DPPH法测定胡萝卜素的抗氧化活性 - 毕业论文

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评阅教师评阅书

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差异影响含量。[6] 1.1.3 花青素

花青素是属于黄酮家族的天然色素，广泛存在于水果、蔬菜之中。西方人常吃的葡萄其加工产品可能是花青素的最重要来源。花青素为水溶性，与糖类形成糖苷。Wang

等探讨

种花青素的抗氧化活性发现

Kuromanin(cyanidin-3-glucoside)活性最高，约为维生素E的3.5倍。[7-8]桑椹含有大量的矢车菊素(cyanin)及花翠素(dlephinin)，其萃取液可用于治疗微血管疾病以及维持正常的血管渗透性，亦可防止胆固醇引起的动脉硬化。[8]不同品种葡萄所含总酚类物质的差异相当大，从白色及浅色葡萄的169-272mg/L到深色葡萄的497-1215mg/L。由于深色葡萄品种的黄酮类物质含量较高，其抗氧化活性也较白色及浅白色葡萄为高。因此，红葡萄酒对LDL氧化的抑制效果也比白葡萄酒高出许多。[9]Saito等最近发现葡萄的萃取液及其所含的Procyanidin具有防止胃溃疡的生理功能。[10]究其原因可能在于Procyanidin低聚合物具有清除自由基的抗氧化活性，可使胃壁不受自由基引起的伤害；同时Procyanidin可与蛋白质紧密结合而具保护胃壁的功能。[3]Larrauri研究证明，干燥温度对葡萄皮中多酚含量及抗氧化活性有一定影响，温度愈高，酚类物质及抗氧化活性降低愈明显。[11]

1.2 果蔬抗氧化作用机理

研究表明，由活性氧引发的自由基会使人体内的脂质与蛋白质发生链式氧化反应。这些自由基寻找生物分子的不饱和位点进行进攻，对有机分子产生一些不应有的修饰和损伤，这些大分子有蛋白质、碳水化合物、脂类物质和核酸。如果在正常细胞代谢中产生的自由基的量超过了保护机能所能承受的限度，就会引起细胞代谢的紊乱，导致细胞膜、组织、酶和基因的损害，以至发生衰老或疾病。

[12]

Rosenbtrg[13]指出柑橘(Citrus)类水果及黄绿色蔬菜富含抗氧化维生C、维生素E

和β-胡萝卜素，能够预防白内障的发生。有研究认为莴笋(Asparaguslettuce)叶中富含黄酮类和多酚类物质，能够增强胃液和消化液分泌，增进胆汁分泌。李绍家和刘风书等[14]指出滇橄榄(Phyllanthus emblica)富含维生素C，并含有18种氨基酸和人体必需的多种常量元素和微量元素。老年人饮用滇橄榄汁2个月后，血液中红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力提高1.3倍，血浆中脂质过氧化物(LPO)含量下降11%。因此，不少学者认为，水果蔬菜防治衰老和老年性疾病可能源于其抗氧化作用。现归纳如下：

(1) 清除活性氧自由基。已有大量证据证明，水果蔬菜均有一定的清除氧自由基的能力，这可能是其抗氧化作用的第一道防线。

(2) 增强抗氧化酶活性。水果蔬菜可通过增强抗氧化酶活性而保护机体免受氧化损伤。主要证据有：黄刺玫果汁可增强大鼠血GSH-Px活力；卷心菜可提高小鼠肝谷胱甘肽还原酶(GR)及谷胱甘肽硫转移酶(GST)活力；大蒜可增加啮齿动物脑和肝中GST和SOD活性；能提高SOD活性的水果蔬菜还有芥蓝、胡萝卜、灯笼椒、西番莲、猕猴桃、刺玫果、余甘果等。

(3) 阻断脂质过氧化链式反应，减少膜脂质过氧化损伤。不少水果蔬菜可抑制过氧化产物MDA及脂褐素的生成，如沙棘、芥蓝、胡萝卜、灯笼椒、刺玫果、山楂、余甘果、西番莲等。杨琦等研究证实，沙棘能够增加大鼠红细胞膜巯基含量，提高大鼠红细胞膜Na+-K+-ATP酶活力。喂饲含花菜的混合饲料后，大鼠结肠粘膜GSH水平明显升高，并呈现剂量效应。

(4) 减少DNA 损伤。自由基学说认为，过剩的自由基可以攻击DNA，引起DNA损伤，从而引发多种疾病。对果蔬抗氧化作用的研究目前已有个别深入到DNA分子水平。Stohs等对卷心菜的研究表明，喂饲含卷心菜的饲料可明显减少老年小鼠DNA单链断裂。[15]

