流式细胞仪的发展历史及其原理与应用进展

流式细胞仪的核心部件及其原理与应用进展

姓名：俞辉 学号：2010212534 专业：临床检验诊断学

摘 要 流式细胞术(FCM)，是用流式细胞仪测量液相中的悬浮细胞或微粒的一种现代分析技术。它的发明是流体力学、激光技术、生物学、分子生物学、计算机科学等学科知识凝集的结晶，为人类疾病的检测提供了快速有效的诊断。本文就流式细胞术的发展史、核心部件及其工作原理以及临床应用作如下综述。

关键词 流式细胞术(FCM) 原理 核心部件 应用

引言 流式细胞术(flow cytometry FCM)是用流式细胞仪测量液相中悬浮细胞或微粒的一种现代分析技术。FCM可在细胞保持完整的情况下，精确、快速的对鞘流中的单个细胞进行分子水平的多参数的定性且定量分析。它的发明是流体力学、激光技术、生物学、分子生物学、计算机科学等学科知识凝集的结晶，为人类疾病的检测提供了快速有效的诊断。现代流式细胞术应用广泛，在生物学、临床医学、免疫学、病理学等众多研究领域中有飞速的发展。 1、流式细胞术的发展回顾

回顾文献，早在1930 年，Casperrsson和Thorell就开始研究细胞的计数，1936 年，Caspersson 等将显微分光光度术引入细胞计数中，1949 年，Coulter 提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利，1954 年，Beirne 和Hutchcon 发明光电粒子计数器，1969年，发明第一台荧光细胞检测仪，1972年，对细胞分选器进行新的改进，1975年，Milstein和Kohler发明单克隆抗体技术，进一步促进了流式细胞仪的发展。随着现在光电技术的发展，流式细胞仪已开始向模块化发展，即它的光学元件、检测器元件和电子分析系统可以根据实验要求随意更换。进入21世纪，流式细胞术已经日趋完善，成为分析细胞学领域中无可替代的

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重要工具1-2。 2. 流式细胞仪的核心部件

2.1 流动室及液流驱动系统

各个仪器厂商开放有独立的鞘流液——单细胞悬液，可使待测细胞在流动室里被液体包绕，形成单一细胞鞘流液，当单个细胞通过检测区时，与激光垂直相交，进行检测。 2.2 激光光源及光束形成系统

流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强度和

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照射时间相关，激光是一种相干光源——Ar 激光器，激发波长为488nm，它能提供单波长、高强度、高稳定性的光照，当已结合特异性单克隆抗体的细胞被激光照射后，会产生散射光和发出荧光。在激光束轴邻近范围所散射的激光束，称为前向散射光(FS)，FS的大小与散射该激光的细胞的大小成正比。在激光束轴90°左右区域所散射的激光，称为侧向散射光(SS)，SS的大小与散射该激光的细胞的颗粒成正比。此外，细胞还在激光束轴的各个方向发出荧光(FL)。该荧光信号可用于测定发出该光的细胞的特性。 2.3 光学系统

流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，大致可分为流动室前和流动室后两组。流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔（一般为2片透镜、1个小孔）的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束，使激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度的减少杂散光的干扰；流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成，滤光片的主要作用是将不同波

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长的荧光信号送到不同的光电倍增管。滤光片主要有三类：长通滤片（LP）--只允许特定波长以上的光线通过，短通滤片(SP)-- 只允许特定波长以下的光线通过，带通滤片(BP)-- 只允许特定波长的光线通过，不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管(PMT)，如接收绿色荧光(FITC)的PMT前面配置的滤光片是LP550和BP525， 接收色橙红色荧光(PE)的PMT前面配置的滤光片是LP600和BP575， 接收红色荧光(CY5)的PMT前面配置的滤光片是LP650和BP675。 2.4 信号处理及放大系统

FS 检测器收集前向散射光，其电压脉冲信号与检测器接收到的光的强度成正比。采集透镜/空间滤光片组件只能在流动室的测量区收集SS和FL，使成平行光束。SS由一与光径成45°的488nm的分色常通过滤器进行分离。分光器可将细胞中不同部位的不同荧光分开， 分别送入FL1-FL4荧光检测器。散射光或荧光的强度决定了峰值脉冲的高度，荧光的分布则决定了脉冲的宽度。根据检测器接收到的峰值电压脉冲信号，利用仪器软件，通过增大增益以线性放大积分信号和峰值信号或/和用对数传递线性数据进行放大、调节、分析这些脉冲信号。

2.5 细胞分选系统

细胞流动室上装有超声压电晶体，通电后超声压电晶体发生高频震动，可带动细胞流动室高频震动，使细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴，每秒钟形成液滴上万个。每个液滴中包含着一个样品细胞，液滴中的细胞在形成液滴前已被测量，如符合预定要求则可被充电，在通过偏转板的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定容器中，不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电亦不发生偏转进入中间废液收集器中，从而实现了分选。

3、流式细胞仪的工作原理

由上述的核心部件可知，流式细胞仪主要由五个主要构成部分组成：流动室及液流驱动系统、激光光源及光束形成系统、光学系统、信号处理及放大分析系统以及细胞分选系统。通过流式细胞仪的液流驱动系统，将待检测的细胞标本制成悬浮的单细胞或微粒的鞘流液，然后将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本，在适当的气体压力下，将待测样品转移到细胞流动室，用特制的细胞鞘液(即不含细胞或微粒的缓冲液)在高压下从鞘液管喷出，形成一个圆形的流束(即鞘流)，在激发光激发后产生散色光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管(PMT)接收。在前向小角度散射光，称为前向散射(FSC)，其信号强度基本上反映细胞体积的大小；90°散射光称侧向散射(SSC)，其信号强度可反映细胞部分结构的信息。荧光信号的接收方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表所测细胞膜表面抗原的强度或其细胞内、核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机采集所测量到的各种信号进行计算处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上，以备日后的查询或进一步分析。检测数据的显示视测量参数的不同而有多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其x 轴为测量的散射光或荧光的强度(可以是线性轴，也可以选择对数轴) ，纵轴为相对细胞数。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有256或1024通道数，这视其模/数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的散点图、等高线图或三

