利用细胞计数手段和DGGE技术分析松花江干流部分地区的细菌种群多

第32卷第11期2012年6月

DOI：10．5846/stxb201105160635

生态学报ACTAECOLOGICASINICA

Vol．32，No．11Jun．，2012

2012，32（11）：3505-3515．屠腾，李蕾，毛冠男，王莹莹．利用细胞计数手段和DGGE技术分析松花江干流部分地区的细菌种群多样性．生态学报，

TuT，LiL，MaoGN，WangYY．AnalysisofbacterialpersityintheSonghuaRiverbasedonnestedPCRandDGGE．ActaEcologicaSinica，2012，32（11）：3505-3515．

利用细胞计数手段和DGGE技术分析松花江

干流部分地区的细菌种群多样性

屠

腾，李

蕾，毛冠男，王莹莹

*

（南开大学环境科学与工程学院，环境污染过程与基准教育部重点实验室，天津300071）

摘要：松花江是我国东北地区的重要河流之一，为加强对其水环境微生物状况的了解，对松花江干流部分地区的微生物数量和多样性进行了分析。应用传统平板培养法和流式细胞技术测定水样中的细菌数；直接提取样品中的总DNA，以巢式PCR（PolymeraseChainReaction）扩增细菌16SrDNA片段，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳（DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE）pH值为影响水环境中微生物总细胞数量技术对扩增片段进行分离，研究水样和底泥样品细菌的种群多样性。实验结果显示，的主要因素。水样中细菌群落多样性主要根据上下游分区，分区点在哈尔滨段附近，而底泥中细菌群落多样性的影响因素呈多没有显示出较为明确的分区特征。样化，

关键词：松花江；流式细胞术；巢式PCR；DGGE；细菌群落多样性

AnalysisofbacterialpersityintheSonghuaRiverbasedonnestedPCR

andDGGE

TUTeng，LILei，MAOGuannan，WANGYingying*

KeyLaboratoryofPollutionProcessesandEnvironmentalCriteriaMinistryofEducation，CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering，NanKaiUniversity，Tianjin300071，China

Abstract：AsthelargesttributaryoftheHeilongRiver，theSonghuaRiverflowsabout1，434kilometersfromtheChangbaiMountainsthroughtheJilinandHeilongjiangprovinces．ItoccupiesasignificantpositionintheecologicalandcommercialfieldsinNortheastChina．Asitsuffersfromcomplexcontaminantconditions，comprehensiveenvironmentalimprovementandmanagementoftheSonghuaRiverisvital．Thus，arelativelyaccuratemonitoringandinvestmentsystemisessentialtosupplybasicdatafordecisionandpolicymaking．Inthisstudy，weaimtoanalyzethebacterialconcentrationandpersity，alongwiththeirrelationshiptovariousenvironmentalfactorsintheriver，forthepurposeofabriefevaluationtowardsthemicrobialconditionintheSonghuaRiver．RepresentativesamplingpointswerechosenfromupstreamtodownstreamoftheSonghuaRiver．Atotaloffifteenwatersamplesandtensludgesampleswerecollected．Thebacterialconcentrationwasassessedbybothtraditionalheterotrophicplatecounts（HPC）andanovelflowcytometric（FCM）technique．HPCusedtobewidelyutilizedasanapproachtodetectthecultivablebacterialcommunities；however，ithasbeenunderdiscussionduetoitsnon-negligibledrawbacksandthedevelopmentofnewalternativetools．ResultsshowthattheorderofmagnitudeofcultivablecellscountedbyHPCisabout106whiletheorderofmagnitudeoftotalcellscountedbyflowcytometryisabout104．Itshowsthattraditionalheterotrophicplantcountsmighteasilyneglectthosecellsthatareuncultivablebutpossessphysiologicalproperties．Also，flowcytometryexhibitsseveraladvantagescomparedwithHPC，forinstance，morerapid

