乳酸菌1

乳酸菌的耐酸机制

摘 要: 对乳酸菌耐酸机理进行了初步介绍, 主要从以下几个方面进行

了阐述, 包括质子泵机制、蛋白质及RNA修复、细胞膜及代谢方式的改变和碱生成等, 以期为人们了解乳酸菌耐酸的生理生化机制提供借鉴, 为研究者对乳酸菌耐酸性研究提供理论指导。

关键词: 乳酸菌; 耐酸性; 机理

Review on the Mechanism of Acid Tolerance of Lactic Acid

Bacteria

Abstract: This review provided the possible acid tolerance mechanism of Lactic

acid bacteria, including proton pump, repair of protein and RNA, cell membrane and metabolic ways change, production of alkali and so on. The purpose of this article was to make comprehensive understandings of the mechanism for acid tolerance of Lactic acid bacteria and provide a theoretical basis for the research work related to Lactic acid bacteria.

Key words: Lactic acid bacteria; acid tolerance; mechanism

引 言

乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌的通称。它们在自然界分布广泛，可栖居于人和动物的肠道及其他器官中。在土壤、植物根际和许多的人类食品、动物饲料，还有自然界的湖泊和污泥以及一些临床样品中都发现有乳酸菌的存在。很久以前人们就利用乳酸菌来发酵动物（乳、肉、鱼等）和植物制品（蔬菜、葡萄酒、橄榄等）生产各种各样的产品。随着食品发酵工业的不断发展壮大，乳酸菌的经济效益不断在增长，因为虽然它们在发酵食品中的含量非常少，但是对食品的感官品质和质量却有决定作用。因此，发酵剂菌株的质量功能特性和生长特性对于产品的成功发酵是非常必要的。

乳酸菌不但包括在食品发酵中使用的一般认为安全的微生物，而且还包括胃肠道中普遍存在的共生体和具有潜在益生作用的益生菌。对这些微生物来说，食品和胃肠道中的酸性环境对它们的生存是一个很大的挑战。例如，益生菌的最佳

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载体是酸奶和发酵乳制品，益生菌如果想要在其中生存就不得不适应这两类载体的酸性环境。而且，益生菌需要能够在酸度更高的胃酸中生存，以便于它们能够顺利地通过胃到达小肠，并在小肠中生存。因此，人们已经普遍接受耐酸性作为筛选理想的益生菌株的特性之一[1]。因此，我们有必要及时研究乳酸菌的抗酸性机制，并对提高或者抑制其耐酸性的机制进行评价。本文讨论了乳酸菌可能的耐酸机理, 并对其进行了初步分析。

1 质子泵

乳酸菌调控其细胞内pH的能力是乳酸菌细胞能够正常生存的重要的生理需求之一。乳酸菌在生长过程或在低pH环境中时，如果它不能够维持其细胞内环境的近中性，那么它就可能会丧失活力或者细胞活性。当环境中的pH低于细胞正常生理范围时，在一定的pH范围内时，乳酸菌能够通过某些机制维持细胞内的pH高于环境中的pH，使其保持在正常的生理范围之内。但是当环境中的pH非常低时，乳酸菌就不能够保持细胞内pH的稳定，胞内的pH也开始下降，最终内外的pH达到一致，乳酸菌生长停滞直至死亡[2]。大量的研究也表明，H+-ATPase和谷氨酸脱羧酶（GAD）体系是乳酸菌维持胞内pH内稳定所使用的主要机制。 1.1 H-ATPase

