｂ）是在固定ＯＳＡ用量（０．３３叭％）的情况下，将不同醛基含量的ＯＳＡ加入 胶乳后形成的乳胶膜中水溶性蛋白质的析出率。从图中看出，ＷＳＰ随着ＯＳＡ醛 基含量的增大而减小。特别地，当ＯＳＡ的醛基含量为４．８ ｍｍｏＵｇ时，ＷＳＰ减小至１６ ｐ眈，这个数值已低于乳胶蛋白质致敏的最低蛋白质允许含量５０ ｇｇ／ｇ 【２４Ｊ。实验结果表明，ＷＳＰ与乳胶膜中的醛基含量是直接相关的，说明乳胶中的 ＷＳＰ与ＯＳＡ间发生了相互作用。 ２００ １５０ ／?、 、、 ｏ） 功 １ ００ ｉ 、－一， 乱 霎 ５０ Ｏ 一－０．２ｉ０１ ０．０ ０．２ ０．４ ０．６ ０．８ １．０ １．２ １．４ １．６ １．８ ０ＳＡ

用量（％） 图２．２． （ａ）ＯＳＡ（醛基含量为１．１ｍｍｏｌ／曲的用量和（ｂ）ｏＳＡ醛基含量（用量为 ０．３３叭％）与水溶性白质析出量的关系 ＯＳＡ与乳胶的相互作用可用于解释ＯＳＡ的用量所导致的乳胶膜中ＷＳＰ的不 同。海藻酸钠糖环上２，３位上的羟基被高碘酸钠氧化以后，Ｃ．２、Ｃ＿３间的Ｃ．℃ 发生断裂，并形成缩醛或两个醛基，从而生成大量可以反应的活性基团（图２．３， Ｓｔｅｐ．１）。天然胶乳的ｐＨ为１０．５８，在此条件下，乳胶中蛋白质的氨基以自由．ＮＨ２ 的形式存在，有利于与醛基发生希夫碱反应将两个分子交联起来（图２．３，Ｓｔｅｐ．２）。 由于用于制备ＯＳＡ的海藻酸钠是一种分子量约为３１５，４００的天然多糖。因此，乳 胶蛋白质与海藻酸钠交联以后，会因为蛋白质分子量的急剧增大而导致其水溶性 降低，从而抑制蛋白质从乳胶膜中析出。 Ｏ ｍ ｏＨ ＯＨ ＮａＡｌｇ Ｏｘｉｄｉｚｅｄ－ＮａＡｌｇ Ｓｔｅｐ １．Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｌｇｉｎａｔｅ ＯＨ ＯＨ 。ｔ ｏｔ １ ＋ 帅２一焉蓐吐 ①州＠ Ｓｔｅｐ ２．Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆｏｘｉｄｉｚｅｄ－ＮａＡｌｇ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ 图２．３ ＯＳＡ的制备及其与蛋白质的相互作用示意图 通过考马斯亮蓝Ｒ ２５０染色的方法考察了乳胶中蛋白质的分布情况。染色后 的乳胶膜见图２．４，其中蓝色的区域代表蛋白质的分布区域，颜色越深表明蛋白 质的分布越集中。乳胶膜内部蛋白质的分布情况是通过乳胶膜的侧面蛋白质的分 布表征的。如图２．４（ａ）显示，在未含ＯＳＡ的天然乳胶膜中，仅仅只有乳胶膜的上层表面（ｔｏｐ ｓｉｄｅ）为蓝色区域，其他各面均为白色。说明蛋白质仅分布在乳胶 膜的上层表面。这是因为在成膜的过程中，蛋白质会逐渐迁移并聚集到乳胶膜的 表面四。图２ ４（ｂ）显示的是天然乳胶膜与加入占乳胶固含量１ ６７ｗｔ％ＯＳＡ（醛基含量２．３ ｎⅡ∞Ｉ／ｇ）时乳胶膜的染色情况。从图中看出，染色后含有ＯＳＡ的乳胶膜 样的六个面均观察到蓝色，且顶面（ｔｏｐ ｓｉｄｅ）的蓝色比对比样浅得多?说明在 含有ＯＳＡ的乳胶膜中蛋白质是均匀分布的。这是因为通过蛋白质与ＯＳＡ间的交 联反应己经将蛋白质固定在乳胶膜内部，从而阻止了成膜过程中蛋白质的迁移。 —＝！芒＼匝亟匠亘亟ｒ —————————－ｔ?ｏＨｏｒｎ ｓｉｄｅ ａ ＮＲＬｆｉｌｍ ｂｏｔｔｏｍ ｓｉｄｅ— ——ｂｏｔｔｏｍ ｓｉｄｅ ｔｏｐ ｓｉｄ