基金项目：国家水专项（2008ZX07526-002-01）；国家自然科学基金项目（31000247）收稿日期：2011-05-16；

修订日期：2012-03-13

*通讯作者Correspondingauthor．E-mail：wangyy@nankai．edu．cn

ratesandgreatersensitivity．Regressionanalysisofenvironmentalfactorsandmicroorganismconcentrationswasmadebasedonfourmainfactors：temperature，pH，dissolvedoxygen，andconductivity．ResultsshowthatpHhasthemostsignificanteffecttowardsthetotalcellcountineachsample．Themoleculartechniqueusing16SrRNAprofilesgeneratedbyPCR-DGGEwasusedinordertodeterminethevariationinbacterialcommunitystructureofwaterandsludgesamplesfromtheSonghuaRiver．NestedPCRandtouchdownPCRwereutilizedforthepurposeofgeneratingmoreDNAfromsamples，especiallyaquaticsamples．Similarityanalysis，clusteranalysisandstatisticalanalysiswereperformedaccordingtotheDGGEgelsandthedataoutputbyQuantityOne．TheresultsshowedthatthebacterialpersityinwatersampleshasanandthedemarcationpointisneartheareaofHarbincity．However，obviousdiscriminationbetweenupperandlowerzones，

bacterialpersityinthesludgesamplesshowednosignificantdifferencesalongtheriverbasin．TheShanno-WienerIndex，UniformityIndexandrichnessofwaterandsludgesampleswerecalculatedaccordingtotheDGGEprofiles．Theresultsshowedthatthebacterialpersityandrichnessdecreasesfromdownstreamtoupstream．Thepresentstudyprovidesfundamentaldataforbacterialconcentrationandpersity，togetherwithinfluencingenvironmentalfactors，whichcouldbeusedtosupportthefuturediscriminationbetweenfunctionalzonesinthewholeSonghuaRiverBasin．KeyWords：SonghuaRiver；FCM；nested-PCR；DGGE；Bacterialpersity

2

松花江是黑龙江水系在我国境内的最大支流，全长1956km，流域面积达54．56万km，为我国东北部地

干流长，支流众多，流域面积广，污染情况较为复杂，工业污区最为重要的水上运输线之一。松花江水系发达，染和城市污染是其流域内污染的主要因素

［1］

。其次，松花江流域的生态环境一直承受着城市经济发展的压

［2］

自我恢复能力受到限制，造成土地沙化、水源涵养能力下降和水土流失严重；大量泥沙夹带有机质进入河力，

流，引起松花江干流有机质浓度增高和细菌的大量繁殖

。2005，受中国石油吉林石化公司爆炸事故影响，

［3］

松花江受到苯系物（苯、苯胺、硝基苯、二甲苯等）的污染，水质发生恶化，并将持续相当长的一段时间。新老污染导致的环境复杂性和流域面积广阔带来的水质数据不足，成为松花江监测和治理的障碍。为了弥补水环境数据的缺失，本研究从松花江微生物数量、群落多样性角度出发，分析松花江的水质状况和发展趋势，旨在分区、管理和治污提供一定程度的理论支持。为其进行监测、

关于微生物的数量和群落结构的研究，传统方法一般是对细菌进行分离、培养和鉴定，但这种方法具有无法避免的缺陷。Amann等人

［4］

——中营养湖泊中的研究发现，自然界中大部分的微生物无法通过培养鉴别—

可培养细胞占细胞总数的0．1%至1%，未受污染的河口水中可培养细胞也只占0．1%至3%，这意味着传统的培养方法推算出的水体微生物数量并不十分准确。本研究为了解决这一问题，采用了新型的流式细胞计数并通过与传统的平板计数方法（HeterotrophicPlateCount，HPC）比对，综合分析松花江的微生物数量。方法，

——流式细胞计数方法最早应用于水体微型生物的研究始于20世纪60年代末期，是水体生命科学研究热点———聚丙微型生物研究的重要工具。微生物群落结构分析采用的是基于核酸提取原理的分子生态学技术—烯酰胺凝胶电泳（DGGE）。这一技术基于细菌16SrRNA基因中可变区域碱基组成的差异，而对不同的细菌进行快速检测和鉴定，是当前微生物菌群研究的常用技术手段，在比较微生物群落的多样性以及监测种群动态等诸多方面得到广泛应用。11．1

