荧光探针在流式细胞术检测肿瘤中的应用

分子生物学技术

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荧光探针在流式细胞术检测肿瘤中的应用

吴一峰H钱凯先

浙江大学生命科学学院H浙江杭州!’E%%$"(

摘

要C综述了流式细胞术在肿瘤研究过程中荧光探针的开发状况和选择利用@结合使用不同的荧光探针H采用双

色M三色乃至多色标记H流式细胞仪可以通过细胞膜抗原分析M细胞周期和N细胞凋亡分析等手段鉴AO倍体分析M

分型肿瘤细胞H监控肿瘤的发生和治疗过程@通过对不同荧光探针使用上的优势和局限的比较H提出了新一代定M

荧光探针开发方向的建议H以期改善流式细胞术在肿瘤细胞检测中精度和广度上的局限@关键词C流式细胞术P荧光探针P肿瘤中图分类号CQF"P"!R

文献标识码CO

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来的一种对细胞各种参量H如大小M内部结构M蛋白质及表面抗原等进行快速测量并NAOMRAOM

分类收集的技术@随着单克隆抗体技术的发展和荧

EH$5光探针的开发4流式细胞术的应用领域也从细胞H

H*-:23-.959*0>*IB.,5-6:239+B3,5*,5:;.-,/*>./5L.:5*-*0:23,59:5->:*-393oB3>:5-6:*5IB,*83:23B,3D

E膜抗原的分析

与肿瘤研究有关的膜抗原分析有以下几个方面C造血系统肿瘤的分型M癌基因表达产物M多药耐药基因的表达产物M肿瘤相关抗原M激素受体M淋巴细胞亚群以及与癌细胞生物行为有关的因子等@膜抗原的检测需要特异性的单克隆抗体H这些抗体被标上各种荧光探针H带有相应抗原的细胞通过单抗与荧光探针相结合H从而在流式细胞仪上可以测出

生物学基础研究扩大到肿瘤学M免疫学M血液学M药

!H65物学M临床检测等各个方面4流式细胞术测量细@

胞的各种参量必须用荧光探针’即荧光染料(进行标记H所以荧光探针的开发和利用在很大程度上决定流式细胞术的应用范围@

收稿日期C$%%$D%&D$#@

作者简介C吴一峰’男H浙江宁波人H博士生H从事细胞分子生物学方面的研究@E&"FG(HDC*J9@<I.5/-303-65-.>*I

万方数据

联系人C钱凯先H男H教授H博导@DC$%%EJ2@<I.5/K.5K.5L>->>*I

分子生物学技术

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浙江大学学

报%工学版3

第eH

卷

这些膜抗原的表达水平!

细胞外膜抗原的种类很多"仅#$%&’()*+,-.

抗原系列就有4每种肿瘤细355多种!/0..+,+1*02*0-1

胞都会有特异性的抗原表达!这些特异性抗原的检

78测就成为判断鉴定肿瘤细胞的证据6细胞用一种!

荧光染料标记的抗体染色"称为单标记染色!但为了更准确地区分肿瘤细胞"需要同时检测两种或两种以上的抗原!这就要求使用多种不同发射波长的荧光染料分别标记不同抗体"但是由于流式细胞仪中激光发生器成本高"种类相当有限"而且多色分析要求激发波长种类尽量少"以避免对发射波长的干扰"这就要求不同发射波长的荧光染料要有接近的激发波长!

9!9双色分析

流式细胞仪常用的激光光源是氩离子型的"它的有效光谱为:;;1=71:;;<和7<!1<谱线适于激发>异硫氰酸荧光素3%!?@#>?@#是常用的荧光探针"它是酸性染料"以共价键的方式结合到蛋白的带有正电荷的基团上"激发后发射波峰为7471<的明亮的绿色荧光!在选择与>?@#相匹配的荧光探针进行双色标记的问题上"科学家经过了很多尝

A8试"最终选择了藻胆蛋白家族中的藻红蛋白6%BCDE

藻胆蛋白是在光合蓝藻%氰菌3和"3!&-+,D*C,01FG

H8

利用藻胆蛋白红藻中发现的天然荧光色素家族6!标记的优点是I它J藻胆蛋白分子具有许多发色团"的消光系数和量子产额都很高KL斯托克斯位移大"激发光和发射光易被分开K荧光不易淬M易溶于水"灭"对BO可以用双功能交联剂与抗N变化不敏感K

原偶联"不影响抗体活性!P5Q7A5FG的激发峰为:用氩离子激光器:可;;11<"<激光激发藻红蛋白"以得到发射峰为7因此"H71<的较强的橙色荧光!用FG和>?@#对各种抗体或配体进行双标记可以得到较好的效果!