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多亚基的H+-ATPase（F1F0-ATPase）将ATP的产生和跨膜的质子动力势（PMF）偶联起来，它既可以通过利用细胞呼吸作用产生的PMF来生成ATP,可以利用底物磷酸化产生的ATP来产生PMF[3]。PMF能够促进细胞质中的质子的外排，导致胞内的pH的降低。嵌入细胞中的F0亚基复合体是由a、b和c三个亚基组成的，它是一个通道蛋白，具有质子转运活性。它的活性可以通过一些特定F1蛋白的共同表达而得到提高，这表明F1蛋白可能在F0通道蛋白的装配或开启过程中发挥一定的作用。结合在细胞膜表面的F1亚基复合体是由α、β、γ、δ和ε五个亚基组成的，当它被从膜中释放出来后就具有ATP酶活性。当其同嵌在膜中的F0亚基复合体络合在一起之后就能够醉话偶联的质子转运和ATP的合成或者水解之间的相互转换[4]。大量的科学研究已经表明H+-ATPase能够增强许多不同的乳酸菌菌种对低于环境pH的耐受性，例如对德式乳杆菌保加利亚亚种（Lb.delbrueckiisubsp.bulgaricus）全基因测序的研究已经证实，在H+-ATPase的作用下，德式乳杆菌保加利亚亚种能够在其代谢过程所生成的乳酸导致的低pH

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环境中正常生长。研究还坚定了嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）中受pH诱导的F1F0-ATPase操纵子，他们发现嗜酸乳杆菌在低pH环境中生长时，不但atp基因转录的产物会增加，而且细胞膜中H+-ATPase活性也会增加[5]。此外，还有研究者对乳酸乳球菌（Lactococcus latis）中编码F1F0-ATPase的基因进行了克隆和测序。

1.2 谷氨酸脱羧酶体系

大约60年前，科学家通过研究发现微生物的氨基酸脱羧酶能够通过在脱羧反应中消耗质子来控制其生存环境中的pH。这些氨基酸脱羧酶包括赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶和谷氨酸脱羧酶，它们发挥作用的方式是首先将一个质子结合到摄入细胞内部的氨基酸（赖氨酸、精氨酸或者谷氨酸）底物上，然后再将此合成的产物（尸胺、精胺或者γ-氨基丁酸）同细胞外的另一个氨基酸底物交换。通过这种方式，一分子的胞外氨基酸被转化成一分子的胞外产物，同时消耗的一分子胞内的质子导致胞内pH的升高[6]。在以上所提到的三种系统中，只有GAD系统同乳酸菌细胞的pH调控有关。按照最简单的调控机制模型的描述，GAD系统有一个赖氨酸脱羧酶、一个氨基酸通透酶和一个谷氨酸γ-氨基丁酸反向转运体组成。细胞通过特异的转运体摄入谷氨酸之后，在细胞内经过谷氨酸脱羧酶脱羧消耗一分子的胞内质子，反应的产物γ-氨基丁酸（GABA），通过反向转运体被排到胞外。最终结果是由于胞内氢离子的消耗导致细胞内的pH升高，胞外的谷氨酸被转变成碱性略强的GABA而导致胞外pH的略微升高。人们发现在乳杆菌中，谷氨酸的代谢能够产生ATP。基于此研究结果有人提出GAD系统通过将产生电子的反向转运体和氨基酸的脱羧作用偶联起来，能够提供给细胞所需的代谢能量。人们认为，通过三个连续的脱羧-反向转运偶联循环就能够产生一个足够的PMF供F1F0-ATPase来合成一分子的ATP[7]。GAD系统的重要性显然同食品中存在的谷氨酸相关。谷氨酸被作为食品风味增强剂来使用具有悠久的历史，在很久以前，亚洲许多国家都有使用富含谷氨酸的海带作为食品风味增强剂的习俗。在现代食品生产中，谷氨酸钠是最常使用的添加剂，虽然钾盐、铵盐和钙盐也使用。在许多食品成分中也含有谷氨酸，它被用来调节这些食品的酸度。蛋白质含量丰富的食品，例如肉类和乳制品，同时还有一些蔬菜也含有较多结合的谷氨酸，这些食品的发酵衍生物也会提高游离的谷氨酸的含量。

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2 蛋白质修复

乳酸菌的某些伴侣蛋白、蛋白酶和热激蛋白，当细菌细胞处于酸性环境中时它们会大量表达，从而能够保护蛋白的活性或者降解对细胞有害的蛋白。例如利用蛋白质组学的方法分析某些乳酸菌的酸耐受反应时发现，某些热激蛋白总是增量表达，可能会修复酸诱导损伤的蛋白，和/或有助于新合成蛋白的折叠。然而，在不同种的乳酸菌中，酸诱导表达的热激蛋白种类各不，尽管在不同的乳酸菌菌种中都发现有DnaK和GroEL蛋白的表达。研究者对乳酸乳球菌(L.lactis)groE和clpP操纵子的特异性研究发现，低pH诱导的酸耐受反应，通常是由它们自身的热激蛋白的调控Hrc和CtsR介导的[8]。

