金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因的克隆及其表达特性分析

根据中性海藻糖酶NTL基因的同源序列设计引物,PCR扩增出杀蝗专一菌株――金龟子绿僵菌CQMa102 NTL基因片段,利用5′_RACE和3′_RACE扩增出NTL cDNA的5′和3′端序列,经拼接得到CQMa102 NTL基因 cDNA全长。根据其全长cDNA序列,设计引物PCR扩增出CQMa102 NTL的完整基因。为了

!"卷#期$%%"年&$月微生物学报!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$’()*!"+,-,./,01(*#$%%"

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金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因的克隆及其表达特性分析

$$，2$，2$，2$，2"

胡宗利&，王中康&，彭国雄&，殷幼平&，夏玉先&，

（重庆大学

&

基因工程研究中心

$

生物工程学院生物力学与组织工程教育部重点实验室

重庆

!%%%2%）

重庆!%%%2%）

（2重庆市杀虫真菌工程技术中心

摘要：根据中性海藻糖酶15G基因的同源序列设计引物，——金龟子绿僵菌IKL8&%$HIJ扩增出杀蝗专一菌株—

利用"M6JNI;和2M6JNI;扩增出15G-+1N的"M和2M端序列，经拼接得到IKL8&%$15G基因-+1N15G基因片段，

全长。根据其全长-+1N序列，设计引物HIJ扩增出IKL8&%$15G的完整基因。为了解该基因的上游调控信息，采用H8?D8?B),H()=.,08O,ID8<?J,8-P<(?N.Q)<R<-8P<(?方法扩增其上游序列。序列分析表明，IKL8&%$15G全长+1N编码323个氨基酸的蛋白，推测蛋白分子量为42S&T+；含有2个内含子，包含一个依赖于2!4!/Q，-+1N全长$24"/Q，

（JJUV）和一个钙附着位点（+5+U1LKW5W;+）；上游序列含有一个压力反应元件（IIII5）；-NLH的磷酸化作用位点

与金龟子绿僵菌广谱性菌株L;&15G的核苷酸序列和氨基酸序列分别具有:2X和::X同源性，由此确定该序列为金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因序列。V(>PD,0?杂交表明，15G基因在IKL8&%$基因组中为单拷贝。1(0PD,0?杂交表明，在液体培养条件下，对数生长前期表达水平最高，对数生长后期降15G基因转录出约$S"T/的.J1N单带，到最低，进入稳定生长期后表达水平又有所提高。金龟子绿僵菌IKL8&%$中性海藻糖酶基因+1N全长和-+1N全登录号分别为：长登录U,?Y8?T，NZ""3#&2，NZ""3#&$。关键词：金龟子绿僵菌，中性海藻糖酶，蝗虫，昆虫病原真菌中图分类号：K34

文献标识码：N

文章编号：%%%&6#$%:（$%%"）%#6%4:%6%"

金龟子绿僵菌是一类应用广泛的昆虫病原真菌，在昆虫防治中起着重要作用。过去十多年来，国外在虫生真菌的致病机制、高毒力菌株选育和应用技术等方面都取得了不少进展，已先后有!%多种产品登记注册，但这些产品常常不稳定，其主要原因是孢子的储藏期较短、抗逆境能力较差。本实验室从我国微生物资源中自行分离、选育出一株高毒力、高产孢、强专化性的杀蝗新菌株金龟子绿僵菌该绿僵菌孢子粉及其油悬浮剂已在国内IKL8&%$，

登记注册，实现了商品化，却也同样存在进一步延长储藏期、提高稳定性等问题。有研究报道，细胞内海

［&］

藻糖积累与!"#$%&’(")*%*"+#*,-)和./0("1#22-/

［］

3*0&,#$-/$等丝状真菌孢子的储藏期延长密切相关。采用基因敲除技术破坏./0("1#22-/,#’-2*,/中性海藻糖酶基因后，.*,#’-2*,/萌发孢子耐热激的能力提高"[&%倍，表明海藻糖对孢子的抗逆境能力有重要作用，可能是真菌孢子存活率的一个重要决定因［2］子。海藻糖是一种非还原性二糖，海藻糖酶

