舒筋活络胶囊抗类风湿性关节炎作用及机理研究

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学位论文

舒筋活络胶囊抗类风湿性关节炎作用及机理研究

莫书蓉

指导教师姓名：孟宪丽教授成都中医药大学

申请学位级别：硕士专业名称：药理学

论文提交时间：２００５年４月论文答辩时间：２００５年５月二ｏｏ五年四月

中文摘要

舒筋活络胶囊具有祛风除湿、舒筋活络、消炎止痛等功效，可治

疗风寒湿痹、筋骨疼痛，类风湿性关节炎等症。本课题应用现代药理学研究手段，观察舒筋活络胶囊对多种炎症、疼痛等动物模型的影响，并采用放射免疫、免疫组化等技术，对舒筋活络胶囊抗类风湿性关节炎作用及机理进行了研究，结果如下：

１、舒筋活络胶囊对急性炎症动物模型炎症的发生和发展有一定

抑制作用，对棉球引起的小鼠肉芽肿的形成等结缔组织增生也有抑制作用。对免疫性动物关节炎模型（大鼠佐剂性关节炎，ａｄｊｕｖａｎｔａｒｔｈｒｉｔｉｓ从）的原发性炎症及继发性关节炎也有明显的抑制作用。

２、舒筋活络胶囊对醋酸、热板所致动物疼痛反应有明显抑制作

用，镇痛效果明显。

３、舒筋活络胶囊对２，４一二硝基氯苯（ＤＮｃＢ）诱导的小鼠迟发

性变态反应（ＤＴＨ）以及对小鼠溶血素抗体生成等实验动物免疫功能有较强的抑制作用。

４、舒筋活络胶囊抗类风湿性关节炎（ＲＡ）的作用机理可能与减

少ＡＡ大鼠血清Ｎ０含量，降低滑膜组织中ＴＮＦ一Ⅱ、ＰＧＥ２含量有关，使滑膜炎性细胞ｆａｓ蛋白表达上调，ｂｃ卜２蛋白表达下调有关。

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关键词：舒筋活络胶囊、佐剂性关节炎、作用机理、细胞因子、ｆａｓ蛋白、ｂｃｌ一２蛋白

Ａｂｓｔｒａｃｔ

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１．Ｔｈｅａ１１ｔｉ－ｉｎｆｌａｎ帅ａｔｏｒｙｔｅｓｔＳｈｏｗｅｄｔｈａｔｓｈｕｊｉｌｌｌｌｕｏｌｕｏｃａｐｓｕｌｅｓｈａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｌｌｔ

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３．ＴｈｅｉｍｍＩｕｌｅｋｓｔｒｅｖｅ“ｅｄｔｈａｔＳｈｕｉｉｎｈｕｏＩｕｏＣａｐｓｕｌｅｈａｓｓｉｇｎｍｃａＩｌｔｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ

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４．ＴｈｅｒａｔａｄｊｕｖａｎｔａｒｔｈｒｉｔｉｓｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＳｈｕｊｉｎｈｕｏｌｕｏｃ印ｓｕＩｅｈａＳ

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类风湿关节炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ），是以对称性、多

发性关节炎为主要表现的全身性疾病，我国的患病率为Ｏ．３％～Ｏ．４％。任何年龄均可发病，多见于３０～５０岁女性Ⅲ。发病年龄８０％在２０～４５岁，女性是男性的３倍。自１８００年ＲＡ被首次认定以来，全球平均有Ｏ．３～２．１％的人群罹患此病，所造成的活动功能障碍是非ＲＡ病人的６倍，其生命预期值与正常人群相比降低１５～２０年ｎ¨”。患ＲＡ因种族、地理环境不同而有异，据统计，在美国６５岁以上ＲＡ发生率高达１０％“１。该病早期由于关节的衬里和被覆的肌腱炎症造成关节肿胀、疼痛、活动困难，约有１０％～１５％患者病情进展迅速，在两年内出现关节软骨、骨破坏和畸形。约７０％患者的多关节炎呈反复、周期性发作，并逐渐加重，最终导致关节功能减退和丧失。ＲＡ是一种慢性、致残率很高的常见病。据美国统计，ＲＡ在所有丧失劳动能力疾病中，占第二位“１。

