舒筋活络胶囊抗类风湿性关节炎作用及机理研究

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学位论文

舒筋活络胶囊抗类风湿性关节炎作用及机理研究

莫书蓉

指导教师姓名:孟宪丽教授成都中医药大学

申请学位级别:硕士专业名称:药理学

论文提交时间:2005年4月论文答辩时间:2005年5月二oo五年四月

中文摘要

舒筋活络胶囊具有祛风除湿、舒筋活络、消炎止痛等功效,可治

疗风寒湿痹、筋骨疼痛,类风湿性关节炎等症。本课题应用现代药理学研究手段,观察舒筋活络胶囊对多种炎症、疼痛等动物模型的影响,并采用放射免疫、免疫组化等技术,对舒筋活络胶囊抗类风湿性关节炎作用及机理进行了研究,结果如下:

1、舒筋活络胶囊对急性炎症动物模型炎症的发生和发展有一定

抑制作用,对棉球引起的小鼠肉芽肿的形成等结缔组织增生也有抑制作用。对免疫性动物关节炎模型(大鼠佐剂性关节炎,adjuvantarthritis从)的原发性炎症及继发性关节炎也有明显的抑制作用。

2、舒筋活络胶囊对醋酸、热板所致动物疼痛反应有明显抑制作

用,镇痛效果明显。

3、舒筋活络胶囊对2,4一二硝基氯苯(DNcB)诱导的小鼠迟发

性变态反应(DTH)以及对小鼠溶血素抗体生成等实验动物免疫功能有较强的抑制作用。

4、舒筋活络胶囊抗类风湿性关节炎(RA)的作用机理可能与减

少AA大鼠血清N0含量,降低滑膜组织中TNF一Ⅱ、PGE2含量有关,使滑膜炎性细胞fas蛋白表达上调,bc卜2蛋白表达下调有关。

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关键词:舒筋活络胶囊、佐剂性关节炎、作用机理、细胞因子、fas蛋白、bcl一2蛋白

Abstract

shujinhuoluoofdispelIingwindaIlddampness,a11d

rcliev主ngpain8硒mcapsuleh骶the缸1ctions

thebodyThisstudyaimsatex锄i芏l至ngitsprincipa}

向nction-relatedphalmicefrecta11ditsphannacologicalacdons,andtoprovidesomephamlacologicaleVidenceforclinical印plication.Int11estudy’wehaVeinVestigatepha啪acolo卫icaleff色ctsandmechanismbymeallsofadvancedmodemscientmcrcsearchmethodssuchas:mdioimmunoassay、immunohistochemistlyctc.meresultsshowedas:

1.Thea11ti-inflan帅atorytestShowedthatshujilllluoluocapsuleshassignificallt

preventingefrectondimethylbenzene—inducedmouseearswellinganddeceasingef&ctoneggwhite—inducedrat凫etswellin舀ithasstronginhibitiononcarra鼋eenan—inducedratfeetswellin窟andobviousprevemngeHlectonmousegranulationtissuefoⅡnation,andithassig皿incantantagonistice任bctonaceticacid—inducedmouseceliacpemeibil毋.

2.TheanalgesictestprovedthatShu{inhuoluoCapsulehassign讯caIltrelievin卫

efrectonhot—plate.inducedrrlousepainresponseindi丘brenttimeperiod.A1so,ithasnotableactiononrelievingaceticacid—inducedmousepainandsignificanⅡyextendthedeIitescence.

3.TheimmIulekstreve“edthatShuiinhuoIuoCapsulehassignmcaIltinhibition

on2,4.dinitrochlorobenzene(DNCB)一inducedmouseearDTHresponse,aIldithaspreventingactiononmou5ethymusgrowth.Also,ithasstronginhibitiononmousehaemol”icaIltibodyproduction.

4.TheratadjuvantarthritistestshowedthatShujinhuoluoc印suIehaS

signjficantinhibitiononAArats’anllral

secondary珊咀删swellingswellingindiabrenttimeperiod,ithas

obviousinhibitingeffbctonAAratandincreasingef诧ctonthew翻g}ltofAArat,whichisrathersi甜i行cantinabout21days.A1so,{thasstron2mhmitiononadrenalgland,whileitse丘bctonNOdecreasedasthedosechan窖ed.Finally'ithasnotabledecreasingefrectonsynovialtissuePGE2a11dTNF—n.Itincreasedfasproteinarlddecreasedbcl.2pmtcininsynovitiscells,atldinducedsynovitiscellstoapoptosis.

