血清成分分析 - 图文

血清成分分析

姓名：Lotus 指导老师：吴明江

摘 要 ：本文以家鸡血清和乌骨鸡血清为原料，采用邻苯二甲醛法对两者血清胆固醇进行测定；通过盐析分离血清清蛋白与γ-球蛋白，并对蛋白质进行透析与浓缩；采用凝胶层析法分离重铬酸钾和蓝葡聚糖混合液；采用醋酸薄膜电泳法鉴定血清清蛋白与γ-球蛋白；并以家鸡肝脏为原料，进行了谷丙转氨酶活力的鉴定。 关键词： 血清、肝脏、成分分析

前言

血清总胆固醇测定是血脂分析的常规项目, 测定方法很多, 目前国内大多数实验室的常用方法有酶法、硫酸一磷酸一高铁显色法、硫酸一醋醉直接显色法、硫酸一醋酐煮沸显色

1

法及邻苯二甲醛一硫酸显色法。本次实验用邻苯二甲醛酸法进行测定。

而通过血清清蛋白与γ-球蛋白的分离可以了解蛋白质等生物大分子的一些特性。 血清谷丙转氨酶以下简称谷丙酶，谷丙酶活力测定对于病毒性肝炎的诊断价值已被一致肯定。肝病早期诊断, 疗效观察, 以及流行病学调查等方面均有一定意义。通过本次实验将让我们了解到基本的血清成分测定方法。

1、血清胆固醇的定量测定

1.1 实验材料与方法 1.1.1 材料与试剂

鸡血清：一管为家鸡血清，一管为乌骨鸡血清

邻苯二甲醛试剂，90%醋酸，混合酸，标准胆固醇贮液（1mg/mL），标准胆固醇应用液（0.1mg/mL） 1.1.2方法

邻苯二甲醛法3测定血清总胆固醇 1.2数据处理

绘制表格记录标准曲线及样品各试剂吸光值。绘制标准曲线，在曲线上描出与样品吸光值对应的胆固醇含量。 1.3实验结果

1.3.1 标准曲线的绘制

表1 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇——标准曲线的绘制 试剂 标准胆固醇应用液/mL 醋酸/mL 邻苯二甲醛试剂/mL 蒸馏水/mL 混合酸/mL 编号 0 0 0.4 0.2 0.01 4.0 1 0.1 0.3 0.2 0.01 4.0 2 0.2 0.2 0.2 0.01 4.0 3 0.3 0.1 0.2 0.01 4.0 4 0.4 0 0.2 0.01 4.0 100mL血清中总胆固醇含量/mg A550nm/Abs 0 0.000 100 0.303 200 0.453 300 0.562 400 1.009 以吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，做标准曲线。

图一：

90

150

1.3.2 血清中胆固醇的含量测定

表2 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇——样品的测定 试剂 试管 对照 家鸡样品 0.4 0.01 0.2 0 4.0 0.174 70.1 乌骨鸡样品 0.4 0.01 0.2 0 4.0 0.178 70.4 醋酸/mL 血清/mL 邻苯二甲醛试剂/mL 无水乙醇/mL 混合酸/mL* A550nm 血清中总胆固醇含量/mg 0.4 0.01 0 0.2 4.0 0 0 于550nm波长比色，以对照管校零点，对照标准曲线即知100mL样品中总胆固醇含量（mg）。

2、血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定

2.1 血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析、透析与浓缩 2.1.1 材料与试剂 （1）家鸡血清

（2）PBS，(NH4)2SO4溶液，蔗糖，BaCl溶液 2.1.2仪器设备

离心机，烧杯，移液管，透析袋 2.1.3实验步骤

表3 血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析实验步骤 血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析实验步骤 取离心管一支，加入2mL血清 加入2mLPBS（稀释血清），摇匀 逐滴加入pH=7.2的（NH4）2SO4溶液2mL，边加边摇 静止30min，离心20min（v=3000rpm） 上清液（主要含有清蛋白） 加入3.132g(NH4)2SO4，使上清液饱和 静止30min 离心、沉淀 加1mLPBS溶解沉淀 放入透析袋

2.2凝胶层析

2.2.1 材料与试剂 Sephandex 4B 凝胶，生理盐水，重铬酸钾，蓝葡聚糖 2.2.2仪器设备

铁架台，凝胶柱，玻璃棒，烧杯，试管，胶头吸管 2.2.3实验结果

图二

沉 淀（主要含有γ-球蛋白） 加1mLPBS溶解 逐滴加入饱和（NH4）2SO4溶液0.5mL （相当于33%饱和（NH4）2SO4溶液） 放置30min 离心20min（v=3000rpm）* *放弃离心后的上清液（主要是α、β球蛋白），沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白