类风湿性关节炎属于祖国医学中的“痹证”范畴，其病因较复杂，

在《素问 痹论》中曾提出：“风寒湿三气杂至合而为痹”，后来又有医家从刁ｉ同侧面充实。中医药治疗ＲＡ有复方、单味药和外治等方法，取得了较好疗效。现代医学认为ＲＡ发病机制与感染、遗传、内分泌等因素有关，主要病理改变为关节滑膜及周围结缔组织异常增生，关节软骨进行性破坏为主的慢性自身免疫性疾病。以滑膜衬里层细胞增生，血管翳形成，单核细胞浸润，进而软骨侵蚀和关节破坏‘６１。西医以非甾体抗炎药及生物制剂应用最多，但因长期大剂量应用此类药物，其不良反应较为严重，并且大部分生物制剂需要高度纯化的蛋白质，不仅价格昂贵，而且口服活性差，在体内又很快被消除。

舒筋活络胶囊具有祛风除湿、舒筋活络、消炎止痛等功效，主治

风寒湿痹、筋骨疼痛，类风湿性关节炎等症。本课题运用现代药理学研究手段，观察舒筋活络胶囊抗炎、镇痛作用及对免疫功能的影响，并对其抗ＲＡ药理作用及机理进行了探讨，为其临床应用提供药理学依据。

实验研究

１、实验材料

１．１实验药品与试剂

舒筋活络胶囊处方由五加皮、威灵仙、羌活等中药组成，由四川

省中药研究所中试中心提供，批号：０３ｌ００９。实验前用蒸馏水稀释成大鼠给药浓度为３３．２％、１６．６％、８．３％（ｇ生药／１００ｍ１），灌胃（ｉｇ）体积为１ｍ１／１００９体重。小鼠给药浓度为１６．６％、８．３％、４．１５％（ｇ生药／ｌＯＯｍｌ），灌胃（ｉｇ）体积为Ｏ．２ｍｌ／１０９体重。实验分高、中、低剂量，分别相当于临床成人（６０ｋｇ）日用量的２０、１０、５倍。

正清风痛灵：西安利君制药股份有限公司，批号：０３１０３７９；

地塞米松磷酸钠注射液：湖北天药药业股份有限公司，批号：

２００３０８１３：

盐酸吗啡注射液：沈阳第一制药厂，批号：９５０３０ｌ；

硫酸庆大霉素注射液：８万单位／２ｍ１，批号：０２０４１３１，石家庄

制药集团公司；

注射用环磷酰胺：上海华联制药有限公司，批号：０３０８０１；

卡介苗佐剂：北京生物制品研究所，批号：２００４０１１４，６０ｍｇ／支：

不完全佐剂：１ｍｇ／ｍ１ｓｉｇｍａ公司，与卡介苗佐剂配制成１０ｍｇ／ｍｌ；

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角叉菜胶：（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）ＳｉｇＩＩｌａ公司，以生理盐水配制成浓度

