激光拉曼光谱在蛋白质构象研究中的应用和进展

激光拉曼光谱在蛋白质构象研究中的应用和进展

激　光　生　物　学　报第16卷第4期

2007年8月ACTA　LASER　BIOLOGY　SIN

专题综述

ICA

Vol.16No.4

Aug.2007

激光拉曼光谱在蛋白质构象研究中的应用和进展

王　敏,俞　帆,隆　泉

(云南大学实验中心,云南)

3

摘　要:、。近年来拉曼光谱在

,、蛋白质装配的特征描述,拉曼晶体学在实时,介绍了蛋白质拉曼光谱分析在生物技术中的应用现状。并对。

关键词:拉曼光谱;蛋白质构象;非折叠蛋白质;蛋白质装配;拉曼晶体学

中图分类号:Q657.37;Q51文献标识码:A

文章编号:100727146(2007)0420516205

TheApplicationandDevelopmentofRamanSpectroscopy

onProteinConformation

WANGMin,YUFan,LONGQuan

(ExperimentalCenterofYunnanUniversity,Kunming650091,Yunnan,China)

Abstract:Ramanspectroscopyisasuitablemethodforprobingtherelationshipbetweenstructure,dynamicsandfunc2

tionofbiomolecules.Inthisreview,somerecentadvancesofRamanspectroscopyonproteinconformationaresumma2rized.Ramanspectroscopyhasbeenusedtocharacterizeproteinunfoldingandassembly.Ramancrystallographyhasbeeninstrumentalinthemonitoringofchemicaleventsinsingle2proteincrystalsinrealtime.Inaddition,theapplicationofRamanspectroscopyonproteinsanalysisinbiotechnologyisproposed.WealsopredictedthefurtherapplicationanddevelopmentofRamanspectroscopyonotherbiomolecules.

Keywords:Ramanspectroscopy;proteinconformation;unfolding;assembly;Ramancrystallography

激光拉曼散射光谱测量的拉曼频移是表征物质分子振动2转动能级特性的一个物理量。通过物质的拉曼光谱分析,可以从分子结构上了解物质的构成、特性、及其变化规律。蛋白质是维系生物体正常生命活动的关键成分,阐明其正常结构具有重要生物学意义。现有的常规方法往往难于检测多肽及蛋白质的结构,或者是方法过于复杂,不易操作。过去十年中电感耦合器件(charge2coupleddevice,CCD)检测器和光纤过滤器的广泛应用显著地提高了拉曼光

谱的信噪比,这使得数字式拉曼差谱(Ramandiffer2encespectroscopy)能够应用到蛋白质稀溶液中。拉曼差谱技术已成为一种检测微观结构、构象变化的不可或缺的工具供了渠道

[2]

[1]

。拉曼光谱研究蛋白质构象为人

们了解生物分子反应过程的机制、自组装等现象提

。本文主要介绍了拉曼光谱学在天然去

折叠蛋白质和多肽、蛋白质晶体、蛋白质装配方面的前沿研究进展,最后介绍了拉曼光谱在生物工程中的最新应用。

3

收稿日期:2006212214

作者简介:王敏(1974—),女,硕士,实验师,主要从事表面增强拉曼和紫外共振拉曼光谱分析蛋白质和核酸等生物

大分子的研究.(电话)087125033219;(电子信箱)wangmin74@

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1　天然非折叠蛋白质结构

一直以来蛋白质结构给人的印象都是确定的线性多肽链在空间折叠成特定的三维空间结构。然而,在过去十年的研究中发现,在细胞中许多缺乏独特卷曲、折叠的天然非折叠蛋白质同样发挥着重要生理功能

[3]

扰细胞壁合成杀死细菌,而细菌则可通过产生β2内酰胺酶水解青霉素从而导致抗药性的发生。因此,标准的治疗方法就是合用第二种药物配合青霉素阻

隔β2内酰胺酶的活性位置。然而,细菌又产生不能被抑制剂药物阻拦的β2内酰胺酶变异形式,这就是抗药性的主要根源

[829]