ｅ ｜协Ｐ蓟ｍＮＲＬ ｆｉｌｍ ＯＳＡ Ｌａｔｅｘ Ｆｉｌｍ ＯＳＡｌ．６７ｗｔ％，醛基含量为２ ３ｍｍｏｌ／曲 ｂ 图２ ４蛋白质在乳胶膜中的分布。ＣｏｎＵ?ｏｌ乳胶膜不舍ＯＳＡ：ＯＳＡ乳胶膜含 ２．３．４ ０ＳＡ含量及醛基含量对乳胶膜力学性能的影响 一零一Ｙ仍ｅＪ ｃ｜＿∞ｃｏｌ 西ｏｃｏ一山 ■①３仂．Ｉｏ仂＾『．０３Ｑ＾了一互卫∞一 ａ Ｏｘｉｄｉｚｅｄ ａｌｇｉｎａｔｅｓ ｃｏｎｔｅｎｔ（％） 一零一Ｙ∞①．ＪＤ＿∞ｃｏＩｌ毋ａｃｏ一山 ■０３价ｉＩ①∞＾Ｉ－①３Ｑ＿了一暑卫∞一 ａｌｄｅｈｙｄｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ ＯＳＡ（ｍｍｏｌ／ｇ） 图２．５ ＯＳＡ（醛基含量为２．３ ｍｍｏｌ／ｇ）的用量（ａ）和ＯＳＡ（ＯＳＡ用量为Ｏ．３３ ｗｌ： ％）醛基含量（ｂ）与乳胶膜力学性能的关系 醛基含量相同而０ＳＡ用量不同的ＯＳＡ－孚Ｌ胶膜的力学性能测试图如图２．５０）所 示。在醛基含量相同的情况下，随着乳胶膜中ＯＳＡ含量的增加，乳胶膜的断裂伸 长率略有降低，拉伸强度略有增大。不同ＯＳＡ含量的乳胶膜的拉伸强度和断裂伸 长率的变化范围为１．２±０．１ＭＰａ和７９０±１０％。如图２．５（ｂ）所示，ＯＳＡ中醛基含 量对于乳胶膜的力学性能的影响与图２．５（ａ）中得到的规律是近似的。不同醛基含量的乳胶膜的拉伸强度和断裂伸长率的变化范围为１．０±０．１ＭＰａ和９５０＿４－１０ ％，即ＯＳＡ的加入未对乳胶膜的力学性能产生明显影响。 ２．３．５乳胶膜的热降解过程分析 Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（。Ｃ）图２．６不同ＯＳＡ含量的乳胶膜的ＴＧ曲线图 不同ＯＳＡ含量的乳胶膜的ＴＧ曲线如图２．６所示。从图中曲线看出，乳胶膜在３６７℃左右发生剧烈热降解。虽然在１００”－－?３６７”Ｃ期间，乳胶膜的质量一直呈下 降的趋势，但在２００～３６７℃范围内（图２．６ ｂ），随氧化海藻酸钠的用量不同，乳胶膜质量下降的程度不同：氧化海藻酸钠的用量越大，乳胶膜质量下降的程度 越大。这是因为在此温度下，海藻酸钠发生了氧化分解，并部分碳化，从而导致 乳胶膜质量的降低【２６】。乳胶膜在４７０”０左右分解完全，总降解率为９５—９８％。 不同ＯＳＡ含量的乳胶膜的ＴＧ如图２．７所示。从乳胶膜的ＤＴＧ曲线）看出， 乳胶膜在２４０。Ｃ时乳胶膜有个质量下降峰（图２．７ ｄ），该峰的强度与海藻酸钠的 用量呈正比关系，表明此时质量的下降与海藻酸钠有关，对应于是海藻酸钠的裂解温度１２６１。 ０ ，ｏ、 Ｃ ．１０ Ｅ 、、 零、