为１％的溶液；

伊文思兰：（Ｅｖａｎｓｂｌｕｅ）上海化学试剂采购供应站，进口分装，

９７０４０ｌ：

２，４一二硝基氯苯：上海试剂一厂，８９０９０１：

ＮＯ试剂盒（硝酸还原酶法）：南京建成生物工程研究所，０３０８２２；ＴＮＦＲＩＡＫｉｔ：解放军总医院科技开发中心放免所；

ＰＧＥ。ＲＩＡＫｉｔ：解放军总医院科技开发中心放免所：

Ｂｃ卜２试剂：一抗：ｂｃ卜２（ｃ一２）ｍｏｕｓｅｍ。ｎｏｃｌｏｎａｌＩｇＧｌｓａｎｔａ

ｃｒｕｚ公司；二抗及相应试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司；

ｆａｓ试剂：一抗：ｆａｓ（Ａ一２０）ｒａｂｂｉｔｐｏｌｙｃｌｏｎａｌＩｇＧｓａｎｔａｃｒｕｚ

公司；二抗及相应试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司：

１．２实验动物：

小鼠：昆明种，雌雄兼用，体重２０±２９，由成都中医药大学实

验动物中心提供，动物合格证号：Ｊ｜『实动管第１１号。

大鼠：ＳＤ，全雄，体重１５０一１８０９，由成都中医药大学实验动物

中心提供，动物合格证号：川实动管第１１号。

１．３主要仪器：

热板测痛仪：ＧＪ一８４０２型，浙江宁海县白石电子医药仪器厂：

电子天平：沈阳龙腾电子称量仪器有限公司，型号：ＬＤ６００一１，

精度：０．１９；

电子天平：ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ，ＢＰ６１，精度：０．１ｍｇ；

分光光度计：上海棱光技术有限公司，ｓｅｐｅｃｔｒｕｍｌａｂ，２２ｐｃ；

ＸＨ一６０ｌＯＡ型Ｙ计数仪：西安国营二六二厂；

ＦＪ一２ｌＯＴＰ型液体闪烁计数器：西安国营二六二厂：

奥林巴斯Ｂｘ一５０光学显微镜：日本；

Ｍｉａｓ一２０００图形分析系统：四川大学图像图形研究所。

１．４统计方法：

使用ｓｐｓｓｌＯ．０统计软件包处理实验数据。正态分布数据两两比较采用成组ｔ检验，多组比较采用方差分析。

２、方法与结果

２．１抗炎实验‘７１‘８’

２．１．１对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

取健康雄性小鼠５０只，按体重随机分为５组。第一组灌胃蒸馏

水作为空白对照组；第二至四组分别灌胃舒筋活络胶囊高、中、低浓度的药液，作为给药组；第五组腹腔注射Ｏ．００５９／ｋｇ地塞米松作为阳性对照组。每天给药１次，连续３天。末次给药３０ｍｉｎ后，将２０ｕ１二甲苯涂于小鼠左耳廓两面致炎，右耳不涂为对照，致炎１ｈ后处死动物，用直径８１１１Ｉｎ的打孔器在两耳对称位置取下左右耳片称重，耳廓肿胀度（ｍｇ）＝左耳片重量一右耳片重量。结果见表ｌ。

表ｌ舒筋活络胶囊对小鼠耳廓肿胀度的影响（Ｘ±ｓＤ）

与空白对照组比较：料ｐ＜Ｏ．０１，丰ｐ＜０．０５

表１结果表明：舒筋活络胶囊高剂量组能明显抑制二甲苯所致的

小鼠耳廓肿胀。

２．１．２对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影晌

选取健康雄性小鼠５５只，按体重随机分成５组，第一组灌胃给

予蒸馏水作为空白对照组；第二至四组分别灌胃给予舒篾活络胶囊高、中、低浓度的药液作为给药组；第五组腹腔注射地塞米松Ｏ．００５ｇ／ｋｇ每天给药１次，连续３天，末次给药３０ｍｉｎ后，尾静脉注射１％

伊文思兰生理盐水溶液０．１ｍ１／ｌＯｇ，随即腹腔注射Ｏ．６％醋酸０．１ｍｌ／ｌＯｇ。２０ｍｉｎ后将小鼠脱颈处死，剪开腹腔，用６ｍｌ生理盐水冲洗腹腔，合并冲洗液离心（２０００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ后取上清液，在７２１型分光光度计５９０ｎｍ处测吸收值（ＯＤ）。结果见表２。