1.3 果蔬抗氧化活性的评价方法

自从果蔬抗氧化活性对于预防癌症、心血管疾病以及抗衰老等方面有很重要的生理功能被提出后，研究果蔬抗氧化活性已成为热门课题。果蔬抗氧化活性的评价方法也随着科学技术的发展和设备的更新而不断地发展和改变。这里简单介绍几种目前常用的评价方法及其采用这些方法所得的研究结果。

1.3.1 Rancimat法对果蔬提取物进行抗氧化活性研究

Rancimat法测果蔬提取物的抗氧化活性是使用 Rancimat脂肪酸败测定仪来测定的。其工作原理为：在高温条件下通入空气使油脂发生氧化作用，将氧化产生的挥发性小分子醛、酮、酸等物质用硅胶管导入盛有蒸馏水的试管内，使蒸馏水的电导率随时间而变化。用计算机记录试管内水的电导率变化情况，然后再计算出电导率对时间变化曲线二次导数的最大值，可得出油脂氧化初期—诱导期的数值。同时与空白对照组比较，就可得出抗氧化剂的保护系数。然后，以保护系数比较抗氧化剂的抗氧化活性。

杨安树等[16]采用Rancimat法对藜蒿(Artemisia selengensis)提取物的抗氧化活性进行了探讨。他们的研究表明：藜蒿提取物对油脂具有明显的抗氧化作用且具有剂量效应关系；在乳化体系中提取物的抗氧化效果比在油体系中强；提取物与丁基羟基甲苯(BHT)和没食子酸丙酯(PG)相比较，提取物浓度达0.10%时，抗氧

化活性超过0.02%BHT，而小于0.02%PG；柠檬酸、酒石酸、抗坏血酸对藜蒿提取物表现出较强的协同增效作用。

1.3.2 β-胡萝卜素-亚油酸乳化液氧化法

β-胡萝卜素是一种多烯色素，易被氧化而褪去黄色。在反应介质溶液中，由亚油酸氧化产生的过氧化物等能使β-胡萝卜素漂白，随时间的延长吸光度越来越小。当以吸光度对时间作图时可得到一条下降曲线。不同原料的溶剂提取物，按其抗氧化活性的大小不同而使β-胡萝卜素漂白的速度各异。抗氧化能力越强，吸光度下降越慢。因而不同的曲线有不同的斜率。抗氧化能力越强的，曲线斜率绝对值越小。

洪庆慈等[17]以β-胡萝卜素漂白法测定8种粮食材料提取物的抗氧化活性，并比较各提取物的抗氧化活性的高低。他们的实验结果表明，大麦(Hordeum vulgare)籽和燕麦(Avena sativa)籽的石油醚提取物都有较高的抗氧化活性，而稻壳和花生壳的石油醚提取物只有微小的抗氧化活性。而8种粮食的甲醇提取物都具有一定的抗氧化活性，其中以花生壳、稻壳和黄豆壳提取物的抗氧化活性比较强。Von Gadow[18]用β-胡萝卜素掺入实验测定抗氧化活性，实验时在亚油酸中加入β-胡萝卜素，随着亚油酸氧化产物的产生，β-胡萝卜被氧化，在两者共存的体系中，加入用氧饱和的蒸馏水以加速氧化。在470nm处测吸光度，根据吸光度值的变化判断抗氧化活性。田迪英等[19]利用β-胡萝卜素-亚油酸乳化液氧化法对杭州市场上常见的41种果蔬进行了抗氧化活性的研究，并测定其总酚的含量。他们的实验结果表明：大多数果蔬具有一定的抗氧化活性，其中香椿(Toona sinensis)、藜蒿、莴笋叶、水芹(Oenanthe javanica)等抗氧化活性较强，其总酚含量也较高，说明果蔬抗氧化活性的强弱与果蔬所含的酚类物质有一定的关联性。这为以后天然抗氧化剂的提取和制备提供了一定实验数据。

1.3.3 二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)法

DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其结构中含有3个苯环，1个氮原子上有1个孤对电子，呈紫色，在517 nm有强吸收。[20-21]有自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学剂量关系的。因此，在此波长处的吸收可用于检测自由基的清除情况，从而评价实验样品的抗氧化能力。

张立新等[22]利用DPPH·法对青岛地区21种常见蔬菜的乙醇提取液进行了抗氧化活性研究。研究得出：茄子(Solanaceae melongena)和番茄(Lycopersicon esculentum)等蔬菜的抗氧化活性较强，其中茄子皮尤为突出。丰永红等[23]也用

DPPH·法测定了甘蔗(Saccharum officinarum)制糖过程中各种原料的抗氧化活性，同时探讨了pH、加热温度、加热时间对自由基清除率的影响。他们的实验结果表明，各种原料均具有较强的抗氧化活性；pH 值对抗氧化活性影响很大，而加热时间、温度对抗氧化活性无显著影响。初步推断该活性物质属酚类。