。等

[10]

用拉曼晶体学

。这类蛋白质由于缺乏独特结构,采用β2内和三种常用于β2),舒巴坦),clavulanicacid)的反应中,并因此阐明抗药性的分子构型(图1)。拉曼数据表明,三个抑制剂舒巴坦(sulbactam),克拉维酸(clavulanicacid),他唑巴坦(tazobactam)与β2内酰胺酶形成的反应中间物烯胺类酰基酶在1595

cm随时间升起峰带确定为烯胺类O=C2C=C2NH

21

其他分析方法难以进行特征描述,而拉曼光谱分析则能够弥补这方面的缺陷。

卷曲、(am(amideIII),套用球形蛋白质而来的拉曼经验常数到天然去折叠蛋白质将导致错误的结果

[4]

。因此,有必要建立适合天然非折叠蛋白质的

[5]

伸展振动,它们分别在10min、22min、29min达到最高。这个特征用于追踪晶体内烯胺增大和衰减的动力过程。药效最强的他唑巴坦形成的反式烯胺(图

2)的谱峰是舒巴坦和克拉维酸的两倍。拉曼数据还

拉曼标记。Anderson等的研究发现,氨基化合物I

的三个拉曼振动谱带对确定天然非折叠蛋白质的构型特征有所帮助。用拉曼光谱方法对典型的天然非折叠蛋白质突触核蛋白(α2synuclein)因其易凝聚、纤维化,可能导致振颤性麻痹疾病的发生而引起研究兴趣,在不同溶液条件下形成的不同二级结构进行了特征分析。用拉曼特征谱带氨基化合物I的1653

212121cm(α2螺旋)、1667cm(β2片层)、1674cm～168521

cm(聚脯氨酸polyprolineII)结构确定了α2synuclein

表明,内酰胺环在形成烯胺前打开,是由于1595cm

21

烯胺特征峰出现之前,内酰胺环的C=O振动峰就消失了。根据拉曼晶体学研究提供的这些蛋白质结构、动力学和机理之间的联系对设定时间内捕捉到的反应中间物的X2射线晶体衍射分析具有重要意义

[7]

。

二级结构的存在、相对变化,并由此推断其它天然非

折叠蛋白质卵黄高磷蛋白(phosvitin),酪蛋白α(α2

casein),酪蛋白β(β2casein)的二级结构

[5]

2.2　药物分子筛选

拉曼晶体学的另一应用是把活性酶的单晶用于抑制剂筛选

[11]

。发现天。类胰岛素丝氨酸蛋白酶人尿激素

然非折叠蛋白质的amideI拉曼光谱比折叠蛋白质简单,其主要原因为天然非折叠蛋白质回旋结构少和疏水核心的缺失。

作为一种酶抑制剂,能减缓肿瘤转移和初始肿瘤长大。应用中把等当量的抑制剂加入母液,让他们在与肿瘤细胞牢固相连的丝氨酸蛋白酶尿激素晶体中竞争吸附位点。系统达到平衡后,晶体转入新鲜母液,过量的没有吸附或弱吸附抑制剂被洗刷掉。应用拉曼光谱分析冲洗过的晶体能被够辨识被拉曼标记的强吸附的抑制剂。

2.3　单晶中的蛋白质构象改变

2　单晶中的蛋白质结构

拉曼能实时监控蛋白质单晶里的化学事件,包括决定酶2抑制剂或酶2底物络合物相互作用的化学性,定量检测晶体中的配位体数量,实时追踪活性位置的

[6]

化学反应。拉曼晶体学(Ramancrystallography)优于传统拉曼差谱方法(溶液中)的原因就在于晶体的高浓度使信噪比显著提高,并可得到低而稳定的基线背景

[7]

当配位基吸入晶体并结合到活性位点,拉曼结晶学能够跟踪晶体内的结构变化

2

[12]

。拉曼晶体学

可用于研究反式羧基酶的5S亚单位(一个用羧基生物素的CO2把络合的丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的二聚物)