表２舒筋活络胶囊对小鼠毛细血管通透性的影响（ｘ±ｓＤ）

与空白对照组比较：木料ｐ＜Ｏ．００１，料ｐ＜Ｏ．０１，水ｐ＜０．０５

表２结果表明：舒筋活络胶囊高、中、低剂量组能明显抑制醋酸

所致的小鼠腹腔毛细血管通透性。

２．１．３对蛋清致大鼠足肿胀的影响

取健康雄性大鼠５０只，按体重随机分为５组。第一组灌胃蒸馏

水作为空白对照组；第二至四组分别灌胃舒筋活络胶囊高、中、低浓度的药液，作为给药组；第五组腹腔注射Ｏ．００５９／ｋｇ地塞米松作为阳性对照组。每天给药１次，连续给药３天。致炎前在各鼠右后足踝关节处作标记，按足容积法测定各鼠右后足容积两次，取平均值作为各鼠致炎前正常足容积。末次给药后３０ｍｉｎ，每只大鼠右后足跖皮下进针至踝关节附近皮下，注射ｌＯ％新鲜鸡蛋清溶液０．１ｍ１／只致炎，分别于致炎后３０、６０、１２０、２４０ｍｉｎ，按容积法测定各鼠右后足容积，观察致炎后大鼠足容积的变化值。计算肿胀度，肿胀度（ｍ１）＝致炎后

足容积一致炎前足容积。结果见表３。

２．１．４对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影晌

取健康雄性大鼠５０只，按体重随机分为５组。第一组灌胃蒸馏

水作为空白对照组：第二至四组分别灌胃舒筋活络胶囊高、中、低浓度和原剂型高、中浓度的药液，作为给药组；第五组腹腔注射Ｏ．００５９／ｋｇ地塞米松作为阳性对照组。每天给药１次，连续３天。实验前在各鼠右后足踩关节处作标记，按足容积法测定各鼠足容积两次，取平均值作为各鼠致炎前正常足容积。末次给药后３０ｍｉｎ，每只大鼠右后足跖皮下进针至踝关节附近皮下，注射１％角叉菜胶０．１ｍｌ致炎，同时灌胃生理盐水４ｍ１／ｌｏｏｇ行水负荷，分别于致炎后６０、１２０、２４０、３００、３６０ｍｉｎ，同法测定各鼠右后足容积，观察致炎前后大鼠足容积的变化值。计算肿胀度，肿胀度（ｍ１）＝致炎后足容积一致炎前足容积。结果见表４。

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２．１．５对小鼠棉球肉芽肿的影响

取健康雄性小鼠５０只，将左侧腹股沟皮肤消毒后，用眼科剪剪

开一小口，以眼科镊将高压灭菌棉球（１０±０．５ｍｇ，庆大霉素浸润）植入小鼠左侧腋窝皮下。然后按体重随机分为５组。第一组灌胃蒸馏水作为空白对照组；第二至四组分别灌胃舒筋活络胶囊高、中、低浓度的药液，作为给药组；第五组腹腔注射Ｏ．００５９／ｋｇ地塞米松作为阳性对照组。每天给药１次，连续７天。末次给药２４ｈ后，将棉球连同周围结缔组织一起取出，剔除脂肪，６０℃烘箱中烘干、称重，将称得的重量减去棉球的原重量即得肉芽肿重量，并计算其肉芽指数（ｍｇ／ｌＯｇ）一肉芽重／体重×１０。结果见表５。

表５舒筋活络胶囊对小鼠棉球肉芽肿的影响（ｘ±ｓＤ）

与空白对照组比较：术ｐ＜Ｏ．０５

表５结果表明：舒筋活络胶囊高、中剂量组能明显抑制小鼠肉芽

肿的形成。

２．２镇痛实验¨１

２．２．１对热板所致小鼠疼痛反应的影响

取健康雌性小鼠，利用热板测痛仪（热板温度为５５±０．５℃），

筛选两次痛阈平均值（痛阈值为将小鼠放置热板上至其舔后足的时间）低于３０ｓ并大于５ｓ者为合格动物。取合格动物５０只，按体重随机分为５组。第一组灌胃蒸馏水（０．２ｍ１／ｌＯｇ）作为空白对照组；第