材料和方法样品的采集

本研究采集了15个地点的水样和10个地点的底泥样品，总采样图见图1。其中水样的采集和保存按照《地表水环境质量标准》（GB3838—2002）进行。样品储存于50mL离心管中（4℃冰盒保存），运输回实验室后置于冷藏冰箱保存备用。1．2

细胞平板培养分析

平板培养采用LB固体培养基，每升培养基中含酵母膏5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂15g，加入高

［6］［5］

纯水补足至1L。液态培养基配制好后在121℃高温下冷却至50℃左右，在每个平板中倒入约灭菌30min，

15mL，紫外吹干后待用。取环境水样各3份，用浓度为0．85%的生理盐水稀释至100倍；混匀后，各取100μL稀释后水样加入已凝固的平板中，涂匀，于30℃恒温培养箱中倒置培养。72h后取出观察计数。1．3

流式细胞技术分析

加入取1mL待测水样过滤进一次性计数管中，SYBRGreenI核酸染料10μL（将10000×的母液于DMSO中稀释100倍），避光染色至少15min，进入流式细胞仪计数。选择绿色荧光作为微生物检测触发信号，该荧光在FL1通道显示，波长为（520±20）nm，通过空人为“设门”将目标细胞群和背景分离白和对照试验，

所有数据均通过流式细胞仪处理软件进行记录和分析。开，

［7］

图1

Fig．1

松花江干流部分地区采样图

SamplingmapofthemainstreaminSonghuaRiver

为了进行微生物细胞总数的检测，在进行样品计数前先作标准计数。取直径6μm的纳米玻璃珠（1．0×108个/mL）于质量分数为0．85%的生理盐水（已高压灭菌）中稀释10000倍，加入10μLSYBRGreenI染色至少15min，进入流式细胞仪计数。根据纳米玻璃珠已知的数量，与流式细胞仪记录的数值比对，得到一固定操作步骤同前，实际的细菌数目根据对照试验中已求固定参数和流式细胞仪的参数。在进实际环境样品时，

计数推算出。样品中微生物细胞数目的计算公式为：

细胞数目（个/mL）=获取细胞数×Beads总量/（Beads获取数×样本量）1．4

样品基因组总DNA的提取

USA）进行提取。提取前将水样静置一段时间，使水水样DNA采用DNeasyBlood和TissueKit（QIAGEN，

DNA提纯后重悬体中的沙砾等悬浮颗粒沉淀下来，取上层清液1．5mL按照试剂盒提供步骤进行DNA提取，于200μLTE缓冲液。泥样DNA采用淤泥基因组DNA快速提取试剂盒（离心柱型）进行提取，取样量为

（0.25±0．005）g，DNA提纯后重悬于50μLTE缓冲液。提取的DNA样品均置于－20℃保存备用。1．5

巢式PCR扩增

（1）根据NicoBoon等人［9］的实验结果，DNA含量较低的样品中富集目巢式PCR有利于从微生物较少、的基因；本研究采用这一手段，从松花江水样直接提取的DNA样品中富集目标DNA片段。巢式PCR扩增引CAGGCCTAACACATGCAAGTC）和1378r（5'-物为16SrDNAV3区的通用引物。第一步反应引物为63F（5'-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG）；第二步反应引物为338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和518r（5'-GC链结构为5'-ATTACCGCGGCTGCTGG）。为后续DGGE准备，引物338f需在其5'末端加上GC链，

