土壤酶测定方法

土壤酶测定方法

芳基酰胺酶 Arylamidase （EC 3.4.11.2）

试剂：

1、THAM缓冲液（0.1 M，pH 8.0）：2.44 g 三羟甲基氨基甲烷溶于50 mL水中，用0.05 M H2SO4滴定调节pH，加水稀释溶液至200 mL。

2、L-leucine β-naphthylamide solution L-亮氨酸β-萘胺（8.0 mM）(2 mM)：称取0.2342 g L-亮氨酸β-萘胺盐酸盐溶于水，定容至100 mL。 3、Ethanol 乙醇：（95%）

4、Acidified ethanol 酸化乙醇（0.26 M HCl）：4.32 mL浓HCl加入乙醇中，用乙醇定容至200 mL。

5、p-Dimethylaminocinnamaldehyde solution 对二甲氨基肉桂醛溶液 (0.6 mg/mL)：0.12 g 对二甲氨基肉桂醛溶于乙醇，用乙醇定容至200 mL。 6、标准液β-萘胺溶液（β-naphthylamine）（125 ug/mL）：称取12.5 mg β-萘胺，75 mL蒸馏水，5 mL乙醇，用蒸馏水定容至100 mL。

7、β-萘胺标准曲线：分别吸取1，2，3，4，5，6 mL标准液β-萘胺溶液（125 ug/mL）与25 mL容量瓶，定容。标曲溶液浓度分别为：5，10，15，20，25，30 ug/mL β-萘胺 。 步骤：

1、称取1 g土壤（风干，<2 mm）于25 mL 三角瓶，加入3 mL 0.1 M 的THAM缓冲液（pH 8.0），1 mL 8.0 mM 的L-亮氨酸 β-萘胺盐酸盐。三角瓶涡旋几秒，混匀，密封，放置在震荡培养箱1 h（37oC）。

2、 培养结束后，加入6 mL乙醇（95%）终止反应，土壤悬浮液立即混匀，转移至离心管，在17000xg离心1 min。

3、将上层清液转移至测试管，阻止基质的进一步水解。吸取1 mL上层清液至另一个测试管，加入1 mL乙醇，2 mL 酸化乙醇，2 mL对二甲氨基肉桂醛溶液，混合溶液涡旋混匀，红色偶氮化合物在540 nm下比色。

4、当红色偶氮化合物的浓度超过最高浓度的标准β-萘胺溶液，能整除的红色偶氮化合物用乙醇稀释，直到在表曲线上。按照每1 mL标曲溶液，加入1mL乙醇，2 mL酸化乙醇，2 mL对二甲氨基肉桂醛。 5、对照处理，1 mL的基质在培养结束后加入。

参照方法来自于：Acosta-Mart?′Nez V, Tabatabai M A. Arylmidase Activity of Soils [J]. Soil

Science Society of America Journal, 2000, 64：215-221

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶 N- acetyl-β-D-glucosaminidase （NAG，EC 3.2.1.52）

试剂：

1、 醋酸盐缓冲液（100 mM，pH 5.5）：醋酸钠 (CH3COONa·3H2O) 13.6g

溶于800 mL水中，用99%的冰醋酸滴定至pH为5.5，定容至1L。

2、Modified universal buffer (MUB, 5X 储备液)：12.1 g三羟甲基氨基甲烷，11.6

g顺丁烯二酸（maleci acid），柠檬酸（citric acid）,6.3 g硼酸（H3BO3）溶于 488 mL 1 M 的NaOH溶液，蒸馏水定容至一升。5X储备液4oC保存。此溶液被滴定到想要的pH,用之前先用蒸馏水稀释5倍。

2、底物p -Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide （10 mM）：0.342 g p -Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide（对硝基苯乙酰基氨基葡萄糖苷） 溶于100 mL醋酸盐缓冲液（0.1 M，pH 5.5），4oC保存。

3、氯化钙（CaCl2，0.5 M）：36.75 g CaCl2·2H2O溶于400 mL水中，定容至500 mL。 4、氢氧化钠（NaOH，0.5 M）：10 g NaOH溶于400 mL水中，定容至500 mL。 5、标曲对硝基酚（p-nitrophenol）溶液：1.000 g p-nitrophenol，溶于800 mL水中，定容至1L，4oC保存。（1000 ug/mL）

6、标准曲线绘制：吸取1 mL标准对硝基酚溶液，定容至100 mL（10 ug/mL）。吸取0，1，2，3，4，5 mL稀释的标准液，用蒸馏水补齐5 mL，浓度分别为0，10，20，30，40，50 ug 对硝基酚。 步骤：

1、 称取1g 土壤于50 mL三角瓶，加入4 mL 0.1 M的醋酸盐缓冲液（pH，5.5）,1

mL 10 mM p -Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide，混匀，密封，37oC培养1 h。

2、 培养结束后，加入 1 mL 0.5 M 的CaCl2和4 mL 0.5 M 的NaOH终止反应，过

滤，然后在405 nm 比色。

3、 无土对照只加试剂，无基质对照培养结束后在0.5 M 的CaCl2和4 mL 0.5 M

的NaOH终止反应后，再加入基质。

参照方法来自于：J.A. Parham, Deng S P. Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil [J]. Soil Biology & Biochemistry, 2000, 32: 1183-1190

