均相LanthaScreen细胞分析--一种常见的GPCR 传感器-ERK1,2 的自动均相磷酸化检测

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药物筛选

一种常见的GPCR传感器-ERK1/2的自动均相磷酸化检测 -均相LanthaScreen®细胞分析

Paul Held and Peter Banks, BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT

Kristin Huwiler, Matthew Robers, and Bonnie Hanson, Life Technologies, Madison, WI

关键词：GPCR, LanthaScreen, ERK，TR-FRET

GPCRs的激活会刺激活化各种信号通路，大部分信号通路的激活均可能导致细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化。因此，针对ERK1/2的磷酸化检测可以代替GPCRs的活性检测。本文介绍了一种将BacMam调节的GFP-ERK2 传感器基因传递技术和LanthaScreen®细胞学实验技术相结合的时间分辨荧光共振能量转移技术（TR-FRET），该技术用来检测ERK2细胞外的磷酸化水平。上述技术的结合使检测任何感兴趣细胞的GPCRs活性变的更为灵活和可行。本文所介绍的是一种均相的，可以和自动化技术整合的实验方法。介绍

G蛋白偶联受体超家族作为药物靶点成员代表着现代医学的核心，大部分畅销药和约40%处方药都是以其作为药靶。受体酪氨酸激酶细胞膜受体(RTK)和G蛋白偶联受体(GPCR)通过几种不同的信号通路调节从细胞膜到细胞核的胞外信号。信号被传递，根据信号强度和持续时间不同诱导出不同的细胞反应。细胞外调节蛋白激酶(ERK)介导细胞表面受体通过不同的信号通路传递细胞增殖及分化的信号，被视为是一个关键的调节因子。(图 1)

图1 GPCR 介导的MAPK/ERK1/2活化。

配体结合可以通过多种机制导致ERK1/2的磷酸化。与受体酪氨酸激酶的结合可以诱导停靠蛋白的募集。Ras蛋白被激活，导致RAF激酶的激活，从而诱导了MEK1/2 和 ERK1/2的磷酸化级联反应。

MAPK/ERK通路也可以被GPCR的激动剂所激活。这些机制涉及到第二信使依赖的蛋白激酶，β-Actin的富集，或受体酪氨酸激酶的转录激活。ERK1/2的磷酸化激活可以做为G蛋白依赖及G蛋白不依赖的标记信号。然而，直到目前为止，一直缺少可以高通量检测ERK活性的技术。我们推出了一种BacMam ERK1/2细胞学分析方法，该方法将BacMam介导的GFP-ERK2 传感器基因传递分析法和LanthaScreen®细胞学实验技术结合起，来检测胞外的ERK1/2的磷酸化水平。BacMam病毒是一种被修饰的杆状病毒载体。杆状病毒是一种昆虫细胞病毒，对哺乳动物细胞没有毒害，而且不会在哺乳动物细胞内进行复制。该病毒载体包含一个CMV表达调控元件，可以维持约5天高水平的瞬时表达。此外，该病毒可以允许大片段的插入(达38kb)，并转染到原代细胞株和干细胞株。(图 2)

图2 BacMam 病毒

BacMam ERK1/2细胞实验使用BacMam ERK2病毒转染

干细胞，导致了GFP-ERK2融合蛋白的表达。(图 3A)当表达GFP-ERK2细胞受到刺激，ERK被磷酸化，细胞开始溶解，铽（Tb）标记的检测抗体结合到ERK2的双磷酸化位点Thr185,Tyr187。从而在Tb和GFP之间产生了荧光能量的转移，产生了TR-FRET信号。(图 3B)

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图3. LanthaScreen® 细胞实验概述。(A)表达GFP-ERK2融合蛋白的肝脏细胞被刺激后促进了ERK的磷酸化。(B) 含有LanthaScreen Tb-anti-ERK2 [pThr185/pTyr187]抗体的LanthaScreen®细胞裂解液加到细胞中。抗体结合使供体Tb和GFP之间产生能量转移，从而导致TR-FRET信号增强。总之，磷酸化的ERK1/2 传感器采用了一种均相的TR-FRET免疫实验方法实现细胞水平上对ERK2蛋白转录后修饰的检测。

材料方法

ERK1/2磷酸化实验参考Huwiler et. al.的方法略有修改，在加裂解buffer之前没有去除培养基。简单来说，稳定表达GPCR的细胞株以BacMam ERK2试剂进行转染后冻存。BacMam处理的细胞在实验前解冻，用低浓度血清培养基(0.1%)清洗，384孔板培养(25μL培养基/孔), 血清饥饿过夜。使用MicroFill分液器分别加入5μL含有激动剂和不含激动剂的培养基，室温孵育6-8分钟，时间长短取决于GPCR细胞株。使用MicroFlo分液器加入6μL的浓缩裂解buffer和LanthaScreenTb-anti-ERK2 [pThr185/pTyr187]抗体混合液，细胞被直接裂解（没有吸出培养基），然后检测TR-FRET信号。(图 4)

图4. 自动化LanthaScreen实验步骤

对于D2多巴胺拮抗剂化合物的筛选，使用BacMam ERK2转染的冻存D2多巴胺细胞被平铺在384细胞培板中(15,000个细胞/孔)培养过夜。次日，将Tocris化合物混合物(含1120种化合物)加入到细胞中使其终浓度为10μM。然后用MicroFill加入D2多巴胺激动剂，终浓度为100nM。细胞室温孵育8分钟后，用MicroFlo加入裂解液和Tb-anti-ERK2 [pThr185/pTyr187]抗体，2小时后检测TR-FRET信号。第二天重复筛选一次，然后将两天筛选出来的抑制活性低于cutoff的化合物评为“hits”。每次筛选的hit的比率设定为6%（76/1120 种化合物）。