1.3.4 硫代巴比妥酸反应物(TBAS)值法

硫代巴比妥酸反应物(TBAS)值法是评价油脂的氧化程度最常用的方法。氧化的油脂多生成丙二醛，一分子的丙二醛可同两分子的硫代巴比妥酸(TBA)作用生成有色化合物，该有色化合物在530 nm左右有吸收。因此，可通过测定丙二醛的量来评价油脂的氧化程度，也可测定抗氧化剂活性。

Das 等[24]用椰子(Cocos nucifera)油为基质，以持续吹入氧气和80 oC水浴为条件，加速氧化40min后测定终产物丙二醛含量，即利用TBAS法测定抗氧化剂抗氧化能力。张英等[25]用硫代巴比妥酸法测定强化竹叶提取物抗油脂氧化的能力。实验表明：强化后的竹叶提取物的抗氧化能力有显著提高。胡博路和杭瑚[26]也用硫代巴比妥酸法测定了翅碱蓬(Suaeda heteroptera)提取物的抗氧化作用。他们的实验表明，翅碱蓬的水、甲醇、正己烷提取物对亚油酸脂质过氧化均有良好的阻断作用，其中以正己烷提取物阻断能力最强。他们还用同种方法[27]测定了核桃壳的抗氧化作用。核桃壳能有效地抑制脂质过氧化，其正己烷、乙酸乙酯提取物抑制脂质过氧化的效果可与茶多酚相媲美。

1.3.5 FRAP(ferric reducing/antiox idant power assay)法

FRAP原理[28]为Fe3+-三吡啶三吖嗪(tripyridyl-triazine, TPTZ, Sigma)可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于593nm处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱。

郭长江等[29]用FRAP对36种蔬菜、30种水果的抗氧化活性进行了测定比较，并且分析了其抗氧化活性与维生素 C 含量的关系。结果表明：一些蔬菜、水果的抗氧化活性较强，有效成分值得进一步研究开发。

1.4 本研究的意义和内容

1.4.1 本研究的意义

大量流行病学研究表明富含果蔬的膳食能降低人体心血管系统疾病和患某些肿瘤的危险性。人们普遍认为产生这些健康效应的成分是膳食中的抗氧化营养

素，如维生素E、维生素C、β－胡萝卜素和硒等。然而，近年来的研究发现，某些植物中存在的多酚类非营养性成分也可能作为抗氧化剂或以其他方式参与其抗肿瘤作用或心血管保护作用。另一方面，对食品的质量而言，脂类的氧化是直接造成食品品质下降的化学因素之一，尤其是富含不饱和脂肪酸的食品，很容易氧化生成过氧化脂类，再经过氧化分解和聚合等反应，产生腐败臭，直至出现毒性。因此，具有抗氧化活性的物质，无论是对食品品质，还是对人体的健康，都具有重大的作用。 1.4.2 本研究的内容

本文主要研究新鲜胡萝卜中提取的胡萝卜素对DPPH·自由基的清除率以确定胡萝卜素的抗氧化活性，并与β-胡萝卜素、维生素C、维生素E、茶多酚标准样品的抗氧化活性进行对比得出结论。

第二章实验材料和内容

2.1 材料与仪器

2.1.1 实验材料

新鲜胡萝卜(购自湘潭某超市)，洗净晾干后切小块，用组织捣碎机打碎，在培养皿中铺成薄层冰冻，置于冷冻干燥机中冷冻干燥10h以上后取出，保存于干燥避光处，备用。

2.1.2 实验仪器

表2-1 实验中使用的主要仪器

实验仪器电热鼓风干燥箱微量移液器恒温振荡培养箱真空旋转蒸发仪紫外分光光度计电子分析天平恒温水浴锅真空冷冻干燥系统组织捣碎机

型号 101-1AB型 1000μl量程 SPX-250B-D型 RE-2000A 280 2SUV/VIS BSA 224S Max DFD-700 110-4

生产厂家

天津市泰斯特仪器有限公司上海荣泰生化工程有限公司上海博迅实业有限公司医疗设备厂上海雅荣生化设备仪器有限公司

2.1.3 试剂

二氯甲烷分析纯试剂、无水乙醇分析纯试剂、二苯基苦味酰基自由基(DPPH·)、β-胡萝卜素、维生素C、维生素E、茶多酚

2.2 实验内容

2.2.1 胡萝卜素的提取(以下操作均在避光条件下进行)

(1) 根据提取的时间、温度、浸提溶剂、料液比等条件的不同，提取出来的胡萝卜素含量也不同，通过正交试验条件优化得到最佳提取条件。

(2) 用电子分析天平称取500mg干燥过后的胡萝卜置于1000ml的三角烧瓶中，加入500ml二氯甲烷。

(3) 将(2)中的烧瓶置于恒温震荡箱中震荡1.5h，温度为40oC，转速为110r/min。

(4) 将浸提过后的溶液过滤得到胡萝卜素提取液，再将胡萝卜素提取液用旋转蒸发仪蒸发浓缩至50ml，温度为30 oC，转速为80r/min。

(5) 以二氯甲烷为空白样，用紫外分光光度计在450nm波长处测定上述胡萝卜素提取液的吸光度为2.598，根据胡萝卜素标准样品的浓度-吸光度曲线(图2-1)，可计算出上述提取液中胡萝卜素的浓度为89.15μg/ml。

