现代药理学研究方法

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《现代药理学研究方法》

第一章 现代药理学实验方法与技术简介

第一节 分子生物学试验方法与技术

分子生物技术在药理学实验中应用较为广泛，包括核酸分子探针的标记、核酸分子杂交、多聚酶链反应、蛋白印迹杂交技术、cDNA文库、随机分子库技术、外核基因在真核细胞中的表达、转基因动物、人类基因治疗等。现将更为常用的技术介绍如下：

一、核酸分子探针的标记 标记核酸分子探针（nucleic acid probe）是进行核杂交的基础，根据核酸分子探针的来源及性质进行选择，选择的基本原则是具有高度的特异性，探针选择直接影响杂交结果的分析。根据检测对象和目的不同，，可选择不同的探针种类及标记方法。

㈠ 探针种类

1．基因组DNA探针 是克隆化的各种基因片断，也是最常用的核酸探针，探针应尽可能选用基因编码（外显子），避免使用内含子及其它非编码序列。

2．cDNA探针 与mRNA互补的DNA链称cDNA，是一种较为理想的核酸探针，特异性较高。

3．RNA探针 RNA与RNA或DNA杂交体的探针稳定性，特异性高。

4．寡核苷酸探针 人工合成寡核苷酸片段做探针，可根据需要合成相应序列。

㈡ 标记物

常用的探针标记物有两类：放射性同位素和非放射性同位素。标记物的检测具有高度灵敏性和特异性。标记和探针结合不影响杂交的特异性和稳定性。其中放射性同位素是应用最多的探针标记物，但易造成放射性污染，多数同位素的半衰期短，不能长期存放。常用的放射性同位素有32P¸3P¸35S，有时也用14C,125I或131I。

二、核酸分子杂交（nucleic acid hybridiazation ） 是指具有一定同源序列的两条核酸单链在一定的条件下，按碱基互补配对原则形成异质双链的过程。核酸分子杂交是分子生物学领域应用最广泛的技术，灵敏度高、特异性强，主要用于特异DNA或RNA的定性定量检测。

三、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外酶促扩增特异DNA片段的方法。传统的DNA扩增法是分子克隆法，需经过DNA酶切、链接、转化等步骤构建含有目的基因的载体。然后导入细胞中进行扩增，再用同位素标记的探针进行筛选，操作复杂，耗时。PCR技术灵敏度高，特异性强，操作简便。PCR是本世纪分子生物学研究领域中最重要的发明之一。

四、cDNA文库 是指以mRNA为模板，在反转录酶的作用下形成的互补 DNA（complementary DNA,cDNA）。cDNA文库是指一群含重组DNA细菌或嗜菌体克隆。每一个克隆只含一种mRNA的信息，足够数目克隆的总和则含细胞的全部mRNA信息，此种克隆群体叫cDNA文库。

五．随机分子库技术（random moleculer library） 采用不同技术手段和在不同的分子水平有效地实现分子的多样性。其技术路线，一是利用化学合成的方法生成已知结构的化合物，以某种特定方式和一定规律组合在一起，只要确定某一化合物具有活性，即可根据建库的组合方式确定其结构，围绕此技术发展的随机分子库总称为化学合成库（synthetic chemical library）。二是利用基因工程方法直接合成的DNA或RNA的核酸库（nucleic acid library ）,由DNA随即编码表达的小分子和大分子的混合群体而表达物的表面显露又提供了可从庞大的复杂的群体中快速筛选到目的物，这就是近几年发展起来的极富有应用潜力的

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核酸编码分子肽库（oligonucleotide-encoded peptide library ）。

六．真核基因的表达调控技术 真核细胞具有比原核细胞更为庞大的和复杂的基因组。高等真核细胞基因组编码成千上万个基因，基因内遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程，即基因表达过程受不同层次调节机制精密调控，此调控既决定着基因表达的量，又决定基因表达的时空顺序。调控过程精密复杂，涉及到转录前染色质的活化；转录水平的调节；转录后的加工；翻译水平的调节及翻译后的修饰等。基因表达的调控主要发生在转录水平。

七．转基因动物 是用实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。此种方法可建立转基因动物模型，以研究外源基因在整体动物中的表达调控率；能改变动物基因使其表现更符合人类需要；也可用转基因动物产生人类所需要的生物活性物质。