［4］CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG。扩增产物片段长236bp。上述引物由生工生

［8］

物工程（上海）有限公司合成。

（2）巢式PCR反应体系，Mg2+终浓度为第一步反应体系为25μL，包括5μL10×PCR缓冲液（10mmol/L，1．5mmol/L），0．5μLdNTP（10mmol/L），0．25μLTaq酶（5u/μL），各0．5μLPCR前、后引物（10umol/L），17．25μLddH20和1μLDNA模板。第二步反应体系为50μL，体系中各组分由第一步反应的组分加倍，其中DNA模板由第一步PCR产物适当稀释而来。

（3）PCR反应程序为降落PCR（TouchDownPCR）。参考NiannianJi等人的程序［10］，改良程序如下：预变65—55℃1min，72℃1min；后20个循环为：94℃1min55℃性条件为94℃5min；前10个循环为：94℃1min，1min，72℃1min；72℃延伸7min。1．6

变性梯度凝胶电泳分析

Rad公司的DcodeUniversalMutationDetectionSystem电泳系统进行变性梯度凝胶电泳。本使用美国Bio-

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研究使用的是浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺=37．5∶1），选用的变性剂梯度为30%—60%［100%的变性剂中含有7mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺］，用1×TAE将两种变性梯度的溶液配至16mL，灌胶量为14．5mL。待胶凝固后，将20μL的PCR扩增产物和5μL溴酚蓝染料混合均匀，上样量为25μL。

YongLi等人［11］的做法，运行条件参考Zhi-根据PCR产物略作调整，具体如下：将上样后的胶板置于1×40mmol/LTris，40mmol/L冰乙酸，1．0mmol/LEDTA（pH值8．0）］TAE［电泳缓冲液中，恒温60°C，恒压140V跑4h。电泳完毕后，用ddH2O漂洗凝胶，再用0．5μg/mLEB染料染色30min，在ImageQuant350（GEhealth）成相系统下进行拍照并分析。1．7

数据分析

本课题选用的DGGE图谱分析软件为BioRad公司的凝胶定量软件QuantityOne。在图像处理过程中，首先排除干扰的背景后，经过泳道识别、条带识别和配对3个步骤，对图谱中的条带进行定量对图谱进行优化处理，

分析。根据定量结果，进一步得到泳道间的对比分析结果，主要包括泳道对比图、系统进化树和相似性矩阵图。

利用QuantityOne软件输出的DGGE图谱数据可计算各采样点的多样性指数、丰度及均匀度。其中，微生物群落的多样性指数其计算公式如下：

i=s

i=s

［12］

WienerIndex指数，指的是Shanno-一般用于比较各样品的细菌多样新，用H表示，

NiNi

ln）NN

H=－

∑（PilnPi）=－

i=1

∑（

i=1

Pi是某个样品中单一条带强度在该样的所有条带总强度所占的比率，s是某个样品中所有条带数目总式中，

N为泳道中所有条带的光密度和，Ni为第i个条带的光密度值。丰度（S）为DGGE胶中每个泳道的条带和，

数。均匀度（EH）为：

EH=

22．1

结果

松花江水域总微生物数量分析

流式细胞技术是利用流式细胞仪测量液相中悬浮在国内被广泛单细胞或微粒信号的一种现代分析技术，应用于医学、发酵和环保领域

［14］

HH［13］

=HmaxlnS

；但在细胞计数，尤其

是水生态方面的应用并不是十分广泛。

本课题利用流式细胞仪对松花江的总微生物浓度图2显示了该地区的总进行了检测。以呼兰河口为例，微生物数量。

流式细胞仪检测结果显示，各地区水样总微生物数

6

量的数量级在10左右，最高点出现在桦川段，其数值

6

为11．610×10；最低点出现在佳木斯段，其数值为

1.121×106。各地数值的连续性并不是很理想，在佳木斯、通河渡口地区的水生微生物总细胞数均与前后地区的总细胞数相差较大。2．2

平板培养细胞数与总细胞数的比较

表1所示为松花江干流部分自下游到上游的15个采样点所得数据。其中，总细胞数由流式细胞仪测得，可培养细菌数为平板培养方法测得，两种方法均设置3次平行试验并取平均值。15支水样中，总细胞数的数