Keywords:ShujinhuoIuoCapsuleAdjuVantRrthritis(RA)

mechan.smofanti.RACytokine(cK)

fasproteinbcl-2protein

日q蟊

类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA),是以对称性、多

发性关节炎为主要表现的全身性疾病,我国的患病率为O.3%~O.4%。任何年龄均可发病,多见于30~50岁女性Ⅲ。发病年龄80%在20~45岁,女性是男性的3倍。自1800年RA被首次认定以来,全球平均有O.3~2.1%的人群罹患此病,所造成的活动功能障碍是非RA病人的6倍,其生命预期值与正常人群相比降低15~20年n¨”。患RA因种族、地理环境不同而有异,据统计,在美国65岁以上RA发生率高达10%“1。该病早期由于关节的衬里和被覆的肌腱炎症造成关节肿胀、疼痛、活动困难,约有10%~15%患者病情进展迅速,在两年内出现关节软骨、骨破坏和畸形。约70%患者的多关节炎呈反复、周期性发作,并逐渐加重,最终导致关节功能减退和丧失。RA是一种慢性、致残率很高的常见病。据美国统计,RA在所有丧失劳动能力疾病中,占第二位“1。

类风湿性关节炎属于祖国医学中的“痹证”范畴,其病因较复杂,

在《素问 痹论》中曾提出:“风寒湿三气杂至合而为痹”,后来又有医家从刁i同侧面充实。中医药治疗RA有复方、单味药和外治等方法,取得了较好疗效。现代医学认为RA发病机制与感染、遗传、内分泌等因素有关,主要病理改变为关节滑膜及周围结缔组织异常增生,关节软骨进行性破坏为主的慢性自身免疫性疾病。以滑膜衬里层细胞增生,血管翳形成,单核细胞浸润,进而软骨侵蚀和关节破坏‘61。西医以非甾体抗炎药及生物制剂应用最多,但因长期大剂量应用此类药物,其不良反应较为严重,并且大部分生物制剂需要高度纯化的蛋白质,不仅价格昂贵,而且口服活性差,在体内又很快被消除。

舒筋活络胶囊具有祛风除湿、舒筋活络、消炎止痛等功效,主治

风寒湿痹、筋骨疼痛,类风湿性关节炎等症。本课题运用现代药理学研究手段,观察舒筋活络胶囊抗炎、镇痛作用及对免疫功能的影响,并对其抗RA药理作用及机理进行了探讨,为其临床应用提供药理学依据。

实验研究

1、实验材料

1.1实验药品与试剂

舒筋活络胶囊处方由五加皮、威灵仙、羌活等中药组成,由四川

省中药研究所中试中心提供,批号:03l009。实验前用蒸馏水稀释成大鼠给药浓度为33.2%、16.6%、8.3%(g生药/100m1),灌胃(ig)体积为1m1/1009体重。小鼠给药浓度为16.6%、8.3%、4.15%(g生药/lOOml),灌胃(ig)体积为O.2ml/109体重。实验分高、中、低剂量,分别相当于临床成人(60kg)日用量的20、10、5倍。

正清风痛灵:西安利君制药股份有限公司,批号:0310379;

地塞米松磷酸钠注射液:湖北天药药业股份有限公司,批号:

20030813:

盐酸吗啡注射液:沈阳第一制药厂,批号:95030l;

硫酸庆大霉素注射液:8万单位/2m1,批号:0204131,石家庄

制药集团公司;

注射用环磷酰胺:上海华联制药有限公司,批号:030801;

卡介苗佐剂:北京生物制品研究所,批号:20040114,60mg/支:

不完全佐剂:1mg/m1sigma公司,与卡介苗佐剂配制成10mg/ml;

角叉菜胶:(carrageenan)SigIIla公司,以生理盐水配制成浓度

为1%的溶液;

伊文思兰:(Evansblue)上海化学试剂采购供应站,进口分装,

97040l:

2,4一二硝基氯苯:上海试剂一厂,890901:

NO试剂盒(硝酸还原酶法):南京建成生物工程研究所,030822;TNFRIAKit:解放军总医院科技开发中心放免所;

PGE。RIAKit:解放军总医院科技开发中心放免所:

Bc卜2试剂:一抗:bc卜2(c一2)mousem。noclonalIgGlsanta

cruz公司;二抗及相应试剂盒:北京中杉金桥生物技术有限公司;

fas试剂:一抗:fas(A一20)rabbitpolyclonalIgGsantacruz

公司;二抗及相应试剂盒:北京中杉金桥生物技术有限公司:

1.2实验动物:

小鼠:昆明种,雌雄兼用,体重20±29,由成都中医药大学实

验动物中心提供,动物合格证号:J|『实动管第11号。

大鼠:SD,全雄,体重150一1809,由成都中医药大学实验动物

中心提供,动物合格证号:川实动管第11号。

1.3主要仪器:

热板测痛仪:GJ一8402型,浙江宁海县白石电子医药仪器厂:

电子天平:沈阳龙腾电子称量仪器有限公司,型号:LD600一1,

精度:0.19;

电子天平:sartorious,BP61,精度:0.1mg;

分光光度计:上海棱光技术有限公司,sepectrumlab,22pc;

XH一60lOA型Y计数仪:西安国营二六二厂;

FJ一2lOTP型液体闪烁计数器:西安国营二六二厂:

奥林巴斯Bx一50光学显微镜:日本;

Mias一2000图形分析系统:四川大学图像图形研究所。

1.4统计方法:

使用spsslO.0统计软件包处理实验数据。正态分布数据两两比较采用成组t检验,多组比较采用方差分析。

2、方法与结果

2.1抗炎实验‘71‘8’

2.1.1对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

取健康雄性小鼠50只,按体重随机分为5组。第一组灌胃蒸馏

水作为空白对照组;第二至四组分别灌胃舒筋活络胶囊高、中、低浓度的药液,作为给药组;第五组腹腔注射O.0059/kg地塞米松作为阳性对照组。每天给药1次,连续3天。末次给药30min后,将20u1二甲苯涂于小鼠左耳廓两面致炎,右耳不涂为对照,致炎1h后处死动物,用直径8111In的打孔器在两耳对称位置取下左右耳片称重,耳廓肿胀度(mg)=左耳片重量一右耳片重量。结果见表l。

表l舒筋活络胶囊对小鼠耳廓肿胀度的影响(X±sD)

与空白对照组比较:料p<O.01,丰p<0.05

表1结果表明:舒筋活络胶囊高剂量组能明显抑制二甲苯所致的

小鼠耳廓肿胀。

2.1.2对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影晌

选取健康雄性小鼠55只,按体重随机分成5组,第一组灌胃给

予蒸馏水作为空白对照组;第二至四组分别灌胃给予舒篾活络胶囊高、中、低浓度的药液作为给药组;第五组腹腔注射地塞米松O.005g/kg每天给药1次,连续3天,末次给药30min后,尾静脉注射1%

伊文思兰生理盐水溶液0.1m1/lOg,随即腹腔注射O.6%醋酸0.1ml/lOg。20min后将小鼠脱颈处死,剪开腹腔,用6ml生理盐水冲洗腹腔,合并冲洗液离心(2000r/min)10min后取上清液,在721型分光光度计590nm处测吸收值(OD)。结果见表2。

表2舒筋活络胶囊对小鼠毛细血管通透性的影响(x±sD)

与空白对照组比较:木料p<O.001,料p<O.01,水p<0.05

表2结果表明:舒筋活络胶囊高、中、低剂量组能明显抑制醋酸

所致的小鼠腹腔毛细血管通透性。

2.1.3对蛋清致大鼠足肿胀的影响

取健康雄性大鼠50只,按体重随机分为5组。第一组灌胃蒸馏

水作为空白对照组;第二至四组分别灌胃舒筋活络胶囊高、中、低浓度的药液,作为给药组;第五组腹腔注射O.0059/kg地塞米松作为阳性对照组。每天给药1次,连续给药3天。致炎前在各鼠右后足踝关节处作标记,按足容积法测定各鼠右后足容积两次,取平均值作为各鼠致炎前正常足容积。末次给药后30min,每只大鼠右后足跖皮下进针至踝关节附近皮下,注射lO%新鲜鸡蛋清溶液0.1m1/只致炎,分别于致炎后30、60、120、240min,按容积法测定各鼠右后足容积,观察致炎后大鼠足容积的变化值。计算肿胀度,肿胀度(m1)=致炎后