水解一个分子的海藻糖为$个分子的葡（;I2S$S$4）

萄糖。真菌海藻糖酶根据其最适Q\和调节特性分

为酸性（或非调节性）和中性（或调节性）海藻糖［!，"］酶。在完整酵母细胞内，海藻糖是由中性海藻糖

［#，3］

酶分解而非酸性海藻糖酶。

为了提高金龟子绿僵菌IKL8&%$孢子的耐贮性和抗逆境能力，我们拟采用分子生物学技术将中性海藻糖酶基因敲除，提高孢子的海藻糖含量，增强其耐储藏能力和抗逆能力。本试验分离克隆金龟子绿僵菌IKL8&%$的中性海藻糖酶15G基因，并进行全序列测定，为构建金龟子绿僵菌IKL8&%$15G基因高效表达载体和敲除载体、研究绿僵菌体内海藻糖代谢和调控、培育耐贮杀虫真菌提供基础材料和科学依据。

!材料和方法

!"!材料

菌株和质粒：金龟子绿僵菌菌株!"!"!

（4(5*"%#+#-)*,#/&02#*(）IKL8&%$为本实验室从我国微生物资源中自行分离、选育出的高毒力、

高产孢、

基金项目：国家自然科学基金（2%&3%#2%）；重庆市自然科学基金重点项目（4"#!）

"通讯作者。5,)：4#6$26#"&$%!4#；789：4#6$26#"&$%!:%；;6.8<)：=>9<8?9<8@-A>*,B>*-?

作者简介：胡宗利（&:3&C），女，重庆江津人，博士研究生，助理研究员，主要从事分子生物学及生物技术研究。;6.8<)：D>E(?F)<3&@=8D((*-(.*-?

其他作者：蔡绍皙$

收稿日期：修回日期：$%%"6%26&&，$%%"6%36$%

根据中性海藻糖酶NTL基因的同源序列设计引物,PCR扩增出杀蝗专一菌株――金龟子绿僵菌CQMa102 NTL基因片段,利用5′_RACE和3′_RACE扩增出NTL cDNA的5′和3′端序列,经拼接得到CQMa102 NTL基因 cDNA全长。根据其全长cDNA序列,设计引物PCR扩增出CQMa102 NTL的完整基因。为了

O$$@，.2?^G@=2^U胡宗利等：金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因的克隆及其表达特性分析9%#

强专化性的杀蝗新菌株；大肠杆菌（!"#$%&’#$’(#)*’）质粒&’("!)*(+,-./0123!"#$%为本实验室保存；

购自4325/6+公司；质粒&78##9购自大连*+:+;+

公司。!"!"#

主要试剂：+,&)-%"./0<=>42?-5/3+,/、@A)BC??

;>8(823/D/1、EA)BC??;>8(823/D/1为大连*+:+;+公司产品；限制性内切酶、牛小肠碱性磷酸酶

：X@%$）@A)**’*88*888>*8*8**8)EA。

总-+,和!"$金龟子绿僵菌%&’(!)#总*+,、

.-+,的提取

将金龟子绿僵菌孢子#$U接种于O$5J#YGD<>（#YG)D13/I61ND+K2C3+CM,</Z132,/>6+3）培养液，#9$3Y5HI，OU[O9\培养U$N，#$$$$3Y5HI离心@5HI

［9］

沉淀菌丝，无菌水冲洗两次，按单志萍等的方法提取金龟子绿僵菌8R"+#$O总<=>。分别收集#YG

按照总D<>液培#ON、OGN、G9N、VON的培养菌丝，;=>和5;=>提取试剂盒的操作说明进行金龟子

绿僵菌8R"+#$O总;=>和5;=>的提取。!"/金龟子绿僵菌%&’(!)#+01基因同源片段的2%-扩增、克隆和序列测定金龟=*J基因同源片段B的48;反应体系为：子绿僵菌8R"+#$O总<=>@$I6，引物>#、>O各U$&52?，"68?O终浓度为OW$552?YJ，M=*45HZ1C3/终浓度为$WO@552?YJ，反+,&)-%"./0<=>42?-5/3+,/O7，应总体积@$J。48;反应条件：%G\@5HI；%G\"E$,，U$\U$,，VO\OW@5HI，E@个循环；VO\#$5HI。利用凝胶回收试剂盒回收纯化目的<=>片段，然后连接到&’("!)*(+,-./0123上。按文献［%］采用氯