[13]

。

2.1　晶体里的反应媒介:β内酰胺酶(β2lactamases)

。通过观察发现,5S的二级结构拉曼标

和抗药性

拉曼晶体学能确认并跟踪单晶中反应中间物。例如,青霉素(penicillin)和它的衍生物可以通过干

记在晶体与晶体间差别很大,pH7时的晶体显示为α2螺旋和β2片层二级结构拉曼标记的混合体,但是当周围母液中pH降低至5时α2螺旋标记强度显著

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16卷

β2　　图1　内酰胺酶抑制剂结构

Fig.1　

Structureofβ2lactamasenace,NMR)X2射线结晶学(受弱衍射和大单元细胞

晶体的无序限制)难以研究这些蛋白装配。拉曼光谱学由于其特有的高分辨技术可用于此类研究。通常拉曼差谱应用与尺寸大小和散射性质无关,同时拉曼差谱技术在检测大分子络合物的微小结构变化时特别灵敏。这些优点使应用拉曼光谱分辨蛋白

图2　E166A内酰胺酶晶体内两种可能的烯胺类酰基酶[7]

Fig.2　Twopossibleacyl2enzymeenaminespeciesintheE166Alactamasecrystal

[7]

质、脂肪和核苷酸成为可能3.1　噬菌体<6

[15216]

。

噬菌体<6是一种含脂肪的双链RNA病毒。病毒分几步装配,第一个可检测到的中间物是原壳

(procapsid),它是一个含有四个病毒的蛋白质十二

下降,而β2片层标记则上升

。胰岛素为50%α2螺旋,但当晶体中的S2S联接降为SH,所有α2螺旋标

[14]

记从晶体的拉曼谱图上消失并被β2片层取代。与之相反,12S亚单位对pH变化不敏感。当底物甲基丙二酸单酰辅酶A(methylmalonyl2coenzymeA,

MM2CoA)吸附时,只经历微小构象改变,而将MM2CoA和生物素都加到母液中时12S晶体蛋白质则从

[7,14]α2螺旋和β2片层混合体转变为完全β2片层。

[14]

聚体装配:P1(主要结构蛋白,120个拷贝),P2(RNA

依赖性RNA聚合酶,12个拷贝),P4(包装驱动器,

12个六聚体)和P7(装配和包装因子,30个二聚

体)。原壳是一种能有选择地包裹,复制和转录病毒

RNA的复杂的分子机器

[17218]

。应用拉曼差谱方法分

[19]

析异型原壳装配能更好地了解不同蛋白质间相互作用,并反映组装过程中的构象变化特色。由于每

个异型原壳缺失一个蛋白(分别为P2、P4和P7)导致原始原壳和异型原壳之间存在拉曼差谱,在组装状态下产生了蛋白质光谱信号。把这些信号与单独的蛋白质作比较,发现了多种差谱峰。在1302

cm、1330cm和1652cm的正向峰表示装配状态

21

21

21

虽然以上三种蛋白质12S、5S和胰岛素构象转

变的机理目前还不清楚,但在β2片层转变形式中均拥有相同的性质:(1)转变为β2片层为主的改变是不可逆的;(2)晶体形态不变,但再也不能衍射X2射

[7]

线;(3)晶体溶解度极大地减少。这些变化说明,晶体里的蛋白质能够经历相对大规模构象变为β2片

下α2螺旋成分增多,1243cm和1684cm的凹槽峰说明组装的无序结构减少。另外,许多支链标记峰

2121

的强度发生了改变(酪氨酸在831cm～857cm的双峰)。这些谱图变化支持了在P4功能域C端的α2螺旋结构折叠伴随装配的模式。由于P4蛋白对原壳装配成核性具有重要意义化对装配初始化是必需的。3.2　噬菌体HK97的成熟

[17]

2121

层二级结构形式。由于此类蛋白质在构象转变中迅速丧失衍射功能,因此不宜用X2射线分析,而拉曼结晶法则弥补了这一不足。

3　蛋白质装配(assemblies)