－—一 ．２０ （９ 卜 ｏ．３０ １００ ２００ ３００ ４００ ５００ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ／。Ｃ图２．７不同ＯＳＡ含量的乳胶膜的ＤＴＧ曲线图 ２．３．６乳胶膜的室内土埋降解过程 １Ｏ ＾９６ ８ ６ ４ ｖ瓣水转删峰２ ０ Ｏ ５１Ｏ １５ ２０ ２５ ３０ ３５ 土埋时间（天）图２．８不同用量的ＯＳＡ（醛基含量为１．１ ｍｍｏｌ／ｇ）乳胶膜在３５天内的质量损 失率 通过测量土埋后乳胶膜片的质量损失率评价了乳胶膜在土壤中的降解情况。 占乳胶固含量分别为０，０．１６７ｗｔ％，０．３３ ｗｔ％和１．６７ ｗｅ?，６的ＯＳＡ（醛基含量为１．１ ｍｍｏｌ／ｇ）乳胶膜在土埋３５天内的质量损失率如图２．８所示。从乳胶膜土埋３５天 内的质量损失率看出，随着土埋时间的延长，乳胶膜的质量损失率增大。不同 ＯＳＡ含量的乳胶膜在土埋起始的１５天内质量下降程度没有明显的差别，但１５ 天以后，ＯＳＡ含量越高，乳胶膜的质量损失率越大，显示出了ＯＳＡ含量对乳胶 膜质量损失的影响。至２５天后，未加ＯＳＡ的乳胶膜的质量损失率保持在５％左右，而加入ＯＳＡ的乳胶膜的质量损失率均超过５％，且随着土埋时问的延长， 其质量损失率继续增大。当土埋时间至３５天时，含１．６７ ｗｔ％ＯＳＡ的乳胶膜质量 损失率达到９．４４％，所损失的质量超过天然乳胶中非橡胶物质的固含量（如表２．１ 所示）。 在土埋降解试验中，将膜样从土壤取出时，可观察Ｎ－＊Ｌ胶膜样上有霉菌附着； ３ｌ 将这牡乳胶膜样千操后，霉菌生长的地方颜色变深。不同ＯＳＡ含量的乳胶膜在 ３５犬时的降解效果如２．９（曲所示。ＯＳＡ古量越高，乳胶膜表面孔穴越多，乳胶 膝样颜色越探。即降解过程中膜样上的霉菌越多。含１ ６７％ＯＳＡ的乳胶膜在不 同土埋时『日ｊ的降解效果如图２．９（ｂ）所示。随着土埋时问的延长，乳胶膜片上孔穴 增加，霉萤生长越致密。结合斟２ ８中的不同乳胶膜的质量损臾率可知．乳胶膜 的质量损失是弓霉菌的生长相关的。 『ｌ ｃｏｎｔｒｏｌ羽 ０．１６７％ＯＮ、 Ｌ譬ｐ； ｂ １５ｄａ）? ２０ｄａｙ１ ２５ｄａｙ ３５ｄａ） 图２．９不同用量的ＯＳＡ（醛基含量为ｌ ｍｍｏｌ，ｇ）乳胶膜在３５天内的降解效 粜（ａ）及刖试样在不同时叫的降解效果（ｂ） 依据表２ ｌ所水的乳胶的组成玎知。天然乳胶膜中的非橡胶纽分约为５％ 且它们比橡胶组分更易于发生降解。从土埋３５天后天然乳胶膜的质量损失率接 近５％（图２．８）可知，在土埋过程中发生降解的应为天然

乳胶中的非橡胶成分。对于含有ＯＳＡ的乳胶膜而言，在土埋２５天后它们的质量损失率均超过５％，且 最高可达９．４４％。这说明随着土埋时间的延长，含有ＯＳＡ的乳胶膜中的橡胶成 分也开始发生分解。即ＯＳＡ的加入对于乳胶膜的降解有促进作用。这是因为海 藻酸钠是一种具有良好的生物相容性的天然聚多糖，很容易被微生物所降解〔２３】。 在乳胶膜中加入ＯＳＡ以后，由于ＯＳＡ的存在有利于土壤中微生物的生长及聚集， 这些微生物可能会促进乳胶膜的降解【２５１。由于ＯＳＡ在乳胶膜中分布均匀（见 ２．３．２），因此，随着土埋时间的延长，在ＯＳＡ和乳胶膜逐渐降解过程中会形成大 量孔穴。这会增加乳胶膜降解过程中生长的霉菌与乳胶膜的有效接触，从而促进 含有ＯＳＡ的乳胶膜的降解。

２．４ 本章小结

本研究制备了氧化海藻酸钠、氧化透明质酸及氧化羧甲基纤维素三种多糖衍 生物，考察了它们对乳胶蛋白质的固定效果及对乳胶膜降解性能的影响。研究结 果表明在天然胶乳中添加极少量的这三种天然多糖衍生物即可有效地固定天然 胶乳中的蛋白质，而且对乳胶膜的力学性能没有明显的影响，尤其是氧化羧甲基 纤维素效果最佳。考马斯亮蓝的染色结果表明，氧化海藻酸钠改善了蛋白质在乳 胶膜中的分布，使其分布更为均匀，从而有效地将蛋白质固定在乳胶膜的内部。 同时，ＯＳＡ对乳胶膜的生物降解还具有一定的促进作用，可以在一定程度上促 进乳胶膜的降解。研究结果表明，用氧化多糖固定蛋白质在解决乳胶膜中蛋白质 过敏问题具有非常实际的应用价值。

３５ 第三章 结论

本研究合成了一种温度敏感的Ｂ一环糊精衍生物１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ，探讨了 １３－ＣＤ—ＰＮ口Ａ对变形溶菌酶的复性作用，同时合成了三种天然多糖衍生物氧化海 藻酸钠（ＯＳＡ）、氧化透明质酸（ＯＨＡ）和氧化羧甲基纤维素（ＯＣＭＣ），并探 讨了这三种天然多糖衍生物对天然胶乳中的蛋白质的固定作用及对乳胶膜降解过程的影响。