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维的立体视图等3。

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4、流式细胞术的临床应用

4.1 监测细胞免疫状态

细胞免疫功能与自身免疫性疾病和恶性肿瘤密切相关。FCM可通过检测细胞亚群来揭示机体免疫功能状态。如根据CD4细胞的绝对值进行临床分型，吞噬细胞在一定条件下可吞噬微球或荧光素标记的金黄色葡萄球菌、酵母菌，应用FCM 测定其荧光值即可作吞噬功能试验。用荧光素标记的羊抗人IgG-Fab 和包被C1q补体的聚苯乙烯微球与血清中的免疫循环复合物作用，根据荧光量的多少可定量测定免疫复合物的含量。同样道理也可以用Raji 细

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胞法测定5-6。

4.2 组织配型与监控移植物的排斥反应

近些年来，器官移植医学发展迅速，人体脏器移植的手术日益增多，FCM有助于快速的主要组织相容性抗原复合物配型测定，并且可以随时监测免疫排斥反应；同时常被用作监

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测免疫抑制剂（如环孢素）的用量，并作为疗程的监控指标7。 4.3 血液系统疾病的检查与分型

FCM广泛用于血液细胞的免疫分型，有助于揭示某些恶性增生性疾病，如白血病、淋巴瘤等的细胞学发病机理，从而提供更为合理的治疗方案。根据免疫表型可将白血病分为急淋(ALL) 及急非淋(ANLL) 两种，ALL 又可分为T 系和B 系多个亚型，尤其对于M9、

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M7、ALL及杂合型急性白血病(HAL )等的诊断具有十分重要的作用9-11。如造血干祖细胞检测，即在治疗恶性血液病时，大剂量化疗或放疗摧毁有病的骨髓后，干细胞移植保证了健康的干祖细胞重建骨髓，产生正常的血细胞，实体肿瘤病人亦可通过干细胞移植抗衡大剂量化疗导致的致死性血液毒性。与大剂量化疗相配合的干细胞移植已在临床大大提高了某些肿瘤病人的长期存活率，如乳腺癌、儿童神经母细胞瘤、卵巢癌等。另外，干细胞移植与再生障碍想贫血、免疫缺隐、血红蛋白病等非恶性造血系统疾病治疗的相关性也正在研究中。残余白血病检测，残余白血病是指经过适当的治疗、疾病缓解后仍残留在病人血中的极少量白血病细胞。通常白血病病人经过化疗后的疾病复发率为60-80%，经过自体或异体骨髓移植后的复发率仍偏高（20-50%）。如果能早期检测到复发的迹象，即白血病细胞的再增生，则可以提前给予病人及时恰当的治疗。依照不同的白血病，选用不同的抗体组合来检测残余白血病。流式细胞术可在一万个骨髓细胞中检测到一个白血病细胞；尤其是TdT 的应用大

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大提高了检测灵敏度4。

4.4 FCM 在血栓与止血研究中的应用：

通过血小板膜糖蛋白的检测可以诊断先天性或获得性血小板疾病如Bernard-Soulier 综合征（CD42b-42a），血小板无力症（CD41-CD61），免疫性血小板减少等。评价血小板活化程度的应用领域包括：缺血性冠状动脉疾病如心绞痛、心肌梗死、血管成形术、心肺旁路术等；缺血性脑血管病如脑梗塞、TIA、脑动脉硬化等；糖尿病；恶性肿瘤；高血压病；高脂蛋白血症；高粘滞血症；抗血小板药物机制研究与疗效监测；吸烟；情绪性应急等。应用实例：CD61/CD62P/PAC-1 三色标记分析血小板活化。 4.5 细胞DNA 定量与细胞周期分析

肿瘤细胞的DNA倍体分析是流式技术另一重要应用，临床上可对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。检测原理：正常人体细胞的DNA含量是二倍体，细胞群体具有特定的增殖比例。通过检测细胞的DNA含量和增殖比例，可以了解细胞群体的倍体性和增殖能力。具体操作时，先将实体组织制备成单细胞悬液，用固定或去污剂在细胞膜上打孔，使DNA特异的荧光染料如PI（碘化丙啶）导入细胞核，PI和DNA缄基对特异结合后上机检测PI的荧光强度，并进行数据分析。 4.6 检测细胞特异性标记物

FCM 不但可以定性分析标记物，而且可以进行定量。用标记已知数量的荧光素分子的标

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准微球作参照，可以计算出每个细胞抗原决定簇的个数。细胞表面受体，如低密度脂蛋白受体、淋巴因子受体、干扰素受体、白细胞介素受体等的定量分析，在冠心病、动脉粥样硬化、恶性肿瘤、自身免疫性疾病的临床应用也相当广泛。细胞内的受体，如雌激素受体、糖皮质激素受体的检测，对于乳腺癌的性激素治疗和糖皮质激素的治疗也有一定的意义。总之，流式细胞术应用极为广泛，随着各种新型流式细胞仪的发展和发明，它将会在生物医学领域有

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更加广阔的应用前景12-13。

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