第二节 细胞生物学实验方法与技术

细胞生物学是生命科学中的重要分支，它以生命基本单位细胞为研究对象，应用近代物理、化学和实验生物学方法，从显微、亚显微和分子水平来揭示细胞生命活动及规律，其中包括细胞的生长、发育、分裂、分化、遗传、变异（包括癌变）、兴奋、运动、代谢、衰老与死亡等基本生命现象，并且利用与调控细胞的行为活动，已达到为生产实践尤其为医药卫生事业服务。当前细胞生物学与医药保健事业联系的较为紧密的热点问题主要有以下几种：1）真核细胞基因结构及其表达调控；2）细胞膜、膜系、受体与信号传递研究；3）细胞生长、分化、衰老、癌变、死亡，尤其是程序性细胞死亡的研究；4) 细胞工程，包括基因工程及体细胞核移植的研究。

一、细胞培养常用方法

1、细胞原代培养（primay culture） 又称初代培养，即直接从机体取下细胞、组织、或器官、让他们在体外维持与生长。原代细胞的特点是细胞或组织刚离开机体，他们的生物状态尚未发生很大的改变，一定程度上可反映他们在体内的状态，表现出来源组织或细胞的特性，因此用于药物实验尤其是药物对细胞活动、结构、代谢、有无毒性或杀伤作用等研究是极好工具。常用的原代培养方法有组织快培养法及消化培养法。前者方法简单，细胞也较易生长，尤其是培养心肌有时能观察到心肌组织块的搏动。细胞从组织块外长并铺满培养皿或培养瓶后即可进行传代。

2、细胞的传代培养 当细胞生长至单层汇合时，便需要进行分离培养否则会因无繁殖空间、营养耗竭而影响生长，甚至整片细胞脱离基质悬浮起来直至死亡。为此当细胞达到一定密度时必须传代或再次培养，目的是借此繁殖更多的细胞，另一方面是防止细胞的退化死亡。

二、器官培养方法

器官培养（organ culture）是指用特殊的装置使器官、器官原基或它们的一部分在体外存活，幷保持其原有的结构和功能。器官培养可模拟体内的三维结构，用于观察组织间的相互反应、组织与细胞的分化以及外界因子包括药物对组织细胞的作用。

器官培养方法很多，最经典的方法即表玻皿器官培养法；一种最常用的方法是不锈钢金属网格法及Wolff培养法和扩散盒培养法，实验者可根据情况选择采用。

三、放射自显影术测定

放射自显影术（autoradiography）是利用放射性同位素电离辐射对核子乳胶的感光作用，显示标本或样品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在紧密接触的感光乳胶中记录下它存在的部位和强度，准确显示出形态与功能的定位关系。现已可将放射自显影术与电镜以及生物分子结合起来。不但可以研究放射性物质在组织和细胞内的分布代谢，而且可以揭示核酸合成及其损伤等改变，目前已在生命科学各领域被广泛应用。

四、染色体分析技术

染色质或染色体是遗传物质在细胞水平的形态特征。前者是指当细胞处于合成期时遗传物质经碱性染

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料着色后，呈现出细丝状弥漫结构；当细胞进入分裂期时，染色质细丝高度螺旋化凝聚为形态有特征的染色体。特别是在分裂中期，复制后的染色体达到最高程度的凝聚，称为中期染色，是进行染色体形态观察分析的最佳时期。染色体分析应用领域越来越广，主要用于以下几方面：1）为临床诊断提供新手段；2）研究不育和习惯性流产发生的遗传基础；3) 通过检查胎儿的染色体，预防有染色体异常患儿出生（先天愚型）；4）根据染色体的多肽性进行亲子和异型配子的起源研究；结合DNA重组技术可以将基因定位于染色体的具体区带上。

五、电镜技术

早在1940年，英国剑桥大学首先试制成功扫描电子显微镜，但因分辨率低无实用价值。1965年英国剑桥科学仪器有限公司开始生产出商品扫描电镜，其以显著优点广泛用于生物学、医学、物理学、化学、电子学及勘探、冶金、国防、公安、机械与轻工业等诸多领域，并已成为非常有用的研究工具。

