双波长法测定安钠咖中组分含量55

双波长法测定安钠咖中组分含量

一、实验目的和要求

1、掌握紫外可见分光光度计的基本操作；

2、掌握双波长分光光度法测定二元混合物中待测组分含量的原理和方法； 3、掌握在物质中吸收曲线上寻找吸收点、测定波长、参比波长的方法； 4、掌握标准曲线绘制及应用；

5、了解双波长分光光度法在单光束分光光度计上的测定方式。 二、实验原理

每毫升安钠咖注射液中含0.12g无水咖啡因和0.13g苯甲酸钠，要求二组分的含量均应为标示量的93%~107%。在0.10mol/L盐酸溶液中，苯甲酸钠在230nm波长处有一较强吸收峰，咖啡因在272nm波长处有一较强吸收峰；二者吸收曲线重叠十分严重，直接采用吸光度进行定量测定时，相互之间有严重干扰。

根据光吸收定律，溶液吸光度应为各个组分吸光度的加合。当在230nm波长处测定苯甲酸钠（此时把咖啡因视为干扰组分）时，测定的吸光度为：

A230

安钠咖

=A230

苯甲酸钠

+A230

咖啡因

但是在咖啡因的吸收曲线可以发现，咖啡因在230nm和257nm两波长处得吸收相等（吸光度值相等，即等吸收点）：

A230

咖啡因

=A257

咖啡因

因此，通过直接测定混合物溶液在230nm和257nm两波长处得吸光度值，再计算二吸光度的差值，可消除咖啡因对苯甲酸钠测定的干扰：

ΔA=A230

安钠咖

—A257

安钠咖

=（A230 =A230

苯甲酸钠

+A230

咖啡因

）—（A257

苯甲酸钠

+A257

咖啡因

）

苯甲酸钠

—A257

苯甲酸钠

=（ε

苯甲酸钠

230

苯甲酸钠

b—ε

苯甲酸钠

257

b）C

苯甲酸钠

=KC

可以看出，混合物溶液在230nm和257nm两波长处得吸光度差值仅与苯甲酸钠浓度成正比，而与咖啡因浓度无关，从而实现苯甲酸钠的定量分析。

同理，当在272nm波长处测定咖啡因（视苯甲酸钠为干扰组分）时，可选择272nm和253nm两个苯甲酸钠的等吸收点波长进行测定，混合物溶液在这两个波长处得吸光度差值仅与咖啡因浓度成正比，而与苯甲酸钠浓度无关，可消除苯甲酸钠对咖啡因测定的干扰，从而实现咖啡因的定量分析：

ΔA=KC

咖啡因

三、实验仪器与试剂

752型或UV-265型分光光度计；标准咖啡因储备溶液（0.2500mg/ml）；标准甲酸钠储备溶液（0.2500mg/ml）；盐酸溶液（0.10mol/L）；50ml容量瓶12个；5ml移液管4只；1cm石英比色皿2个；

安钠咖样品溶液。 四、实验步骤

1、咖啡因标准系列溶液配制

按照下表配制咖啡因标准系列溶液

2、苯 3、 移取0.25mg/ml标准咖啡因储备4、 1.00ml 2.00ml 3.00ml 4.00ml 5.00ml 溶液体积 5、 系列标准咖啡因溶液浓度 5μg/ml 10μg/ml 15μg/ml 20μg/ml 25μ6、g/ml 以上溶液均用移液管移取至50ml容量瓶中，用0.10mol/L盐酸溶液稀释至刻度7、 说明 并摇匀 8、 9、甲酸钠标准系列溶液配制

按照下表配制苯甲酸钠标准系列溶液

10、 编号 咖1 咖2 咖3 咖4 咖5 11、 移取0.25mg/ml标准苯甲酸钠储12、 1.00ml 2.00ml 3.00ml 4.00ml 5.00ml 备溶液体积 13、 系列标准苯甲酸钠溶液浓度 5μg/ml 10μg/ml 15μg/ml 20μg/ml 25μg/ml 14、 以上溶液均用移液管移取至50ml容量瓶中，用0.10mol/L盐酸溶液稀释至刻度15、 说明 并摇匀 16、 17、标准混合溶液和样品溶液配制

按照下表配制标准混合溶液和样品溶液

18、 编号 6（标准） 7（样品溶液） 19、 移取0.2500mg/ml标准咖啡因储备溶液20、 2.00ml，0.2500mg/ml标准苯甲酸钠储备溶液移取安钠咖样品溶液1.00ml 21、 2.00ml 22、 以上溶液均用移液管移取至50ml容量瓶中，用0.10mol/L盐酸溶液稀释至刻度23、 说明 并摇匀 24、 25、咖啡因等吸收点波长组合

在选定的波长处，用1cm比色皿，以0.10mol/L盐酸溶液作为参比溶液，按照下表测定咖2溶液在下列波长处的吸光度值，并对测定数值进行比较，选择用于苯咖啡因定量测定的波长组合。