主要结论如下： （１）〕３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ及其合成中间产物ＥＤＡ．Ｂ．ＣＤ和ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ对尿素变性 溶菌酶的复性过程均有促进

作用，然而Ｄ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对盐酸胍变性溶菌酶的复性 过程却具有抑制作用，不能用于辅助经盐酸胍变性的溶菌酶的复性；１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ 结构单元中的Ｄ．ＣＤ疏水性空腔及ＰＮＩＰＡ链段具有协同作用，荧光光谱的研究结 果证实了这一结论。１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ单独用于辅助尿素变性溶菌酶复性时，其浓度对溶菌酶的复性效果有一定的影响，当溶菌酶的最终浓度为ｌｍｇ／ｍＬ时， ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的浓度控制在０．４ｍｇ／ｍＬ时溶菌酶的复性效果最好；而复性温度应当控制在其ＬＣＳＴ以下。１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ与ＣＴＡＢ联合用于辅助溶菌酶的复性时， ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ应在ＣＴＡＢ作用一段时间后（约１２ｈ）再加入到复性体系；１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ具有的温敏相变功能可实现Ｂ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的循环使用。

（２）在天然胶乳中添加极少量的这三种天然多糖衍生物即可有效地固定天 然胶乳中的蛋白质，而且对乳胶膜的力学性能没有明显的影响。相对于天然乳胶 膜中蛋白质主要分布于乳胶膜的上层表面，添加了氧化海藻酸钠的乳胶膜中蛋白 质的分布更为均匀。氧化海藻酸钠对乳胶膜的生物降解还具有一定的促进作用， 可以在一定程度上促进乳胶膜的降解。研究结果表明，用氧化多糖固定蛋白质在 解决乳胶膜蛋白质过敏问题具有非常实际的应用价值。

附件 一、个人简历陈继平，男，１９６９年５月出生，博士，助理研究员。２００１年毕业于四川师 范大学化学学院，获硕士学位；２００７年毕业于四川大学皮革化学工程系，获博 士学位。２００７年进入中山大学从事博士后研究工作。主要研究方向为天然高分子功能化改性及其在蛋白质复性、乳胶蛋白固定方面的研究。作为主要成员承担 多项国家和省部级课题，申请专利ｌ项，以第一作者发表论文１ｌ篇，其中在Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｌｅａｔｈｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｓｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌｅａｔｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ等国际学术刊物 上发表ＳＣＩ、Ｅｌ、ＩＳＴＰ收录学术论文７篇。 二、在站期间以第一作者发表的论文及专利１．Ｊｉｐｉｎｇ Ｃｈｅｎ，Ｙｉｎｇ Ｇｏｎｇ，Ｑｉｓｏｎｇ Ｌｉｕ，Ｌｉｍｉｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ－

ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ １３－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｉｎ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ．（ｉｎ ｐｒｅｓｓ）２．Ｊｉｐｉｎｇ Ｃｈｅｎ，Ｙｉｎｇ Ｇｏｎｇ，Ｑｉｓｏｎｇ Ｌｉｕ，Ｌｉｍｉｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｔｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｔｅｘ ｆｉｌｍｓ，Ｃａｒｂｏｎｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ．（ｉｎ ｒｅｖｉｅｗ） ３．申请专利一项：一种天然橡胶胶乳蛋白质的固定方法，申请号：２００９１００４１２９１．８ 三、在站期间获得的科研基金及承担的其它课题１．国家自然科学基金委面上项目，天然聚多糖衍生的水凝胶化因子及其性能研 究，２００９，２０１１，３６万，批准号２０８７４１１６，参加２．广东省自然科学基金面上项目，新型凝胶因子的设计制备与功能特性， ２００８．２００９，５万，批准号８１５１０２７５０１０００００４，参加 四、在站期间参加国内外学术会议情况第１４届反应性高分子学术讨论会，广州，２００８．１１．１７－１９ 五、在站期间承担教学和／或工作情况协助导师指导２００８年本科生毕业论文４名。 致 谢 首先，感谢我的合作导师张黎明教授在我博士后工作期间对我工作、生活等 方面给予的极大帮助和关怀。从导师身上我不仅学到了许多新的专业知识，而且 也学到了许多科研方法和做人的道理。在此，谨向张老师致以衷心的感澍！ 同时，感谢本课题组的杨立群老师、李伟老师、易菊珍老师和实验室全体同 仁的帮助与关心，和你们在一起使我在中山大学度过了两年的愉快时光。 最后，感谢国家自然科学基金和广东省自然科学基金对本研究的资助。

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