(6) 将得到的胡萝卜素提取液转移至棕色广口瓶中，密封置于4 oC干燥环境中保存，备用。

1.210.8吸光度0.60.40.2005101520253035y = 0.0288x + 0.0306R2 = 0.999胡萝卜素浓度(ug/ml)图2-1 胡萝卜素标准样品浓度-吸光度曲线

2.2.2 在DPPH体系中测定抗氧化性

2.2.2.1 溶液的配制

(1) DPPH?溶液：用电子分析天平称量6mgDPPH?用无水乙醇溶解，定容于200ml容量瓶，浓度为30μg/ml，摇匀，备用。

(2) 胡萝卜素提取液：用5ml移液管分别取5ml上述89.15μg/ml胡萝卜素提取液于5个棕色广口瓶中，分别向其中加入0ml、5ml、10ml、15ml、20ml二氯

甲烷，得到5个不同浓度胡萝卜素样品液分别为89.15μg/ml、44.58μg/ml、29.72μg/ml、22.29μg/ml、17.83μg/ml，封口，摇匀，备用。

(3) β-胡萝卜素标准液：用电子分析天平称量25mgβ-胡萝卜素用无水乙醇溶解，定容于25ml容量瓶，浓度为1mg/ml，摇匀。用1000μl移液枪分别吸取1ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml上述β-胡萝卜素标准液于5个棕色广口瓶中，分别向其中加入9ml、9.2ml、9.4ml、9.6ml、9.8ml无水乙醇，得到5个不同浓度的β-胡萝卜素样品液分别为100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml，封口，摇匀，备用。

(4) 茶多酚标准液：用电子分析天平称量25mg茶多酚用无水乙醇溶解，定容于25ml容量瓶，浓度为1mg/ml，摇匀。用1000μl移液枪分别吸取1ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml上述茶多酚标准液于5个棕色广口瓶中，分别向其中加入9ml、9.2ml、9.4ml、9.6ml、9.8ml无水乙醇，得到5个不同浓度的茶多酚样品液分别为100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml，封口，摇匀，备用。

(5) 维生素E标准液：用电子分析天平称量25mg维生素E用无水乙醇溶解，定容于25ml容量瓶，浓度为1mg/ml，摇匀。用1000μl移液枪分别吸取1ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml上述维生素E标准液于5个棕色广口瓶中，分别向其中加入9ml、9.2ml、9.4ml、9.6ml、9.8ml无水乙醇，得到5个不同浓度的维生素E样品液分别为100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml，封口，摇匀，备用。

(6) 维生素C标准液：用电子分析天平称量25mg维生素C用无水乙醇溶解，定容于25ml容量瓶，浓度为1mg/ml，摇匀。用1000μl移液枪分别吸取1ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml上述维生素E标准液于5个棕色广口瓶中，分别向其中加入19ml、19.2ml、19.4ml、19.6ml、19.8ml无水乙醇，得到5个不同浓度的维生素E样品液分别为50μg/ml、40μg/ml、30μg/ml、20μg/ml、10μg/ml，封口，摇匀，备用。

2.2.2.2 反应液的配制及数据测定

DPPH·在517nm处有强吸收的特性，加入抗氧化剂后，溶液褪色,用紫外可见分光光度法定量分析自由基清除程度，加抗氧化剂后在波长517nm处吸光度下降表示其对自由基具有消除能力，按表2-2加反应液。

表2-2 DPPH?试验加样表

A0 3mlDPPH?溶液+3ml无水乙醇 Aj 3mlDPPH?溶液+3ml样品溶液

Ai 3ml样品溶液+3ml无水乙醇

用力摇匀，将样品在37 oC下静置20min后, 加入比色皿中进行吸光度的测定, 测出A0、Ai、Aj所表示样品的吸光度值, 清除率按公式(1)计算。

SA(%)=1-(Ai-Aj)/A0×100 (1)

式中: A0——未加提取液的DPPH溶液的吸光度； Ai——加入提取液后的DPPH溶液的吸光度； Aj——DPPH溶液与提取液混合后的吸光度。

第三章实验结果与讨论

3.1 胡萝卜素提取液的抗氧化性

按照DPPH?方法测定不同浓度胡萝卜素提取液的各种反应液在517nm下的吸光度，并计算自由基清除率，结果见表3-1。

表3-1 不同浓度胡萝卜素提取液的自由基清除率