3 DNA修复

由于内部pH降低受损的DNA可以通过错误碱基序列的剪切或已停止的复制叉重新其起始复制而被修复，当乳酸菌细胞内的pH过低时会导致DNA的脱嘌呤和脱嘧啶，这种现象的发生涉及碱基的质子化以及随后的碱基和戊糖之间的糖苷键的剪切，碱基丢失位点处的残基通常称为无碱基或AP（无嘌呤，无嘧啶）位点[9]。通常只有单个碱基缺陷乳酸菌才可以利用碱基切除修复方式来进行修复。如果DNA损伤造成DNA螺旋结构较大变形，则需要以核苷酸切除修复方式进行修复。最常见的是短片段修复；只有多处发生严重的损伤才会诱导长片段修复。损伤由切除酶切除，编码此酶的基因是uvr基因，有多个亚基组成。人们发现，在低pH环境中生存时变形链球菌（S.mutans）的野生型和含有recA基因的菌株中都有具有能切除AP位点的内切酶活性，而且还诱导了uvrA基因的表达[10]。这说明，在细菌的酸应激过程中，它们可能同时使用碱基切除和核苷酸切除修复方式对DNA进行修复。

4 细胞膜的改变

细胞膜是细菌生存的外部环境中物理化学压力的首要侵袭目标之一。细菌能够通过改变细胞膜的结构、成分、稳定性和活性来保护细胞，而细胞膜的脂肪酸成分的改变是最常见的细菌对外部环境压力的一种反应。例如，变形链球菌（S.mutans）在低pH环境中生长时，细胞膜中的单不饱和脂肪酸和长链脂肪酸会增多，这会降低细胞膜对质子的通透性，从而抑制质子进入胞内，使得细胞内环

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境的pH保持在一个较高的水平而增加菌株的耐酸性[11]。

5 产生碱

5.1 精氨酸脱亚氨酸酶体系（ADI）

科学家在许多乳酸菌中都发现了ADI体系的存在。ADI体系主要由三种酶组成：精氨酸脱亚氨酸酶、鸟氨酸转氨酶和鸟氨酸氨基甲酸激酶，它们分别是由arcA、arcB和arcC基因编码的，能够催化精氨酸生成鸟氨酸、氨和二氧化碳，产生的氨会中和细胞中的H+,升高胞内pH，从而提高细菌的耐酸性[12]。普遍认为，口腔细菌具有ADI体系对人类来说是有益的，例如格式链球菌（Streptococcus gordonii）、副血链球菌(S.Parasanguis)和血链球菌(S.sanguis)，以及某些乳杆菌都或者利用游离的精氨酸（平均分泌浓度为50μmol/l），或者利用唾液中的多肽和蛋白质中的精氨酸。它能够提高乳酸菌的耐酸性，尤其是对某些很少天生就具有酸抗性的口腔乳酸菌（也就是说非突变体）来说是非常重要的。因为在这些细菌中存在的ADI体系。能够使得那些有益的产酸较少微生物能够同更嗜酸产酸更强的微生物在牙菌斑上共生。虽然具有ADI体系的口腔细菌能够利用宿主膳食中的精氨酸，但是人们还发现唾液中的精氨酸、赖氨酸或者含有这些氨基酸的多肽至少也对抗龋齿人群的低龋齿率有部分促进的作用[13]。