进行连接、化钙法制备大肠杆菌!"#$%感受态细胞，

转化、阳性克隆菌株的筛选及电泳鉴定。克隆菌株由上海D+I62I公司进行<=>序列测定，并对测序结果进行分析。

!"3利用34-,%5和$4-,%5克隆+01基因34端

和$4端6*+,序列

根据金龟子绿僵菌8R"+#$O=*J同源片段B的测序结果，设计一条反转录引物;*和两对嵌套以金龟子绿僵菌式反向48;引物P#、PO和8#、8O，

按照@A)BC??;>8(8R"+#$O5;=>@$$I6为模板，

823/D/1描述的操作程序进行=*J基因@A端0<=>

序列的;*)48;扩增，然后将扩增产物连接到根据获得的=*J同&’("!)*(+,-./0123上。同样，

以金龟子绿僵菌源片段设计一条上游特异引物<，

首先利用EA)BC??8R"+#$O5;=>@$$I6为模板，

;>8(823/D/1提供的]?H62M*)E,H1/,>M+&1/3&3H5/3为反转录引物合成第一链0<=>，然后以其为模板，利用该试剂盒提供的E,H1/,>M+&1/3&3H5/3和上游特

然异引物<，48;扩增出=*J基因EA端0<=>序列，后经123#酶切、连接到同样经123#酶切的质粒

&78##9上。

将以上获得的=*J基因同源序列和@A、EA端0<=>序列拼接得到金龟子绿僵菌8R"+#$O=*J全

（8F>4）、（*G4=:）、总;=>和*G多核苷酸激酶5;=>提取试剂盒、43H5/)+)’/I/!J+K/?HI6D-,1/5标记试剂盒为4325/6+公司产品；L-K2IM=尼龙膜购自4N+5+30H+公司；LH6N4C3/4?+,5HMF,2?+1H2I:H1为凝胶回收试剂盒为博亚生物技术;20N/公司产品；有限公司产品；同位素!)4EOM8*4购自北京福瑞生物工程公司；其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。!"#

引物设计

根据=8PF的’/IP+IQ中丝状真菌中性海藻糖酶基因的同源性比较，设计一对简并引物扩增金龟子绿僵菌8R"+#$O=*J基因片段。上游引物>#：@A)’*=88=’’=’’=>’;**S>>S’>)EA；下游引物>O：@A)88>=88;*>=’’;*>;*888>S*’)EA。

为获得=*J基因0<=>的@A端序列，采用了@A)设计一条反转录引物;*和两对反向48;;>8(法，引物P#、引物;*：PO和8#、8O：@A)’’8>>’’*8’’8>8>>>*)EA；引物P#：@A)>8’>’8’’’*>’8>

引物PO：**’>’*>*)EA；@A)8’>*8>8>’88*88>**8)引物8#：引EA；@A)8***’88>>’*8>>888*’*8’)EA；

物8O：@A)*’>>88>’>8’88>>’’>)EA。为获得=*J基因0<=>的EA端序列，采用了EA);>8(法，设计一条上游特异引物<：@A)8*’>*8*>’>’’*>88’’>*88’**’’8*’’8>8*’>’>>)EA。

根据获得的全长0<=>序列设计一对特异引物，48;扩增=*J完整基因。上游引物(#：@A)’8’8>’>*8*>88*88>8’**8’*8>’*)EA；下游引物(O：@A)>*>*’’>*88*’>’>’’’8>>**>>*8’’*>)EA。为获得=*J基因上游调控序列，采用了

根据=*J基因@A端已知序列设计4+IN+IM?/48;法，

引物#（T@G"TE$）：G条引物和一条寡核苷酸链：

引物O（TUG@A)>>>8>8>**’*>’*8>*88’>’88)EA；

：引@A)’8’*8’*8>>>8>8>**’*>’*8>)EA；"TE%）

物E（T#@E"T#E#）：@A)8’8>>>8>>’引物G（TO@E"TOEG）：*’’>>8>>*>88*)EA；@A)

寡核苷酸链@U（TVO*8>88’*’’8*’88*8**8*)EA；

：@A)8*>’*>*’8**8*’>>’>’8’>8>*8>)"T%@）

EA。4+IN+IM?/48;验证引物R@E%WG4（XU$V"