图 三

2.3醋酸纤维素薄膜电泳法 2.3.1材料与试剂

清蛋白、γ-球蛋白和全血清、醋酸纤维素薄膜 2.3.2仪器设备

电泳槽

2.3.3实验结果

图四

全血清 血清清蛋白 γ—球蛋白

3、谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定

3.1 谷丙转氨酶活性的鉴定 3.1.1 材料与试剂 （1）家鸡肝脏 （2）9%NaCl溶液，海砂， 1%谷氨酸溶液（1%KOH溶液中和）， %丙酮酸钠溶液（用1%KOH

溶液中和），0.1%KHCO3溶液，0.025%一溴乙酸溶液（用1%KOH中和）， 2%乙酸溶液， 酚的饱和水溶液。0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液，0.1%标准谷氨酸溶液， 0.1%标准丙氨酸溶液，1%KOH溶液。 3.1.2 仪器设备

研钵，试管，移液管，培养皿等 3.1.3方法 纸层析法 3.1.4 实验结果

图五 纸层析结果

丙氨酸 谷氨酸 鸡血血清

煮 沸煮沸过的乌鸡血清 过的乌鸡血

3.2血清谷丙转氨酶活力单位测定 3.2.1 材料与试剂

1/15 mol/LpH=7.4的磷酸缓冲液，GPT基质液，1mmol/L2，4-二硝基苯肼，2μmol/mL

丙酮酸钠标准液，0.4mol/LNaOH溶液 3.2.2 仪器设备

试管，移液管，比色皿，分光光度计 3.2.3 实验结果

图七

表5 谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定结果 试 管 对照管 乌鸡 家鸡

吸光值 0.000 0.012 0.006 查标准曲线得GTP单位 0 5.8 2.8 4、实验结果分析与总结

实验中得到，血清主要由水和各种化学成分组成,这些化学成分就包括白蛋白、α1 、α2 、β、γ- 球蛋白,总胆固醇,谷丙转氨酶。

在本次实验中，我们通过多家鸡与乌鸡血清中胆固醇、蛋白质及谷丙转氨酶活力等的测定，了解到家鸡与乌鸡虽然在种类上有所差别，但两者的血清成分差异不大，从而可以引出，自然界中大多数动物的血清成分大致一样，表明了生物的统一性。但在酶活力等个别因素上，还是存在差异，这也表现了生物界的个别差异性。通过实验，还学习了凝胶等实验技巧，提高了专业水平。

4.1 血清胆固醇的定量测定

血清胆固醇的定量测定结果表明，鸡血清中的胆固醇含量在正常水平范围内，且乌骨鸡的比家鸡的要略高。查阅资料显示，家鸡血清中的胆固醇含量普遍高于乌鸡，因此从营养价值来看，人们选食乌鸡更为健康。

4.2凝胶层析

通过凝胶层析，先跑出蓝色，后出现黄色，说明蓝葡聚糖分子量比重铬酸钾大很多，才会先流出层析柱。

4.3醋酸纤维素薄膜电泳

醋酸纤维素薄膜电泳的结果表明，全血清中除了清蛋白和γ-球蛋白外，还含有其他类型的蛋白，且各类蛋白的迁移速率不同。血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定 从实验结果来看，电泳出现拖带现象。原因分析如下： ① 血清取样时血细胞破裂，血红蛋白流出，导致离心时许多血红蛋白悬浮于离心管内，使 得离心后取样不便； ② 浓缩时不够彻底，点样所用样品过于稀薄； ③ 电泳点样时盖玻片把握不到位，点样失误率大。 另外，电泳时，滤纸桥的搭建是关键，注意正负极的连接以及放滤纸条时不要将点样端搭到滤纸桥上。透明完成后，薄膜尽量烘干，取下时薄膜才不会过于卷曲损坏，但也不宜过于干

4.4谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定

家鸡血清与乌鸡血清层析后出现两条带，这是由于谷氨酸转化为丙氨酸为可逆反应，所以为煮沸的酶液存在2条带，距离圆心较远端的为丙氨酸，较近端的为谷氨酸。但煮沸的酶液由于谷丙转氨酶失活不能将谷氨酸转化为丙氨酸，因此只呈现1条带。

结果表明谷丙转氨酶在家鸡体内的活性并不高，从病理的角度分析：谷丙转氨酶活性偏高可能原因就是病毒性肝炎，肝病等。这说明市场上销售的这只家鸡的肝是正常的，我们可以放心食用。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/mbkx.html