足容积一致炎前足容积。结果见表3。

2.1.4对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影晌

取健康雄性大鼠50只,按体重随机分为5组。第一组灌胃蒸馏

水作为空白对照组:第二至四组分别灌胃舒筋活络胶囊高、中、低浓度和原剂型高、中浓度的药液,作为给药组;第五组腹腔注射O.0059/kg地塞米松作为阳性对照组。每天给药1次,连续3天。实验前在各鼠右后足踩关节处作标记,按足容积法测定各鼠足容积两次,取平均值作为各鼠致炎前正常足容积。末次给药后30min,每只大鼠右后足跖皮下进针至踝关节附近皮下,注射1%角叉菜胶0.1ml致炎,同时灌胃生理盐水4m1/loog行水负荷,分别于致炎后60、120、240、300、360min,同法测定各鼠右后足容积,观察致炎前后大鼠足容积的变化值。计算肿胀度,肿胀度(m1)=致炎后足容积一致炎前足容积。结果见表4。

三m0葛

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2.1.5对小鼠棉球肉芽肿的影响

取健康雄性小鼠50只,将左侧腹股沟皮肤消毒后,用眼科剪剪

开一小口,以眼科镊将高压灭菌棉球(10±0.5mg,庆大霉素浸润)植入小鼠左侧腋窝皮下。然后按体重随机分为5组。第一组灌胃蒸馏水作为空白对照组;第二至四组分别灌胃舒筋活络胶囊高、中、低浓度的药液,作为给药组;第五组腹腔注射O.0059/kg地塞米松作为阳性对照组。每天给药1次,连续7天。末次给药24h后,将棉球连同周围结缔组织一起取出,剔除脂肪,60℃烘箱中烘干、称重,将称得的重量减去棉球的原重量即得肉芽肿重量,并计算其肉芽指数(mg/lOg)一肉芽重/体重×10。结果见表5。

表5舒筋活络胶囊对小鼠棉球肉芽肿的影响(x±sD)

与空白对照组比较:术p<O.05

表5结果表明:舒筋活络胶囊高、中剂量组能明显抑制小鼠肉芽

肿的形成。

2.2镇痛实验¨1

2.2.1对热板所致小鼠疼痛反应的影响

取健康雌性小鼠,利用热板测痛仪(热板温度为55±0.5℃),

筛选两次痛阈平均值(痛阈值为将小鼠放置热板上至其舔后足的时间)低于30s并大于5s者为合格动物。取合格动物50只,按体重随机分为5组。第一组灌胃蒸馏水(0.2m1/lOg)作为空白对照组;第

二至四组分别灌胃舒筋活络胶囊高、中、低浓度的药液,作为给药组;第五组腹腔注射0.0059/kg盐酸吗啡作为阳性对照组。给药前及给药后15、30、45、60、90min分别测定各鼠痛阀值,并计算镇痛百分率,镇痛百分率=(给药后痛阈值一给药前痛闽值)/给药前痛阈值×100%。结果见表6。

2.2.2对醋酸所致小鼠扭体反应的影响

取健康小鼠50只,雌雄各半,按体重随机分为5组。第一组灌胃蒸馏水作为空白对照组;第二至四组分别灌胃舒筋活络胶囊高、中、低浓度的药液,作为给药组;第五组腹腔注射O.0059/kg盐酸吗啡作为阳性对照组。除阳性对照组于实验前给药1次外,其余各组每天给药1次,连续3天。末次给药30min后,给小鼠腹腔注射O.6%醋酸溶液0.2m1/只,立即计时,观察并记录小鼠15min内出现扭体反应的时间及次数(以小鼠腹部凹陷,双后肢伸展为扭体反应指标)。结果见表7。

表7舒筋活络胶囊对醋酸致小鼠扭体反应的影响(x±sD)

与空白对照组比较:料‘木p<O.001,料:p<O.01,术p<0.05

表7结果表明:舒筋活络胶囊高、中剂量组明显抑制醋酸所致的小鼠疼痛,延长潜伏期。

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2.3影响免疫功能的实验

2.3,1对2,4一二硝基氯苯(DNcB)诱导小鼠皮肤迟发性过敏反应(DTH)的影晌拈1

取健康昆明种小鼠50只,雌雄各半,称重,随机分为5组。第

一组灌胃蒸馏水作为空白对照组;第二至四组分别灌胃舒筋活络胶囊高、中、低浓度的药液,作为给药组;第五组隔天皮下注射0.049/kg环磷酰胺作为阳性对照组。其余各组每天给药1次,连续灌胃给药7天。操作步骤如下:l、DNcB配制:致敏或攻击前以丙酮和麻油1:1为溶剂新鲜配制;2、致敏:给药前1d每鼠腹部脱毛3×3cm2;给药当日将50p11%DNcB溶液均匀涂抹于小鼠腹部,于次日再强化1次;3、DTH的产生与测定:致敏7d后,将1%DNcB溶液20肛1均匀涂抹于每只小鼠右耳进行攻击,24h后脱颈处死动物,称重,以8mm打孔器取两耳同一部位耳片,称重,并取胸腺、脾脏称重,以左右耳片重量之差表示肿胀度,计算脾指数=脾重(mg)/体重(g);胸腺指数一胸腺重量(mg)/体重(g)。对结果进行统计处理,结果见表8。