图2呼兰河口水样总微生物计数FCM示意图

Fig．2FCMdot-plotfortotalbacterialconcentrationinwater

samplefromHulanRiverestuary

图中横坐标FITC（Fluoresceinisothiocyanate，异硫氰酸荧光素）表明使用的染料，纵坐标SSC（Sidelightscatter，侧向角散射）产生的散射光信号提供有关细胞颗粒性质的信息；右下部分的密集点群为经SYBRGreenI染色显示出的微生物细胞颗粒

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量级在10左右，而平板培养细胞数仅为10左右，在总细胞数中所占比例为0．05%至5%，平均比例不超过2%。这一结果表明，传统的平板培养测数方法容易低估水环境中实际的微生物数量。在连续性方面，流式计数法给出的总细胞数在某几点上不是很连续，在总体看来还是有一定的变化规律；而平板培养细胞数则较为其各点前后相差数目均比较明显，不具有连续性。缺乏规律性，

表1

Table1

松花江干流部分地区水样平板培养微生物计数

HPCandtotalbacterialconcentrationindifferentwatersamplesfrommainstreamoftheSonghuaRiver

总细胞数（×106）

Totalcells

4．6404．5807．65011．6001．1206．3606．6306．5906．2003．9904．7602．3004．4009．3003．080

可培养细胞数（×104）

Cultivablecells

18．6000．66710．8000．5876．3304．87015．9004．5705．10011．8004．47010．6000．7134．00011．400

可培养细胞所占百分比

Percentage（Cultivablecells/Totalcells）

4．02%0．15%1．41%0．05%5．65%0．77%2．40%0．69%0．82%2．97%0．94%4．61%0．16%0．43%3．70%

取水地点

Watersamplingspots同江三江口富锦桦川佳木斯哈尔滨四方台东江桥阿什河口呼兰河口大顶子山倭肯河宏克力通河渡口依兰

Allen［15］提出，平板计数法，不管其具体方法如何，都无法完全表达出水样中真正的微生物含量。在Kell［16］等人看来，平板计数方法可能会忽略水环境中具有生理特性表达但是无法培养成为肉眼可见的群落的因此，这一方法所得的细菌数量将大大少于实际的有效值，降低了平板培养方法的有效性和可信度。细胞，

相对而言，流式细胞仪对于水样的检测时间仅需要几分钟；能够有效地给出样品中总的细胞数量；并且，通过不同的染色剂，还能选择性的采集专门细胞的信息。在国内的水生态微生物研究中，流式细胞计数还处在起步阶段，但可以预测，这一技术在该领域还将具有极大的发展潜力。2．3

pH值、水温、溶解氧和电导率对水样微生物浓度的影响

处于一种动态变化和平衡的过程，环境因素的研究在探微生物的种类和数量受到外界环境因素的影响，

pH值、讨微生物数量分布方面具有重要的作用。本课题在各采样点收集了水温、溶解氧和前十个采样点的电本课题仅对采样地区导率这四项基本环境影响因子的数据。由于各地区平板培养细胞数量没有明显的规律，

利用SPSS软件对各环境因子和该地的的微生物总细胞数进行了分析。结合在采样点收集的各项环境信息，计算各影响因子的相关系数，结果见表2，图3。微生物浓度进行回归分析，

表2

Table2

环境影响因子与微生物浓度的相关性分析

［17］

Thecorrelationanalysisbetweenmainenvironmentalfactorsandbacterialconcentration

水温

Temperature

电导率Conductivity－0．050．859

酸碱度pH－0．4230．116

溶解氧Dissolvedoxygen

－0．3770．167

相关系数CorrelationcoefficientP

0．3650．221

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图3

Fig．3

松花江水样各点环境影响因子的变化趋势

ChangesofenvironmentalfactorsinthewatersamplesfromSonghuaRiver

根据分析结果，在4项检测的环境因子中，对微生物数量分布影响相对最大的为pH值。电导率和pH值对微生物数量都属于负相关的作用，而水温和溶解氧属于正相关作用。在采样点东江桥段，水温和溶解氧均其变化原因目前还无法分析。出现较大幅度的变化，2．4