二至四组分别灌胃舒筋活络胶囊高、中、低浓度的药液，作为给药组；第五组腹腔注射０．００５９／ｋｇ盐酸吗啡作为阳性对照组。给药前及给药后１５、３０、４５、６０、９０ｍｉｎ分别测定各鼠痛阀值，并计算镇痛百分率，镇痛百分率＝（给药后痛阈值一给药前痛闽值）／给药前痛阈值×１００％。结果见表６。

２．２．２对醋酸所致小鼠扭体反应的影响

取健康小鼠５０只，雌雄各半，按体重随机分为５组。第一组灌胃蒸馏水作为空白对照组；第二至四组分别灌胃舒筋活络胶囊高、中、低浓度的药液，作为给药组；第五组腹腔注射Ｏ．００５９／ｋｇ盐酸吗啡作为阳性对照组。除阳性对照组于实验前给药１次外，其余各组每天给药１次，连续３天。末次给药３０ｍｉｎ后，给小鼠腹腔注射Ｏ．６％醋酸溶液０．２ｍ１／只，立即计时，观察并记录小鼠１５ｍｉｎ内出现扭体反应的时间及次数（以小鼠腹部凹陷，双后肢伸展为扭体反应指标）。结果见表７。

表７舒筋活络胶囊对醋酸致小鼠扭体反应的影响（ｘ±ｓＤ）

与空白对照组比较：料‘木ｐ＜Ｏ．００１，料：ｐ＜Ｏ．０１，术ｐ＜０．０５

表７结果表明：舒筋活络胶囊高、中剂量组明显抑制醋酸所致的小鼠疼痛，延长潜伏期。

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２．３影响免疫功能的实验

２．３，１对２，４一二硝基氯苯（ＤＮｃＢ）诱导小鼠皮肤迟发性过敏反应（ＤＴＨ）的影晌拈１

取健康昆明种小鼠５０只，雌雄各半，称重，随机分为５组。第

一组灌胃蒸馏水作为空白对照组；第二至四组分别灌胃舒筋活络胶囊高、中、低浓度的药液，作为给药组；第五组隔天皮下注射０．０４９／ｋｇ环磷酰胺作为阳性对照组。其余各组每天给药１次，连续灌胃给药７天。操作步骤如下：ｌ、ＤＮｃＢ配制：致敏或攻击前以丙酮和麻油１：１为溶剂新鲜配制；２、致敏：给药前１ｄ每鼠腹部脱毛３×３ｃｍ２；给药当日将５０ｐ１１％ＤＮｃＢ溶液均匀涂抹于小鼠腹部，于次日再强化１次；３、ＤＴＨ的产生与测定：致敏７ｄ后，将１％ＤＮｃＢ溶液２０肛１均匀涂抹于每只小鼠右耳进行攻击，２４ｈ后脱颈处死动物，称重，以８ｍｍ打孔器取两耳同一部位耳片，称重，并取胸腺、脾脏称重，以左右耳片重量之差表示肿胀度，计算脾指数＝脾重（ｍｇ）／体重（ｇ）；胸腺指数一胸腺重量（ｍｇ）／体重（ｇ）。对结果进行统计处理，结果见表８。

表８舒筋活络胶囊对ＤＮＣＢ诱导小鼠ＤＴＨ的影响（Ｘ±ｓＤ）

与空白对照组比较：：Ｉｃ料ｐ＜ｏ．００１，：ｌ：术ｐ＜０．０ｌ，半ｐ＜Ｏ．０５

表８结果表明：舒筋活络胶囊高、中剂量组能明显抑制ＤＮＣＢ诱导的小鼠ＤＴＨ反应。其高剂量组对小鼠胸腺生长有抑制作用。

２．３．２对小鼠溶血素抗体生成的影响ｎ０１

２．３．２．１鸡血细胞的制备：无菌条件下，取鸡血于盛有Ａ１ｓｅｖｅｒ’ｓ

溶液的灭菌锥形瓶中，鸡血与Ａ１ｓｅｖｅｒ’ｓ溶液比例为ｌ：５，混匀。４℃冰箱保存。使用时以生理盐水洗涤３次，前两次离心速度１５００ｒ／ｍｉｎ，离心５ｍｉｎ，弃上清液和界面白细胞层，最后应连续两次离心（２０００ｒ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ），直至红细胞压积值恒定，按比值用生理盐水配成所需浓度的红细胞悬液。