6;8

是人外周血淋巴细胞双色分析图谱"图=图=

为两份分别采自正常人和艾滋病患者的外%3R%32S

周血样品!横坐标显示的是>4抗?@#标记的抗T+(

图9正常人和艾滋病患者的外周血淋巴细胞双色分析

图谱

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9!]三色分析

在可以只用一种激光发生器完成双色分析后"科学家开始用两种激光发射器进行三色流式细胞术!;;1N2,/D等人用激发波长为:<的氩离子激光器激发>同时用A=71?@#和FG标记的抗体"<激光激发别藻蓝蛋白标记的抗体进行三色分析"研究了正常小鼠与免疫缺失型小鼠^淋巴细胞数量的变化关系!和T551T210+,-_+1则用A<激光激发德州红%间接标记的生物素抗体"进行三色流式3@‘细胞术分析人外周血淋巴细胞表面抗原的协同表

;8达6!

6;8

巧妙a’21b+等人根据藻胆蛋白的进化特点"

利用藻胆体能量传输机制"首先使用YF$F合成了

体的荧光水平!纵坐标显示的是由FG标记的抗

抗TH抗体的荧光水平!4抗体可以特异性地T+(+(与抑制型细胞毒@细胞%@&D*-*-U0&)(BB,+))-,

结合"抗T3H抗体可以特异性地与巨噬细胞&+’’+(和VW细胞结合!在图=右上角区域显示抗%3S

这样"通过双色分析可以4和抗TH双强阳性!T+(+(清楚地检测和观察到在X?$Y患者血液中相关淋巴万方数据

细胞的数目"均有显著增加!

藻红蛋白和别藻蓝蛋白交联体%图4就EE3!^FGXF

6;8

是FREGXF和FGXF的吸收和发射光谱!交联蛋白"它具有高效的分子间能量传递能/+<d力!在性能上增加了荧光探针的斯托克斯位移"增强了荧光分辨率"在使用上可以与其他荧光探针结合

这种人工合成的交联蛋白被形象地称为c*21E

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万方数据

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卷

中所有已知的主要!细胞群"鉴定特定基因表达与功能实现#这些鉴定和计数对肿瘤的病理研究和临床诊断有重要价值#

$细胞周期和%&’倍体分析

细胞内%&’体积分数是呈周期性变化的#($期和)期的%采用&’体积分数是(*期的$倍#特异的%&’荧光染料不仅可以在流式细胞仪上测得细胞周期中各时相细胞所占的百分比"而且还可测出肿瘤细胞的%即&’体积分数的相对变化"

流式细胞术对%%&’倍体分析#&’染色一般采用化学染色方法"碘化丙啶.溴化乙啶.-//+,0!-二脒基二苯334$-334$./-4";<123156789:3%’+,基吲哚.氨基<放线菌素%.丫啶/=<=</’’%-’2-橙.派洛宁丫.等都是常用的核酸染料#分析所/+>-得到的%正常组织表现为一较高的&’直方图上"

而恶性肿瘤具有染色体数(*峰和一较低的($峰#

目或结构异常"导致%表现在直方&’的异常变化"

图上呈现异倍体峰#流式细胞仪肿瘤%&’异倍体分析在临床上具有重大意义#

?#@辅助肿瘤早期诊断

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大量研究表明A极早期癌细胞在形态学上"而C有时难以确诊"D)检测细胞%&’体积分数异常情况可以弥补病理形态学检测的困难"在提高肿瘤早期诊断上具有十分重要的意义#