水样微生物群落结构的DGGE图谱分析

电泳图谱如图4。水样共有15个，其根据1．6变性梯度凝胶电泳分析中所述实验条件进行DGGE电泳，

中左起至右端的加样顺序为下游至上游的微生物DNA扩增片段。左起至右端泳道对应的采样点为：同江、三富锦、桦川、佳木斯、哈尔滨、四方台、东江桥、阿什河口、呼兰河口、大顶子山、倭肯河、宏克力、通河渡口、江口、依兰。

应用DGGE技术分离PCR扩增产物，可以看到，泳道上分离出若干条带，并且各泳道的条带数、强度和迁移率均存在一定程度的差异，充分显示了水环境中微生物的多样性。将1号水样同江作为标准，根据戴斯系数Cs（Dicecoefficient）计算出各样品的相似性矩阵图，戴斯系数的范围是从0（没有共同带）到1（所有的条带通过UPGMA算法可实现聚类分析，生成系统树聚类分析（UPGMA）（图5）。相同）。利用相似性矩阵数据，

15个水样微生物群落大体上分成3个族群。其中，6号水样（哈尔滨）与其他的水样微生物差图5可见，

DNA提取量较其他水样都少，该段水质也最清，这可能与采水点的周边环境有关异均比较明显；在采水样时，

系。余下的水样微生物群落在系统树上明显分成两大族群。根据实际的地理位置分析，应为：下游三江口至桦川为一大族群，中下游佳木斯至中上游阿什河口为一大族群，上游的东江桥和四方台两处族群与邻近的采有可能与其上游自成一大族群。各族群内又分化为更小的相似性族群，而相邻两地水样点族群相似度不高，

样中微生物群落的相似性一般较高。总体上看，水样中的微生物群落结构出现了较为明显的分区特征。

水样微生物的多样性指数、均匀度和丰度见表3。

15个水样中的多样性指数处于2到3之间，由表3可见，均匀度较为平均，而丰度变化不一。总体来看，从下游至上游，水样微生物的多样性在逐渐递减。2．5

底泥微生物群落结构的DGGE图谱分析

底泥电泳图谱如图6，其中左起至右端的加样顺根据1．6DGGE中所述实验条件和方法进行DGGE电泳，

序为同江、三江口、富锦、桦川、佳木斯、四方台、大顶子山、倭肯河、通河渡口、依兰的微生物DNA扩增片段。

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图5

图4

Fig．4

水样中菌群16SrDNA的DGGE指纹图谱

Fig．5

水样微生物的DGGE（UPGMA）分析

DGGEClusteranalysis（UPGMA）ofamplifiedDNA

DGGEfingerprintanditspatternofthe16SrDNAofthe

fromwatersamples

bacteriafromwatersamples

表3

水样微生物的多样性指数、均匀度和丰度

根据DGGE图谱分析，松花江干流部分的底泥样品中微生物含量均十分丰富，并且不同的采样地点之间下游第一处采样点）作为标准，得出其他各点的相似性分析具有一定的差异。泳道比较图将1号泥样（同江，图。实现聚类分析，生成系统树（UPGMA）（图7）。

底泥中微生物群落的相似度比水样高。其中，相似度最高的为4号采样点桦川和5号采样点佳木斯，两底泥的群落分布并没有很明显的地域分区，部分不相邻的采样点反而具有较高的群者为相邻采样点。但是，

可能的原因有以下两种：首先是底泥作为沉积物，包含的无机物和有机物含量丰富，群落落相似度。据分析，

影响因素众多，并非只受到某种单一因子或某些因子的影响；其次，底泥中微生物的变化不如水样结构复杂，

受到外界环境因素的影响大，相邻两采样点之间并没有严格的分界线，连续性好，微生物可以四处迁徙，因此底泥未能同水样一样，出现较为明显的分区现象。底泥微生物的多样性指数、均匀度分区现象不明显。因此，