２．３．２．２免疫及给药：取昆明种小鼠５０只，雌雄各半，按体重

随机分为５组。给药后第１天每只小鼠腹腔注射５％鸡红细胞悬液Ｏ．５ｍ１／只进行免疫。第一组给等体积生理盐水作为空白对照组；第二至四组灌胃舒筋活络胶囊高、中、低浓度的药液作为给药组，连续给药７天；阳性对照组分别于第２、４、６天皮下注射环磷酰胺Ｏ．０４９／ｋｇ，免疫后７天即摘除眼球取血进行溶血素抗体测定。

２．３．２．３溶血素抗体测定：取血约１ｈ后，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，

取血清ｌＯｍ用生理盐水１ｍ１稀释１００倍，然后取稀释血清ｌｍｌ于试管内，与５％鸡红细胞悬液０．５ｍｌ和１：ｌＯ稀释后的新鲜豚鼠血清Ｏ．５ｍｌ混合，混匀，立即放入３７℃恒温水浴锅恒温３０ｍｉｎ，然后立即取出放入冰浴中终止反应，离心，取上清液于５４０ｎｍ处比色，以１ｍ１生理盐水加５％鸡红细胞悬液Ｏ．５ｍｌ，１０％豚鼠血清０．５ｍｌ作为空白对照，分别测定各管光密度值（ＯＤ）。结果见表９。１４

表９舒筋活络胶囊对小鼠溶血素抗体生成的影响（ｘ＋ｓＤ）

与空白对照组比较：，木木ｐ＜０．０ｌ，术ｐ＜０．０５

表９结果表明：舒筋活络胶囊高、中剂量组能明显抑制小鼠溶

血素抗体生成。

２．４大鼠佐剂－陛关节炎（ＡＡ）的实验

２．４．１造模

取健康雄性ｓＤ大鼠（１５０一１８０９）６０只，按体重随机分为６组，

每组１０只，第一组为正常对照组；第二组为造模对照组；第三组为阳性对照组（正清风痛宁４０ｍｇ／ｋｇ）；第四至六组舒筋活络胶囊高、中、低剂量组。予致炎前３天灌胃给药。用容积法测定正常大鼠双侧后肢足容积，参照文献“¨方法造模，除空白对照组外，其余各组每鼠右后足趾皮内注射Ｏ．１Ⅲｌ弗氏完全佐剂（１０ｍｇ／ｍ１）。

２，４．２对ＡＡ大鼠原发性关节肿胀的影响

造模后６、１２、２４、３０、４８、５４、６０、７２ｈ测定致炎侧足容积，

以其致炎前后差值表示其肿胀度，观察药物对ＡＡ大鼠急性免疫炎症的影响。结果见表１０。

２．４．３对ＡＡ大鼠继发－胜关节肿胀的影响

造模后１２、１５、１８、２１、２４、３０ｄ测定非致炎足（左足）的容积变化，以观察药物对从大鼠继发性关节肿胀的影响。结果见表１ｌ。

继发症状见附图一至六。

２．４．４对ＡＡ大鼠体重的影响

造模后每７天测一次体重并记录体重变化（体重变化＝每次所测

体重一第１天所测体重）。结果见表１２；

表１２舒筋活络胶囊对从大鼠体重的影响（ｘ±ｓＤ）

与模型对照组比较：料ｐ＜０．Ｏｌ，木ｐ＜Ｏ．０５，

表１２结果表明：舒筋活络胶囊高剂量组在第２ｌ天左右对从大鼠体重有明显增加作用。

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