L-天冬酰胺酶 （L-asparaginase） L-谷氨酰胺酶 （L-glutaminase）

试剂： 1、甲苯

2、THAM缓冲液（0.1 M, pH 10）：12.2 g三羟甲基氨基甲烷溶于800 mL蒸馏水，用 0.1 M 的NaOH调节pH至10，定容至1 L。

3、L-天冬酰胺溶液（0.5 M）：1.65 g L-天冬酰胺到25 mL容量瓶，用THAM缓冲液定容，混匀。

4、KCl （2.5 M）：硫酸银溶液， 100 mg Ag2SO4溶于700 mL蒸馏水，称取188 g KCl 溶于硫酸银溶液，定容至1 L。 步骤： 1、

称取5g土（< 2 mm）在50 mL容量瓶，加入 0.2 mL甲苯，9 mL THAM缓冲液，涡旋混匀，加入1 mL 0.5 M的L-天冬酰胺溶液，涡旋混匀，密封，37oC培养2 h。 2、 3、 4、

培养结束后，加入35 mL KCl-Ag2SO4溶液，混匀，温度降低到室温（约5min），用KCl-Ag2SO4溶液定容至50 mL，摇匀。

测定土壤悬浮液中NH4+-N，容量瓶摇匀，吸取整除的20 mL悬浮液至100 mL蒸馏瓶，释放的NH4+-N用蒸馏法测定，0.2 g MgO 3 min。 无机质对照，在培养结束后加入1 mL 0.5 M的L-天冬酰胺溶液（KCl-Ag2SO4溶液加入之后）。

参照方法来自于：Frankenberger W T, Jr., Tabatabai M A. L-Asparaginase activity of soils [J]. Biol Fertil Soils 1991, 11: 6-12.

Jr W T F, Tabatabai M A. L-glutaminase activity of soils [J]. Soil Biology & Biochemistry, 1991, 23(9): 869-874.

β-葡萄糖苷酶

1、 甲苯

2、 Modified universal buffer (MUB)

3、对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷 p-Nitrophenyl-β-D -glucopyranoside（25 mM） ：称取377mg溶于40 mL MUB (pH, 6.0) ,用MUB定容至50 mL。 4、CaCl2 （0.5 M）：称取73.5 g CaCl2·2H2O溶于700 mL蒸馏水，定容至1 L. 5、THAM (0.1 M，pH 12)： 6、对硝基酚标准溶液： 步骤：

1、称取1g土壤在50 mL三角瓶，加入0.25 mL 甲苯，4 mL MUB (pH 6.0)，1 mL葡葡糖苷溶液，涡旋混匀，密封，在37oC培养1 h。

2、培养结束后，加入1 mL 0.5 M CaCl2，混匀，加入4 mL 0.1 M THAM（pH 12）。混匀，过滤。400 nm比色。

3、当滤液的颜色吸光值超过最高浓度对硝基酚标准溶液，整除倍的滤液，用0.1 M THAM (pH 10)稀释，直到吸光值在标曲上。

4、无基质对照，在培养结束后加入1 mL基质（加入1 mL 0.5 M CaCl2和4 mL 0.1 M THAM， pH 12之后）。

参照方法来自于：Eivazi F, Tabatabai M A. Glucosidases and galactosidases in soils [J]. Soil Biology & Biochemistry, 1988, 20(5): 601-606.

荧光二乙酸酯水解酶（FDA）：

试剂：

1、磷酸钠缓冲液（pH 7.6）：称取22.74 g Na3PO4·12H2O，溶于700 mL蒸馏水，定容至1 L。用1 M的HCl 调节 pH。

2、FDA底物（C24H16O7）：称取5 mg FDA 溶于10 mL 丙酮，使得溶液浓度为12.01 uM FDA mL-1。

3、荧光素标准溶液：称取10 mg 荧光素（C20H12O5），加入到含有10 mL 的丙酮的50 mL容量瓶，用磷酸钠缓冲液（pH）定容至50 mL，溶液浓度为602 uM。 步骤：

1、称取1 g风干土在125 mL三角瓶，加入50 mL 60 mM 的磷酸钠缓冲液（pH 7.6），0.5 mL 4.9 mM FDA脂肪酶底物溶液（20 mg FDA脂肪酶底物溶于10 mL丙酮），密封，涡旋几秒混匀。37oC培养3 h。加入2 mL 丙酮，涡旋混匀，终止FDA水解。

2、取30 mL土壤悬浮液与50 mL离心管，在8000r/min离心5 min。过滤，吸取滤液至管，在490 nm波长下比色。

3、无基质对照，通用按照上述操作，但是以0.5 mL的丙酮代替FDA脂肪酶底物溶液。空白（不加土壤，只有试剂）在37oC会有轻微的颜色变化，结果应该减掉。

4、标曲绘制：吸取0.15，0.5，1.5，2.5 mL荧光素标准溶液与50 mL容量瓶，浓度分别为0.03，0.1，0.3，0.5 mg/mL，加入磷酸钠缓冲液（pH 7.6），2.5 mL丙酮，定容。在490 nm波长下测定吸光值。如果样品的吸光值超过标曲，用磷酸钠缓冲液稀释样品至吸光值在标曲的线性之内。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/md23.html