编号 咖1 咖2 咖3 咖4 咖5 波长 吸光度 230nm 0.303 253nm 0.283 254nm 0.304 255nm 0.317 256nm 257nm 258nm 测定波长出吸光度值 选择的参考波长 测定波长为230nm，其吸光度：A=0.303 吸光度与230nm波长相等点的波长：λ1=254nm 26、苯甲酸钠等吸收点波长组合 在选定的波长处，用1cm比色皿，以0.10mol/L盐酸溶液作为参比溶液，按照下表测定苯2溶液在下列波长处的吸光度值，并对测定数值进行比较，选择用于苯甲酸钠定量测定的波长组合。

波长 吸光度 272nm 0.108 249nm 0.124 250nm 0.115 251nm 0.108 252nm 253nm 254nm 测定波长出吸光度值 选择的参考波长 测定波长为272nm，其吸光度：A=0.108 吸光度与272nm波长相等点的波长：λ2=251nm 27、系列标准溶液及样品溶液的测定 在选定的组合波长处，用1cm比色皿，以0.10mol/L盐酸溶液作为参比溶液，按照下表分别测定

系列标准溶液、标准混合溶液及样品溶液的吸光度值，并计算对应的吸光度差值。 溶液编号 咖1 咖2 咖3 咖4 咖5 苯1 苯2 苯3 苯4 苯5 6（标混） 7（样品） 测定波长 230nm — — — — — 0.425 0.797 1.161 1.526 1.860 1.056 2.115 λ1 — — — — — 0.072 0.094 0.119 0.140 0.165 0.351 0.661 ΔA1 — — — — — 0.353 0.703 1.042 1.386 1.695 0.705 1.454 272nm 0.287 0.531 0.778 1.014 1.255 — — — — — 0.605 1.150 测定波长 λ2 0.147 0.248 0.355 0.456 0.562 — — — — — 0.320 0.591 ΔA2 0.140 0.283 0.423 0.558 0.693 — — — — — 0.285 0.559 五、实验数据处理 1、标准曲线的绘制

根据上述测定结果，在坐标纸上以吸光度差值作为纵坐标，系列标准溶液的浓度作为横坐标制图，分别绘制ΔA1-苯甲酸钠系列标准溶液浓度、ΔA2-咖啡因系列标准溶液浓度两条标准曲线。

ΔA1-苯甲酸钠系列标准溶液浓度标准曲线：

ΔA2-咖啡因系列标准溶液浓度两条标准曲线：

2、样品溶液中苯甲酸钠、咖啡因含量的计算

根据7号样品溶液在组合波长的吸光度差值，通过标准曲线函数式求出其中苯甲酸钠、咖啡因的浓度值，用下式计算出苯甲酸钠、咖啡因的含量：

Cx=C读取值×50.00

根据ΔA1-苯甲酸钠系列标准溶液浓度标准曲线方程式y=0.0673x+0.0257可得到样品溶液中苯甲酸钠溶液浓度

?A1?0.02571.454?0.0257 C1==μg/ml=21.22μg/ml

0.06730.0673 所以 C苯甲酸钠=C1×50.00=1.06mg/ml

根据ΔA2-咖啡因系列标准溶液浓度两条标准曲线方程式y=0.0276x+0.0051得样品溶液中咖啡因溶液

浓度

?A2?0.00510.559?0.0051 C2==μg/ml=20.09μg/ml

0.02760.0276所以 C苯甲酸钠=C1×50.00=1.00mg/ml

3、比较法计算苯甲酸钠、咖啡因标示量

分别采用下列公式计算样品溶液中苯甲酸钠、咖啡因标示量，其中120、250、130为国家药典规定的转换系数：

苯甲酸钠标示量%=?A1×标混1样品样品?A250咖啡因标示量%=?A××50=204.31

120?A2标混2250×50=198.31 130六、实验注意事项

1、测定系列标准溶液和样品溶液时，必须使用同一只比色皿；

2、比色皿放入分光光度计样品室前，必须用吸水纸将外表面擦拭干净； 3、比色皿在换装不同浓度溶液时，必须用待测液润洗至少三次；

4、在比色皿未放入分光光度计测定光路时，必须将样品室舱盖打开；

5、在标准系列、标准混合及样品溶液的吸光度测定时，必须按照表格由上至下进行测定，待一个波长测定完成后，才能更换波长，进行下一个序列测定。 七、讨论

1、测定过程中，为什么要首先确定等吸收点？因为根据等吸收点可以消除一种组分对另一种组分的干扰，其原理在实验原理里有。

2、双波长分光光度法是如何消除共存组分干扰的？通过测定一种组分的等吸收点，再计算二度吸光值的差值，从而消除一种组分对另一种组分的干扰。

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