电镜主要特点：1）景深大，较光学显微镜大几百倍；2）图像富有立体感，是一个具有真实感的三维结构立体图象；3）图像放大范围大，光学显微镜有效放大倍数为1000倍左右，透视电镜的放大倍数为几百倍至100万倍，扫描电镜可放大十几倍至几十万倍；4）分辨率高，扫描电镜可达6－3nm；5）样品可在三度空间平移和旋转，聚焦后可以任意放大倍数，而不需调整重新聚焦。

六、细胞、细胞器、及细胞间质的分离技术、

1、 细胞的分离 分离不同的细胞及亚细胞组分在现代生物学研究中起着重要的作用。如研究某种药物治疗白血病的机理，需要分离培养人或动物的骨髓细胞，观察药物的细胞作用；研究与细胞生长分化有关的生长因子的作用，需将与此类因子有关的细胞分离出来；分离细胞膜，线粒体等细胞的亚组分，对于研究信号传递，某些遗传疾病，也都是必不可少的手段。

2、细胞膜的分离 细胞内的膜系统与细胞质膜统称为生物膜（biomembrane）,他们都有共同结构和特征。首先要分离出形状完整的、具有生物活性的、高纯度的细胞膜，用于研究细胞膜的结构和功能，以利于观察膜在细胞与环境进行能量交换及信息传递的过程。

3、细胞核的分离 细胞核作为一个功能单位，完整的保存遗传物质，幷指导RNA合成，后者为蛋白质及其它细胞组分合成所必需。因此细胞核分离是研究基因表达及细胞核形态结构的首要步骤。不同组织来源的细胞经匀浆后，用分级离心或超声波处理等方法进行纯化。

4、溶酶体的分离 溶酶体是处理细胞吞噬物的细胞器，含有高浓度的各种水解酶类，调控细胞内的消化过程。溶酶体的分离常用于研究因溶酶体功能缺陷而引起的多种疾病。

5、线粒体的分离 线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需要的能量，主要由在线粒体内进行氧化所产生的能量供给。制备线粒体关键是保持其完整性及高纯度。

6、细胞DNA、RNA分离与纯化 核酸是遗传信息及基因表达的物质基础。核酸的提取与纯化关键是保持核酸的完整性，但较困难，主要因为：一是细胞内有活性很高的核糖核酸酶；二是酸碱等化学因素；三是高温机械损伤等物理因素，需严格遵守操作规程。

七、细胞凋亡研究方法

细胞凋亡(apoptosis),又称为程序性死亡（programmed cell death,PCD）指的是有核细胞在一定条件下，通过激活其自身内部机制，尤其是开启与关闭某些基因以及内源性DNA内切酶活化，导致产生细胞自然性死亡的过程。可以认为细胞死亡的这种方式是一种生理性的自发过程。为此有人也称其为细胞自杀。

目前认为程序性死亡几乎和细胞的增殖同样重要，如果没有细胞凋亡，个体不能形成与存活，或者发生疾病。只有通过细胞凋亡的发生，使特定细胞群体在特定的时间和特定的部位死亡。从而使机体在总体上保障其细胞数量，以及形态与功能的平衡。近年来如何用药物诱导癌细胞死亡也成为细胞凋亡的热点之

一。透视电镜观察是研究细胞凋亡的首选方法。

八、原位杂交

原位杂交技术是将分子杂交与组织化学相结合，用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特异互补的DNA或RNA序列。它分为三类：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA。已广泛用于生物学的各个领域。原位DNA末端标记可以用于细胞凋亡的定量研究。原位杂交技术和PCR技术结合用于检测人乳头瘤病毒（HPV）

九、单克隆抗体

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是1975年被描述的一种可产生无限量，并可预测其性质的抗体制备技术。该技术的关键步骤在于淋巴细胞之间的融合，所以称为“淋巴细胞杂交瘤技术”；由于杂交瘤经过筛选可产生针对单一抗原决定簇抗体的细胞克隆，故称为单克隆抗体技术。该技术的问世使得免疫学研究与实践发生了革命性的改观，同时还为生物学和医药学的许多领域提供了前所未有的研究工具。人们利用其可精确地识别出极为复杂的分子，测定出无法测定的物质，识别出新的细胞群体，揭示了以往未曾了解的细胞分化途径，为肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病等的诊断和治疗创造出令人兴奋的前景。