根据中性海藻糖酶NTL基因的同源序列设计引物,PCR扩增出杀蝗专一菌株――金龟子绿僵菌CQMa102 NTL基因片段,利用5′_RACE和3′_RACE扩增出NTL cDNA的5′和3′端序列,经拼接得到CQMa102 NTL基因 cDNA全长。根据其全长cDNA序列,设计引物PCR扩增出CQMa102 NTL的完整基因。为了

A;’微生物学报(4.#*04-%"0%5%+04#70,04#’,,3，X9:U53#9U4

长!"#$。根据该全长!"#$序列设计一对引物%&、以金龟子绿僵菌()*+&,’基因组"#$为模板，%’，

并经克隆、测序获-(.扩增出#/0完整基因片段，得#/0基因全长"#$序列。!"#

$%&基因上游序列的’()*()+,-’./扩增

首先用限制性内切酶!"#!消化金龟子绿僵菌

［1］

同源性。由此推断获得的-(.片>&N（’55O15,）

段可能为中性海藻糖酶基因片段。

4"4金龟子绿僵菌.56(!74$%&基因的克隆和分析

根据金龟子绿僵菌()*+&,’#/0同源片段的测序结果，采用32E.$(%和12E.$(%扩增出#/0经拼接得到金龟子绿僵菌!"#$的32和12端序列，

中性海藻糖酶#/0!"#$全长。根据其全长!"#$序列，设计引物%&、克隆金龟子绿僵%’，-(.扩增、菌()*+&,’#/0完整基因。然后，利用-+@B+@C:D克隆#/0基因的部分上游调控序列。-(.法扩增、

金龟子绿僵菌()*+&,’#/0基因"#$全长登录#(PQ的RD@P+@S，登录号为$T33>4&1；15A5M7，

其!"#$全长’1A3M7，RD@P+@S登录号为$T33>4&’，编码>1>个氨基酸的蛋白，推测蛋白分子量为具有中性海藻糖酶基因的共有特征，即包含A16&S"，

［&’］

一个依赖于!$*-的磷酸化作用位点（..RG）和

［&1］

。比较金龟子一个钙附着位点（"/"R#*)Q/Q%"）

经去磷酸化后，在消化片段()*+&,’基因组"#$，

12端连接一段与#/0基因32端已知序列互补的寡核苷酸链34，经聚合酶延伸形成一锅柄状，加入引物’和引物5各&6’3（均为&’63789:），进行起始扩增：0";5<1,=，4,<1,=，>’<58?@，1,个循环；>’<>8?@，然后取出&置于含有嵌0未纯化的起始-(.产物，"套式引物（引物&和引物1）并预热至A,<的-(.管中，嵌套式扩增和起始扩增反应用同样的酶、试剂和引物浓度，嵌套式扩增作13个-(.热循环，循环参数与起始扩增完全相同。

-+@B+@C:D-(.产物的克隆和测序同以上#/0基因-(.产物的克隆及序列测定。根据此测序结果，设计一个新引物)31;65-，用该引物和引物5，以金龟子绿僵菌()*+&,’基因组"#$为模板-(.扩增出"#$片段-，克隆并测序该片段。以该片段-为模板，利用同位素#以此探针E-1’C(/-制备探针，与经限制性内切酶!$%!，&#’F!，()#0!完全酶切的金龟子绿僵菌()*+&,’总"#$做G9HIBDJ@杂交，其操作过程按文献［;］描述进行。!"0

$123*-2)杂交

以金龟子绿僵菌()*+&,’#/0基因同源片段K为模板，用同位素#将此探针与E-1’C(/-制备探针，经甲醛变性胶电泳后&’B、’5B、5AB、>’B培养菌总

其操作过程参照文献［;］进行。.#$’,L杂交，"

绿僵菌中性海藻糖酶#/0基因"#$序列和!"#$

序列发现，有典型的#/0基因含有1个内含子，R/UU$R边界。()*+&,’#/0基因"#$序列和推导的氨基酸序列与已报道的金龟子绿僵菌广谱性菌株*%&中性海藻糖酶基因"#$序列和推导氨基酸序列（RD@P+@S登录号分别为：进$V’;A,&;，$V’;A,’,）行比较，在结构基因的长度、所编码氨基酸的长度、内含子位置等均相同，在"#$序列上有&53个碱基不相同，同源性达;1N（’’1AO’1A1），两者氨基酸残基个数及其位置均完全相同，仅有4个氨基酸残基不同（第A位氨基酸)!.；第&,位氨基酸F!.；第第’4;位氨基酸.!)；第5;,位4,位氨基酸F!T；氨基酸"!#；第>’>位氨基酸0!)），同源性达到（>1&O>1>）。由此推定克隆的基因为中性海藻;;N