和丰度的计算由1．7中的公式可得，其数值如表4所示。

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图7

图6

Fig．6

底泥中菌群16SrDNA的DGGE指纹图谱

Fig．7

DGGEfingerprintanditspatternofthe16SrDNAofthe

泥样微生物的DGGE（UPGMA）分析

DGGEClusteranalysis（UPGMA）ofamplifiedDNA

fromsludgesamples

bacteriafromsludgesamples

表4

底泥微生物的多样性指数、均匀度和丰度

由表4可见，从松花江下游至上游，微生物群落的多样性和丰度在逐渐下降，微生物群落由复杂变为简单，但是均匀度基本一致，细菌分布较为均匀。这一变化趋势与水样的微生物群落变化趋势一致。3

讨论

在以往关于松花江流域的研究工作中，大部分是探讨某一区域的微生物数量根据环境条件的变化情况，或者某一地段的污染监测状况。徐海超

［18］

等人对松花江吉林段的水体中可培养菌落数进行了研究分析，结

［19］

合季节和环境因子分析微生物数量的变化规律；程英等人计，给出综合的生物学评价；战培荣、卢晏生等人

［20］

对松花江哈尔滨江段水生生物进行了调查和统

通过对松花江哈尔滨段冰封期制糖废水污染区微生物组

成的调查、数学模式计算、污水优势群落生物体系和有机污染综合评价得出松花江污染区段的水质状况。也RenLiu［21］对松花江水体中有如重金属离子、有机物等。Jia-有一部分工作侧重于松花江特定污染物的降解，

haiGUO［22］调查了松花江沉积物中Fe、Mn、Cu、Pb和Cd的含量，机物的遗传毒性进行了研究；Shu-并讨论了重金属离子的分布规律。在松花江苯污染事件爆发后，关于松花江中苯系物的迁移转化规律和治理修复条件

［23］［24］［25］

得到了广泛的关注和研究。ZonglaiLI探讨了松花江中硝基苯的生物可降解性，张振宇和刘百仓研

究了利用活性炭去除松花江原水中硝基苯的技术参数和效果。可见，对于松花江生化状况的研究虽然并不少见，但系统性、全面性、有序性地分析松花江干支流地区水域及底泥中微生物的群落多样性及其结构变化的工作并未有人完成。本实验作为该方面的一个初探，在一定程度上弥补了这一空白，并有望在未来对松花江进行多点重复采样，进一步完善松花江微生物总细菌数量和微生物群落多样性的数据研究。

流式细胞技术作为水生态领域新引进的一项技术，在这一领域的应用主要体现在以下几个方面：（1）水如选择双荧光染料（SYBRGreen结合PI）检测细环境中细菌的计数及生物量统计：（2）细菌的生理生化分析，

菌活性；（3）结合其他技术手段对水环境生态状况进行更深层面的监测分析，如结合ATP测定或变性梯度凝qin等人［26］通过流式细胞仪和其他技术，胶电泳（DGGE）的方法等。HuangBang-对中国南海北部的微型生物数量、群落结构等进行了生态分析。Karina

［27］

利用流式细胞仪调查了百慕大大西洋不同季节的浮游植物和

［28］

得出一年中不同季节海中浮游植物和细菌的水平变化和垂直变化规律；KyokoHibi等人发细菌的生物量，

结合免疫手段和流式细胞技术可以快速检测出土壤和水体中某种特定的致病细菌。综合流式细胞仪计数现，

和传统的平板培养计数（HPC）这两种计数方法比较发现，流式细胞仪检测出的水样之间连续性较高，其总细

［29］

胞数量要高于平板计数所得数量1—2个数量级；正如FrederikHammes等人的研究表明，可培养细胞只占

总细胞数的1%左右。再者，由于许多能够在水环境中表现出生理活性的细胞无法进行培养，导致计数结果偏低，会给研究造成不可消除的误差。在这一方面，流式细胞技术表现出了良好的应用潜力。