表8舒筋活络胶囊对DNCB诱导小鼠DTH的影响(X±sD)

与空白对照组比较::Ic料p<o.001,:l:术p<0.0l,半p<O.05

表8结果表明:舒筋活络胶囊高、中剂量组能明显抑制DNCB诱导的小鼠DTH反应。其高剂量组对小鼠胸腺生长有抑制作用。

2.3.2对小鼠溶血素抗体生成的影响n01

2.3.2.1鸡血细胞的制备:无菌条件下,取鸡血于盛有A1sever’s

溶液的灭菌锥形瓶中,鸡血与A1sever’s溶液比例为l:5,混匀。4℃冰箱保存。使用时以生理盐水洗涤3次,前两次离心速度1500r/min,离心5min,弃上清液和界面白细胞层,最后应连续两次离心(2000r/min,5min),直至红细胞压积值恒定,按比值用生理盐水配成所需浓度的红细胞悬液。

2.3.2.2免疫及给药:取昆明种小鼠50只,雌雄各半,按体重

随机分为5组。给药后第1天每只小鼠腹腔注射5%鸡红细胞悬液O.5m1/只进行免疫。第一组给等体积生理盐水作为空白对照组;第二至四组灌胃舒筋活络胶囊高、中、低浓度的药液作为给药组,连续给药7天;阳性对照组分别于第2、4、6天皮下注射环磷酰胺O.049/kg,免疫后7天即摘除眼球取血进行溶血素抗体测定。

2.3.2.3溶血素抗体测定:取血约1h后,2000r/min离心10min,

取血清lOm用生理盐水1m1稀释100倍,然后取稀释血清lml于试管内,与5%鸡红细胞悬液0.5ml和1:lO稀释后的新鲜豚鼠血清O.5ml混合,混匀,立即放入37℃恒温水浴锅恒温30min,然后立即取出放入冰浴中终止反应,离心,取上清液于540nm处比色,以1m1生理盐水加5%鸡红细胞悬液O.5ml,10%豚鼠血清0.5ml作为空白对照,分别测定各管光密度值(OD)。结果见表9。14

表9舒筋活络胶囊对小鼠溶血素抗体生成的影响(x+sD)

与空白对照组比较:,木木p<0.0l,术p<0.05

表9结果表明:舒筋活络胶囊高、中剂量组能明显抑制小鼠溶

血素抗体生成。

2.4大鼠佐剂-陛关节炎(AA)的实验

2.4.1造模

取健康雄性sD大鼠(150一1809)60只,按体重随机分为6组,

每组10只,第一组为正常对照组;第二组为造模对照组;第三组为阳性对照组(正清风痛宁40mg/kg);第四至六组舒筋活络胶囊高、中、低剂量组。予致炎前3天灌胃给药。用容积法测定正常大鼠双侧后肢足容积,参照文献“¨方法造模,除空白对照组外,其余各组每鼠右后足趾皮内注射O.1Ⅲl弗氏完全佐剂(10mg/m1)。

2,4.2对AA大鼠原发性关节肿胀的影响

造模后6、12、24、30、48、54、60、72h测定致炎侧足容积,

以其致炎前后差值表示其肿胀度,观察药物对AA大鼠急性免疫炎症的影响。结果见表10。

2.4.3对AA大鼠继发-胜关节肿胀的影响

造模后12、15、18、21、24、30d测定非致炎足(左足)的容积变化,以观察药物对从大鼠继发性关节肿胀的影响。结果见表1l。

继发症状见附图一至六。

2.4.4对AA大鼠体重的影响

造模后每7天测一次体重并记录体重变化(体重变化=每次所测

体重一第1天所测体重)。结果见表12;

表12舒筋活络胶囊对从大鼠体重的影响(x±sD)

与模型对照组比较:料p<0.Ol,木p<O.05,

表12结果表明:舒筋活络胶囊高剂量组在第2l天左右对从大鼠体重有明显增加作用。

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