生物技术综合实验指导手册 - 图文

鲁东大学生命科学学院 2010 生物技术专业《生物技术综合实验》实验指导

生物技术综合实验

实验指导

适用专业：生物技术

鲁东大学生命科学学院

编写：应用生物工程教研室

2010年

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鲁东大学生命科学学院 2010 生物技术专业《生物技术综合实验》实验指导

目 录

第一部分、综合性实验 ....................................................................................................... 4

综合项目一、α-淀粉酶产生菌的分离与筛选 .......................................................... 4

实验一、培养基配制及样品采集 ....................................................................... 4 实验二、样品处理及初筛 ................................................................................... 5 实验三、α-淀粉酶产生菌的分离与筛选 .......................................................... 6 综合项目二、酵母菌的诱变育种 ............................................................................... 8

实验四、培养基配制和菌种活化 ....................................................................... 8 实验五、酵母菌的诱变处理 ............................................................................... 9 实验六、呼吸缺陷型菌株的初筛 ..................................................................... 10 实验七、呼吸缺陷型酵母菌的验证 .................................................................. 11 综合项目三、谷氨酸发酵及提取工艺 ..................................................................... 12

实验八、谷氨酸菌种的制备 ............................................................................. 12 实验九、谷氨酸的中糖发酵及控制 ................................................................. 13 实验十、发酵液中谷氨酸的回收及精制.......................................................... 15 综合项目四、红曲发酵及红曲色素的提取 ............................................................. 17

实验十一、红曲液体菌种的制备 ..................................................................... 17 实验十二、红曲固体发酵 ................................................................................. 18 实验十三、红曲色素的提取及色价测定.......................................................... 19

综合项目五、糖化酶的发酵和提取………………………………………………….22 实验十四、培养基的配制和菌种活化 实验十五、糖化酶的摇瓶发酵

实验十六、糖化酶的提取、浓缩、活性测定

第二部分：设计性实验 ..................................................................................................... 25

设计性实验要求 ......................................................................................................... 25 设计项目一、摇瓶发酵法生产柠檬酸 ..................................................................... 26 设计项目二、 固体发酵法生产柠檬酸 ................................................................... 29 设计项目三、α-淀粉酶生产 ................................................................................... 32 设计项目四、酵母细胞的固定化 ............................................................................. 33 第三部分 附录 ................................................................................................................... 36

附录一、中试发酵设备的使用方法 ......................................................................... 36 附录二、气升式生化反应器的使用 ......................................................................... 38 附录三、发酵液中还原糖的测定方法 ..................................................................... 40 附录四、谷氨酸浓度测定法 ..................................................................................... 42 附录五、α-淀粉酶的测定方法 ............................................................................... 43 附录六、糖化型淀粉酶活力的测定 ......................................................................... 45 附录七、柠檬酸的检测…………………………………………………………… 48 附录八 原料中粗淀粉的测定…………………………………………………… ..49

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实 验 守 则

一、实验

1、

实验前认真做好课本有关章节的阅读及实验讲义的预习，简单了解实验装置的构造，掌握有关测量仪表的使用方法，确定实验方法和步骤，做好实验原始数据的记录。 2、

指导教师在实验前进行提问，如发现没有达到预习要求的同学，有权停止其参加当次实验。 3、 4、

操作过程应在装置指定范围内进行调节，注意观察实验现象，正确读取实记录。 注意节约水电、药品、物品、爱护仪器设备，实验结束，将设备、仪器整理复原，场地清扫，与实验无关的装置仪器不得挪用。 5、

实验室内保持安静，不得高声谈笑、喧闹，违者按破坏课堂纪律处理，实验结束后，所测数据经指导教师许可，方可离开。

二、实验报告

1、

实验报告内容包括：实验原理、流程简图、操作要点、数据图表（附原始记录、计算示例）主要结论，实验结果的分析。 2、

实验报告写在报告纸上，三天内交给指导教师。

三、注意事项

1、 2、

不碰摸与本实验无关的电源开关、电气设备、仪器。

仪器设备转动前，注意其周围是否有阻碍物，若发热或声音不正常，应及时停车检查。 3、

注意防止高压容器泄露和蒸汽管道烫伤事故的发生。

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第一部分、综合性实验

综合项目一、α-淀粉酶产生菌的分离与筛选

实验一、培养基配制及样品采集

一、实验目的

学习和掌握菌种选育技术中从自然界中采样的技术，掌握α-淀粉酶筛选的特异性培养基配制方法。 二、实验原理

自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多，土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。 三 实验材料

1. 采样器具：灭菌的牛皮纸袋、小铲刀（或不锈钢勺）、温度计、pH试纸、记号笔等。 2. 筛选培养基：斜面肉汤琼脂 + 1%可溶性淀粉 四、操作步骤 1. 采样：

用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好，或事先灭菌处理的牛皮纸袋、玻璃器皿内。北方的干燥土壤，可在10～30cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。

（注意：一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。

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从土层的纵剖面看，1～5cm的表层土，由于阳光照射，蒸发量大，水分少，且有紫外线的杀菌作用，因而微生物数量比5～25cm的土层少；25cm以下土层则因土质紧密，空气量不足，养分与水分缺乏，含菌量也逐步减少。因此，采土样最好的土层是5～25cm。一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到，如好气芽孢杆菌、假单胞菌、短杆菌、大肠杆菌、某些嫌气菌等。但总的说来酵母菌分布土层最浅，约5～10cm，霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。） 2．筛选培养基配制：

筛选培养基配方（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，氯化钠5，可溶性淀粉10，琼脂粉15，pH 7.5。每500ml三角瓶装200ml培养基，121℃灭菌20min，备用。

LB培养基斜面：牛肉膏3，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂粉15，pH 7.5。培养基装试管，灭菌后摆斜面，备用。 3．无菌水制备

100ml三角瓶，加入9 ml蒸馏水，玻璃珠8颗，透气塞及牛皮纸（或报纸）封口，灭菌后备用。

试管10支，装9ml/支蒸馏水，透气塞及牛皮纸（或报纸）封口，灭菌后备用。 培养皿包封，灭菌后备用。

1ml吸管若干，棉花封口，报纸包扎后灭菌，备用。 涂布棒包扎后灭菌，备用。 五、思考题

1．你认为自然界中哪些地点更容易采集和分离到本试验的目标菌株？

实验二、样品处理及初筛

一、实验目的

学习从自然界中采集的样品中进行菌种分离的技术，掌握稀释涂布平板方法及透明圈法进行产α-淀粉酶产生菌的初筛的技术。 二、实验原理

菌株分离（separation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选，进而

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