黄江丽

［30］

在对松花江流域吉林段的水质进行监测分析后得出，该区段水质呈有机污染特征，主要污染物

氨氮等。这一污染特征也基本体现在松花江整体流域的范围，并对微生物数量和分布造成一包括高锰酸盐、

pH值、定程度的影响。此外，本研究也就河流水温、溶解氧和电导率这四项基本环境影响因子进行了监测分四者均以不同的程度影响水体中微生物的数量，其中，以pH值与微生物数量的相关性最高。析。结果表明，

［31］

变形梯度凝胶电泳技术（DGGE）是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一［32］

种分析技术，是一种可以直接用于检测复杂微生物群体的基因多样性的方法。DongLi利用DGGE技术探

并对其中的重要菌落进行了分析；Mauro讨了硝基苯污染事件后松花江沉积物的微生物群落多样性变化，

Celussi［33］结合分子生物学技术和DGGE手段分析了的里雅斯特海湾中细菌浮游生物随时空分布的差异。由于水样中直接提取的微生物DNA含量较少，基于HafezSuzuki疑，

［35］

［34］

等人的研究表明，巢式PCR能比普通PCR扩增出

［36］

本课题选择了巢式PCR反应手段和Touchdown反应程序。巢式PCR曾受到部分学者的质更多的DNA产物，

认为，这种选择性的扩增可能会在重复的扩增步骤中引起较大的偏差。但Heuer

提出，这种说

YuFan等人［37］也认为，法对偏差的估计过大；Zhen-巢式PCR并没有特别的偏差，仍可适用于检测微生物多Rad分析软件QuantityOne被用于DGGE图谱各泳道条带的分析。结果表明，底泥样性的实验。专门的Bio-的相似性较高，连贯性较好，但是没有明显的聚类现象，分区不明显；而水样的相似性虽略低于底泥，上下游却有较为明显的分区效果，以8号水样（东江桥）和9号水样（阿什河口）为界，出现了各有差异的群落多样性和聚类特征。从多样性指数、丰度和均匀度的数据来看，水样和底泥的均匀度都比较相近，变化不大；但多样性指数和均匀度均呈现出从下游至上游逐渐降低的趋势。水样的多样性指数和丰度在整体上要略低于底泥。

松花江作为黑龙江在我国境内的最大支流，水量充沛，支流众多，微生物群落丰富。本研究将松花江水样的微生物多样性与其他水体进行了比对，发现，阳澄湖Schauer等人势。在国外的水生态研究中，富的情况。Casamayor等人

［41］

［40］

［38］

湖区微生物多样性在2．4—2．8之间，而巢湖

［39］

的

微生物多样性为2．56—3．10。可见，松花江的微生物多样性比较符合一般特征，且相较而言呈现出稍高的趋

DGGE手段评价沿Catalan海岸（NWMediterranean）利用PCR-浮游细菌的组成。结果显示，这一地区的丰度为17—35，多样性指数在2．5和3．0之间，属于微生物群落较丰

结合显微镜和分子生物学手段，对Ciso和Vilar湖中的微生物群落进行了时空

分析，其中丰度仅为8—17左右。可以推测，松花江水体中微生物群落的多样性和丰度高于内陆湖，略低于外海，在整体上属于中上水平。

在微生物生态研究领域，不同的技术手段和方法正被综合起来运用，如Jochem等将荧光原位杂交技术和

［42］

流式细胞仪技术相结合，从而准确鉴定海洋中细菌的种类

；LaetitiaBernard［43］利用FCM的分选功能和

DGGE方法达到分析水生态系统中可培养和具有生物效应的细菌多样性的实验目的。随着流式细胞仪等新兴技术的发展，综合实验手段将会迅速被带动起来，并大大扩展分子生物手段和细胞手段在微生物方面的应用领域。

致谢：感谢南开大学环境科学与工程学院周启星老师、于宏兵老师以及刘硕、刘尧等同学的支持与帮助，感谢华涛老师提供化学数据。

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