病毒颗粒主要由核酸和蛋白质组成,蛋白质衣壳可保护病毒核酸免受外界因素影响破坏,并可介导病毒核酸进入细胞内部,病毒衣壳是由病毒结构

蛋白装配形成的。核磁共振(nuclearmagneticreso2

,因此,这个构象变

噬菌体HK97是一个双链DNA病毒,在病毒衣壳装配过程中有四种衣壳演变形成:

(1)前头部Ⅰ(ProheadI):由415个结构蛋白亚

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基构成,衣壳蛋白之间无酶解、共价交联和构象变化,易被离解为多个壳粒。ProheadI蛋白自体分解释放出N端Δ2功能域(residues22103)并进到Pro2

headII阶段。

(2)前头部Ⅱ(ProheadII):衣壳大小不变,由于

拉曼差光谱技术在医疗诊断中的应用前景也很可观。应用拉曼差光谱分析疾病模型羊神经系统退行性病变与血清拉曼光谱变化之间存在相关性,有望建立快速诊断疾病的方法

[29]

。Carey等

[30]

应用拉

衣壳蛋白氨基端被水解,所以衣壳内层密度变弱。

(3)前头部Ⅰ(HeadI):病毒核包装,衣壳膨胀,厚度变小,壳粒结构发生明显变化,各结构蛋白亚基之间发生交联。

(4)前头部Ⅱ(HeadII:,56基形成的寡聚体,各亚基之间重排形成牢固的20面体立体对称结构。用数字式拉曼差谱分析ProheadI的Δ2功能域显示其高度

[20]α2螺旋化,有利于正确装配,ProheadII到HeadII

曼显微镜分析阿兹海默症患者脑内老年斑(淀粉样

蛋白质),发现了拉曼,从而构建一拉曼光谱分析可以提供丰富的关于蛋白质结构的信息,使得研究人员在X2射线晶体衍射分析、核磁共振技术之外有了新的手段对蛋白质结构进行研究。相信随着激光技术、检测技术的发展以及新的拉曼光谱技术和方法的提出,激光拉曼光谱技术必将得到更广泛的应用,促进蛋白质等生物大分子的研究进展。

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和β2片层。另外,大量色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的支链改变了构象,表明了更强的氢键和更加疏水的环境有利于维持HeadII的稳定性

[20]

。

4　应用于生物技术的蛋白质拉曼光谱

拉曼光谱技术能用于从固体到稀溶液的各种形态样品,并且对样品没有破坏性。典型的蛋白质生物制药是浓溶液或低压升华干燥的粉末。很多情况下,产品在纯化、配制过程中要经液体、固态晶体和无定形状态。因此,拉曼光谱技术特别适用于基于蛋白质制药的流程监控和质量控制

[1]

。

拉曼差光谱技术还可应用于优化蛋白质产品的稳定性和贮存条件。应用内标强度和建立好的结构2光谱相互关系,就能评定批量产品结构变化程度和种类

[22]

。拉曼差光谱技术用于证明装到瘤骨疽因

子受体的乙二醇(polythyleneglycol,PEG)连接器不会影响受体领域的天然折叠,却能提高它的稳定性

[23]

。同样的,抗体的长效稳定性可以用拉曼和红

[24]

外光谱检测术的检测

。傅立叶拉曼光谱用于溶菌酶和从

种子衍生出的糜蛋白酶抑制剂稳定性的不同准备技

[25]

。把红外和拉曼光谱作为温度的函数

[26]

可用于监控蛋白质热伸展性的发生。通过二维相关光谱分析数据,提供变性过程的信息

。这些信息

[27]

随后经蛋白质工程和公式过程用于改善稳定性。

共聚焦拉曼成像方法能用于检测小麦谷物质地,经检测发现α2螺旋二级结构数量与小麦硬度相关是小麦转为面粉过程的一个重要特征

[28]

。

激光拉曼光谱在蛋白质构象研究中的应用和进展

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