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结果

实验对MicroFill注射器泵和MicroFlo蠕动泵分液器在分装ERK1/2裂解buffer的能力进行了测试。图 5显示当使用荧光素作为示踪物的时候，这两种分液系统均可以精确和准确地分装小体积(5μL)的各种裂解buffer。分液的CV值不超过2%

（未列举数据），信号差异不明显。

图5. 试剂分液器的分液一致性。不同的分液器信号被用来分装5μL含有荧光染料的裂解buffer到384孔板的192个孔中。

Synergy2多功能微孔板检测仪

检测荧光信号。每个数据点代表16个孔的平均值。

图6 自动化和手工步骤比较。使用BacMam ERK2试剂转染HTR1A GeneBLAzer® CHO细胞，试剂分别采用手工、MicroFill和MicroFlo分液系统进行分液。

对分液系统分液和手工分液在诱导激动剂pERK1/2反应的能力上进行比较。MicroFill用来分5 μL作为激动剂的血清或作

为本底控制的培养基，而MicroFlo则用来加含Tb-anti-ERK2抗体的裂解buffer。如图6所示，LanthaScreen实验中，使用分液系统进行自动的试剂分液和使用手工分液得到的结果相当(图6)，且慢和快的自动分液速度也没有差异。统计学比较显示自动化分液的方法反应比率相对较小，但两者z’因子相当。（表1）

MicroFlo快速分液慢速分液手工分液Z’因子0.620.570.64反应比率

3.62

3.51

4.84

表1自动化和手工液体处理的统计学比较

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一个典型的实验中MicroFlo用来加含Tb-anti-ERK2抗体的裂解buffer，如图7所示。用不同浓度的BacMam病毒转染U2OS细胞，然后再用不同浓度的EGF刺激细胞。在该实验中细胞反应和预期一样，产生了大量的病毒。只有含有病毒的细胞会响应EGF刺激，且其响应取决于病毒载量。

图7 四种不同浓度的BacMam ERK2病毒转染U2OS细胞。第二天细胞采用EGF刺激6分钟，刺激结束后用含有LanthaScreen Tb-anti-ERK2 [pThr185/pTyr187]抗体的LanthaScreen®裂解buffer裂解。检测TR-FRET信号，数据均一化为基本反应比。

采用MicroFill和MicroFlo自动分液器进行D2多巴胺激动剂化合物库的筛选。散点图如图8所示。确定了1120个待测化合物的响应比率，同时通过对cutoff的确定，6%化合物(76/1120)被认定有抑制活性。Tocris库偏向于GPCR和离子通道结合化合物，因此6% cut off标准是可以接受的。筛选又重复进行一次。如图8所示，大多数的化合物或者是不与D2多巴胺受体存在特异的相互作用，或者是一些已知的拮抗剂。这些化合物的发散率(GFP/Tb)是0.06-0.08。cut off值为0.6%，发散率约为0.03的化合物在图中标绘出来（趋势线）。再次重复筛选，只有那些两次筛选都低于cut off 的被认定为真正的抑制剂（图8）。

图8 文库筛选图。磷酸化-ERK1/2值来自单次筛选，用cut off值表示。multiday抑制剂用红色数据点标识。

两次筛选的对照板统计学数据显示当实验自动化分液系统分液时，实验表现出较好的稳定性。所有测试板的Z’值都大于等于0.5（表2

）。

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表2.筛选的统计学分析。Z’因子计算源自每个384孔板的质控孔。

第一次筛选中67个化合物被评为‘hit’，被确定为D2多巴胺抑制剂。接下来的重复筛选中，55个在初次筛选被评为‘hit’的化合物再次被确定为抑制剂。在这55个被确定的复合物中，20个据报道是多巴胺的受体抑制剂，4个是已知的MEK抑

制剂。通过两次的筛选，确认了所有的D2多巴胺抑制剂。讨论

上述数据表明使用一些自动化的分液系统如BioTek公司的MultiFlo、MicroFlo 和 MicroFill分液系统,可以自动化的完成LanthaScreen® ERK2 细胞实验中的加液工作。分液系统可以很好的控制加液的准确性和精确性。通过平行的比较，在LanthaScreen® ERK2 细胞实验中使用MicroFill 和MicroFlo加液比手工加液的出错几率要小，表现在较低的标准偏差。而使用MicroFill 和 MicroFlo的加液的相应系数比手工加液要略低，而精度改进后Z’值则相当。

机器和实验的相结合可以提供给我们重要的生物信息。采用BacMam系统，通过把ERK2-GFP瞬时转染到大量细胞中，使用ERK1/2 LanthaScreen实验的方法拓宽了科研工作者的研究范围。例如，通过MicroFill 和 MicroFlo分液系统与LanthaScreen® 细胞 磷酸化-ERK2 实验相结合，可以方便准确地从生物学上备受关注的化合物库中筛选出D2 拮抗剂。这些基于细胞学的实验需要在短暂的孵育之后及时的加入相应的试剂。和手工加样相比，使用高准确，高精度的自动化分液系统可以使实验过程更加简单方便且结果更为准确。参考文献

1. Luttrell, D.K. and L.M. Luttrell (2003) Signaling in Timeand Space: G

Protein-coupled Receptors and Mitogen acitivated Protein Kinases. Assay Drug Dev. Technol. 1:327-338.

2. Huwiler, K.G., T. Machleidt, L. Chase, B. Hanson, and M.B. Robers (2009) Characterization of Serotonin 5-hydroxytryptamine-1A Receptor Activation Using a Phosphoextracellular-signal Regulated Kinase 2 Sensor. Anal.

Biochem. 393:95-104. Rev. 2/1/10, AN020110

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/msoe.html