糖酶基因。

4"8金龟子绿僵菌.56(!74$%&基因上游调控序列的获得和分析

根据已经获得的金龟子绿僵菌()*+&,’#/0基因32端序列，设计引物，采用-+@B+@C:D-(.法扩增出#/0基因上游序列;A’M7（RD@P+@S登录号

，该序列含3个($$/启动子元件，还含$T33>4&1）

有一个压力反应元件G/.%=（GIJD==JD=79@=?WDD:D8D@I，它可能具有调控#/0基因在各种胁迫条件((((/）

［&5］

下转录活性的作用。

4结果和分析

4"!金龟子绿僵菌.56(!74$%&基因同源片段

的克隆和分析

根据中性海藻糖酶#/0基因的同源序列设计引物，-(.扩增出金龟子绿僵菌()*+&,’#/0基因同源片段K，该片段经克隆、测序后确定为&,’,M7，序列分析表明该"#$片段无内含子，将其推导的氨基酸序列与其他丝状真菌中性海藻糖酶氨基酸序列进行同源性比较。结果表明，与已报道的金龟子绿僵菌广谱性菌株*%&有;;N（11;O15,）的同源［&,］性，与稻瘟病菌*#+,#)%-.$/+-01/#有A&N（’>AO

［&&］

同源，与粗糙脉孢菌2/3-%1)%-#4-#11#有A,N15,）

［1］

（’>3O15,）同源，与构巢曲霉(1)/-+05531,0635#,1有

4"9

:1;3*-2)杂交

为验证-+@B+@C:D-(.扩增出的"#$片段的确

根据中性海藻糖酶NTL基因的同源序列设计引物,PCR扩增出杀蝗专一菌株――金龟子绿僵菌CQMa102 NTL基因片段,利用5′_RACE和3′_RACE扩增出NTL cDNA的5′和3′端序列,经拼接得到CQMa102 NTL基因 cDNA全长。根据其全长cDNA序列,设计引物PCR扩增出CQMa102 NTL的完整基因。为了

544%，R7?C)%!7CV胡宗利等：金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因的克隆及其表达特性分析O’&

是!"#基因上游序列，设计引物$%&’()*，以此引物

和引物)为引物对，并克*+,扩增出-!.片段*，隆、测序。其测序结果表明，该-!.片段含有!"#

并且不含!"#!、%/端序列和部分上游调控序列，

$%&0!、’(%#!等限制性内切酶位点。再用该片

与经限制性内切酶!"#!、$%&0、段*制备探针，!电泳、转膜后的金龟子绿僵菌’(%#!完全酶切、

+$12345总-!.做6789:;<=杂交，&个酶切-!.均

显示一条特异杂交带（图3），由此可见，我们利用*2=:2=>?;*+,法成功地获得了金龟子绿僵菌

并且!"#基因在金+$12345!"#基因的上游序列，

龟子绿僵菌基因组中为单拷贝形式存在。

以上获得的金龟子绿僵菌+$12345!"#基因

金龟-!.序列和氨基酸序列同源性比较结果表明，子绿僵菌!"#基因具有高度同源性，且该菌株是本实验室分离的高毒力杀蝗菌株，可作为!"#基因超

表达载体和敲除载体的受体材料，为进一步阐明该基因在孢子耐储藏、抗逆境中的作用提供基础材料和科学依据。现这两种载体已经构建成功，并转化了金龟子绿僵菌+$12345，获得目的转化子，详细内容将另文报道。

5讨论

［3%］

已经从酵母中分离出中性海藻糖酶，.MM等

［P］

克隆并鉴定了酿酒酵母中性海藻糖酶基U7MM等

因。这些研究发现，中性海藻糖酶在M0P(4显示最

大活力，其活性受转录调控和翻译后调控机制蛋白质磷酸化的影响，定位于胞质。本试验克隆的中性

图!

@ABC3

金龟子绿僵菌"#$%!&’()*基因+,-./012杂交分析

6789:;<=D?792=2?EFAF7G9:;=;89<2?9<;:2?2F;B;=;7G)C%*+,#(-+%.