?#?估计恶性肿瘤的预后

随着CD)的%&’倍体分析在肿瘤研究中的广泛应用"发现肿瘤%&’倍体预测肿瘤预后是一个更客观的指标#大多数CD)的%&’倍体分析资料表明"异倍体肿瘤的恶性度高"复发率高"转移率高"死亡率高E近二倍体肿瘤则预后好#

?#F检测肿瘤治疗疗效

近年来发展起来的%溴脱氧脲嘧啶-&’<!GHI核苷.掺入技术和抗!GHI的单抗荧光免疫技术在流式细胞术中的应用可以更加准确地测定%&’合成速率"动态地观察肿瘤的生长状态#从%&’直方图上可以直观地看到肿瘤细胞的杀伤变化"帮助临床医师设计出最佳的治疗方案-图4.#

3细胞凋亡分析

细胞死亡有两种方式J细胞凋亡和细胞坏死#细胞凋亡是一种为维持机体自身稳定的积极主动L的K万方数据死亡#它在肿瘤发生/

发展及治疗中的作用引起了人

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第+期

吴一峰D等U荧光探针在流式细胞术检测肿瘤中的应用

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图W$双染法$Y#X%"#%&分析散点图*MH[’()Z424549’:;3/35\7(787(/)’,H:3/-G,

图!"单染法$#%&检测细胞凋亡

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效评价和预后预测提供了重要的信息*荧光细胞化

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学技术的进展O以及荧光探针标记的单克隆抗D

<*=>?@双染色

特异的A有的可以被活细胞BC荧光染料中D和胞膜完整的凋亡细胞所吸收D如’双醋酸酯ACE荧光素F而有的只能染死细胞的裸核D如G利用D*,这一特性D可以分别用两种ABC染料对细胞染色*凋亡细胞被’而坏死AC染色后发出黄绿色荧光D细胞被G染色后D发出桔红色荧光D这样就能区分,出这两类细胞*

<*<>?@和蛋白质染色

凋亡细胞保持膜的完整性至较晚期D而坏死细胞则较早出现膜的破碎分解D因此后者的ABC和蛋白质体积分数都比前者要低*用’对细,H:和G,胞的总蛋白和A进行’以BC双染后D:;分析D

蛋白质的荧光强度为JABC的荧光强度为I轴D

轴作二维图D坏死细胞群位于左下方D凋亡细胞位于左上方并与KL期的正常细胞群平行E图MF*

<*N细胞凋亡早期事件检测

细胞膜内层的磷酯酰丝氨酸暴露到细胞外层是

LPQ细胞凋亡的早期事件之一O*S是一种C//.R(/TT

它与磷酯酰丝氨酸具:3依赖性的磷脂结合蛋白D

有高度的亲和力D因此它可以作为一种探针去检测

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体的开发O为流式细胞术研究各种肿瘤性抗原VD

肿瘤性蛋白V致癌基因开辟了新途径D极大地提高了肿瘤学的研究水平*

但是现在应用的荧光探针仍存在一些问题D例如由于藻胆分子的分子质量很大D难以标记小分子流式细胞术应用的开拓需要开发更特异和更敏感的新型荧光探针*首先D新的荧光探针应该具有更简单的交联方式与配体结合‘其次D新的荧光探针不仅仅用于标记单克隆抗体D而且可以同时标记核酸D将核酸与抗原的信息连贯起来‘再有D发展能与不同种肿瘤细胞同时结合的荧光探针以提高检测效率*

及细胞内抗原或受体D某些核酸染料易造成污染等*

参考文献EFUabcbdbefbg

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出是否有细胞凋亡的存在U将C/S标上荧光/.R(/

素后就可以用流式细胞仪进行检测*

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流式细胞术作为肿瘤学研究方面的主要手段之万方数据一D已广泛应用于肿瘤临床研究D为肿瘤的诊断V疗

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赵井泉.杨紫萱.等#藻胆蛋白复合物的合成及$K&赵继全.

其分子内能量传递$生物化学及生物物理进展.&#4!jjK."qr%skqp%lqqt#

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上接第123页sr

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/mx44.html