在许多不同发酵食品中的乳酸菌也都含有ADI体系，虽然需要不同。早肉品发酵中使用的米酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）是非常特殊的，因为它是兼性发酵乳杆菌，并且也具有ADI代谢途径。有研究者利用缺少ADI体系的米酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）的突变株来确定米酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）的ADI体系在肉品发酵中的重要性。虽然在突变株和野生型之间没有明显的不同，但是他们指出，这可能是由于菌株之间蛋白水解酶活性的差异，导致菌株生长环境中的游离精氨酸的浓度有很大的不同。还有研究者从来源于酸面团的70株乳酸菌中筛选具有ADI、鸟氨酸转氨酶和鸟氨酸氨基甲酸激酶的菌株，结果发现只有专性异型发酵的菌株同时具有这三种酶。他们对这些菌株中的旧金山乳杆菌（Lactoacillus sanfanciscensis）进行了详细的研究，结果发现ADI体系不但能够增加菌株的耐酸程度，而且还有助于细胞的生长，有助于细胞在70℃储存时的存活以及促进一种重要风味化合物前提物质-鸟氨酸的产生[14]。 5.2 脲酶体系

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脲酶能够催化一分子的尿素水解成一分子的CO2和一分子的氨，而氨可以中和H+升高pH。人们已经在嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和唾液链球菌（Streptococcus salivarius）中发现了脲酶的存在。研究者发现，当培养基中的尿素浓度为25mol/L、pH为3时，唾液链球菌（Streptococcus thermophilus）能够将胞外的pH升高为7.6,同不添加尿素的对照组相比，存活率提高了1000倍[15]。由于在唾液中存在尿素，因此尿素水解可能对唾液链球菌（Streptococcus thermophilus）在其他嗜酸的乳杆菌和口腔链球菌正常生长导致的极低pH环境中生存尤其重要。

6 代谢方式的改变

虽然人们已经了解了微生物在温和环境中生长，适应酸性环境和在极端pH下存活的抗酸性机制，但是对人们对其发酵过程中的非常重要的自酸化作用的响应机制还不是很了解。但是人们发现，随着生存环境的酸化，乳酸菌改变了ATP的代谢方式，它们利用ATP来产生质子梯度，同时伴随着供给细胞用于生物量合成和新陈代谢的能量的减少，直到最后细胞的生长被抑制。代谢的紊乱是由于同主要代谢途径相关基因的转录方式改变导致的，令人感到惊讶的是，虽然这些转录方式的改变在pH剧烈降低的过程中并不明显，但是在某些情况下，这种改变可能是由于mRNA稳定性的增加所致。实际上，在酸化后期同糖酵解相关的几种酶的浓度开始增加，这有利于细胞在生存环境中的pH回复正常之后快速恢复生长。

7 总结

乳酸菌可以利用的耐酸性机制有很多种。乳酸菌在低pH下生存的最有效的途径就是完全避免在极端环境中生长，显然这种方式不可能所有的乳酸菌都具有。因此，当乳酸菌在低pH环境中生长时，它们就不得不使用自身的耐酸性机制来维持细胞内pH稳定，使细胞代谢能够正常进行而不受外界低pH环境的影响，从而能够低pH环境中存活。在食品工业的生产过程中以及在通过人和动物的胃肠道时，乳酸菌都不得不暴露在低pH环境中，这就使得只有对地pH环境具有耐受性的乳酸菌菌株才能够存活以及生长繁殖。因此通过对乳酸菌耐酸性机制的了解使得我们能够通过特异性的筛选方法以及分子生物学的手段来获得具有较高耐酸性的菌株，从而能够应用于工业化生产。对于提高食品安全来说，可以筛选

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具有较高GAD活性的发酵剂菌株，能够最大程度地降低食品中残留谷氨酸的含量，从而减少可供不良细菌代谢的谷氨酸，这些细菌通过分解谷氨酸而延长在低pH下生存的时间。当然也可以合成谷氨酸类似物，能够特异性地抑制或者竞争细菌的脱羧酶，从而使得我们可以不依赖发酵剂菌株的GAD活性来生产更安全的食品。对于解决酸奶后酸化来说，可以筛选低H+-ATPase活性的发酵剂菌株或者使用分子生物学方法减少发酵剂菌株中H+-ATPase在低pH下的表达，从而降低其耐酸性，使其在低pH下生长停滞甚至死亡，这就可以避免酸奶在发酵成熟后发生后酸化。本综述中阐述了许多乳酸菌的抗酸性机制，但是开发新的技术来增加或者减少微生物在低pH下的存活率，仍然会受益匪浅。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/mty3.html