海藻糖酶基因包含一个依赖于J.1*的磷酸化作用位点和一个钙附着位点，推测该基因可能受到翻译后磷酸化作用的调控。另外，!"#基因上游序列包含一个压力反应元件，该元件也存在于酵母一些与抗逆有关基因的调控序列中。在压力胁迫如热击、高渗透压、有毒以及营养饥饿等条件下，介导酵母相

［3V］关基因的转录激活，推测该元件在金龟子绿僵菌

+$12345

H;=7IAJ-!.>AB;F9;>KA9:!"#!，$%&0!2=>’(%#!<;F9<AJ9A7=;=LEI;FK2F:ED<A>AL;>KA9:9:;<2>A7?2D;??;>*M<7>8J92IM?AGA;>G<7I)C%*+,#(-+%.-!.KA9:M<AI;<F$%&’()*2=>)(3(!"#!；5($%&0!；&(’(%#!C

’34表达特性分析

利用!7<9:;<=杂交分析金龟子绿僵菌+$12345

（图5），!"#基!"#基因在不同生长时期的表达特性

因转录出约5(%TD的I,!.单带，在液体培养条件

下，该基因表达水平在对数生长前期最高，对数生长后期降到最低，进入稳定生长期后表达水平又有所提高。该表达特性与已报道的丝状真菌构巢曲霉和

［&］粗糙脉孢菌中性海藻糖酶基因的表达特性不同，

中也可能具有类似功能。

对I,!.结构进行分析时，一般通过,"S*+,

反应扩增目的区域，然后再将扩增后的目的-!.片段进行克隆、测序来进行。但一般的,"S*+,反应很难扩增某一基因的全长J-!.片段。,.+W法能有效地解决这一问题：通过已知的J-!.序列情况，进一步扩增此J-!.的%/末端或&/末端。我们采用此方法高度特异地扩增出金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因J-!.的两端序列，表明%/S,.+W和&/S,.+W法是一种较好的获得J-!.全长的方法。

*2=:2=>?;*+,法是一种扩增已知序列旁侧未知序列的染色体步移法，可以高度特异地扩增与已知位点相邻的大于&(4TD的人基因组-!.，可以应用于染色体步移、利用J-!.信息进行的启动子及

这两种丝状真菌中性海藻糖酶基因在对数生长期大量表达，进入稳定生长期后表达水平降低。中性海藻糖酶基因在这&种丝状真菌中表达水平的差异，可能是由物种特性或培养条件的差异引起。

图’

@ABC5

(,1./012杂交分析金龟子绿僵菌"#$%!&’()*基

!7<9:;<=2=2?EFAF7G9:;;NM<;FFA7=7G9:;=;89<2?9<;:2?2F;B;=;7G

基因结构域的定位、病毒及转座子整合位点的测定、

［3P］不能克隆的-!.的定位和测序等。我们利用*2=:2=>?;*+,方法扩增金龟子绿僵菌中性海藻糖

因在不同生长时期的表达特性

)C%*+,#(-+%.>8<A=B9:;;NM7=;=9A2?B<7K9:（35:，5):，)O:）2=>9:;F929A7=2<EM:2F;7GB<7K9:（P5:）

H;?,!.?72>A=BF2<;<;M<;F;=9;>D;?7K9:;2897<2>A7B<2M:DEA=J?8FA7=7G2QRAI2B;7G9:;;9:A>A8ID<7IA>;SF92A=;><,!.FA=;2J:F2IM?;?2=;C5(5):；&()O:；

)(P5:C3(35:；

酶!"#基因上游序列，本试验表明*2=:2=>?;*+,法

操作简单，步骤少，容易形成锅柄状，便于*+,扩增。同时，由于采用了嵌套式扩增，其特异性较高，是一种较好的克隆已知序列旁侧未知序列的方法。

根据中性海藻糖酶NTL基因的同源序列设计引物,PCR扩增出杀蝗专一菌株――金龟子绿僵菌CQMa102 NTL基因片段,利用5′_RACE和3′_RACE扩增出NTL cDNA的5′和3′端序列,经拼接得到CQMa102 NTL基因 cDNA全长。根据其全长cDNA序列,设计引物PCR扩增出CQMa102 NTL的完整基因。为了

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参考文献

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