十、神经细胞培养 神经细胞培养是指从体内取出某一种神经组织，在无菌、适当温度和一定营养条件下模拟在体生理环境，使之存活和生长，幷保持其结构和功能。

神经细胞培养按培养前切割程度分为器官培养、组织快培养和细胞分离培养。

1、器官培养 （organ culture ） 是切割最少型的培养。全器官或器官大片放在保温的营养液中可保存数日。这类培养切断了正常的血供，器官的营养交换取决于简单的灌流。

2、组织块培养 （explant culture） 是真正最小器官培养。组织块通常厚度为0.5－1mm，一个或几个组织块放在一个培养皿内存活数周。实验在其组织块周围生长出的边缘细胞上进行。

3、细胞分离培养 （dissciated cell culture ）是由分散其原始组织至其组成的细胞。常用酶进行消化。

第三节 信息传递的研究方法与技术

一、受体与配基结合试验技术

受体与配基结合试验是一种在体外直接观察受体的实验手段。随着各种高比活度的特异性受体配基的合成，此方法已成为药理学的基本技术之一，幷广泛用于生理、生化、细胞生物等许多相关学科。

二、G蛋白的纯化分离技术

G蛋白是细胞膜上一类结构和功能都非常相似的蛋白质。其主要功能是偶联受体及其效应器。受体与激动剂结合并被激活时，先激活其相应的G蛋白，然后G蛋白再与相应的效应器（酶离子通道等）发生反应，改变效应器的活性。与G蛋白偶联的受体种类繁多，受G蛋白调控的效应器包括腺苷酸环化酶，磷脂酶C，cGMP磷酸二酯酶，离子通道等。因此，G蛋白的研究对阐明跨膜信息传递机理有非常重要的意义。

三、环核苷酸测定技术

环核苷酸是重要的细胞内信使物质，参与调控各种激素、神经递质和调质所导致的各种细胞生命活动。常用的测定方法有：cAMP蛋白质竞争结合法；cGMP放射免疫测定技术；腺苷酸环化酶测定技术等。

四、花生四烯酸代谢产物测定技术

细胞内磷脂、甘油三酯及胆固醇经酰基水解酶的作用释放出花生四烯酸（arachidonic acid ,AA）。而AA通过环加氧酶和脂加氧酶途径分别代谢转化为一系列活性物质，如前列腺素、前列环素、血栓素、白三烯等。这些物质在体内含量少，但有极强的生物活性。能调节多种系统（神经、内分泌、消化、呼吸、生殖、血液、心血管、肾等）,并在炎症、免疫、过敏、凝血、肿瘤和心血管等一系列的病理过程中发挥作用而具有重要的临床意义。常用的检测方法：生物测定法、高效液相测定法、放射免疫分析法、酶免疫测定法、放免配基受体结合法。

五、肌醇磷脂及其代谢产物的测定技术

肌醇磷脂是细胞膜中的一种脂质，能被磷脂酶C水解生成三种重要的细胞内信使物质，都已成为药理学和生物化学等学科中研究的热点。常用实验方法有：肌醇磷脂的测定、磷酸肌醇的分离及测定、甘油二酯的测定、同位素标记测定肌醇磷脂等。

六、蛋白激酶C的纯化和测定

蛋白激酶C是一种普遍存在于生物体内的磷脂依赖的激酶家族。在细胞的信息传递和生长调节中起到重要作用。蛋白激酶C参与多种激素、神经递质及生长因子调控过程。测定蛋白激酶C活性及纯化该酶成

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为跨膜信息传递研究的重要技术。

七、离体器官受体生物测定

使用某些离体器官进行受体激动剂、拮抗剂的生物检定，是一项目前仍在广泛应用的经典的药理学方法。可以测定药物对受体的亲和力，对特定亚型的选择，能决定药物是激动剂还是拮抗剂，并能分析药物与受体的构效关系，反映的是药物在器官水平上的作用，因此，与细胞或分子水平上的实验结果可以互相印证，有其不可替代的意义。

第四节 钙研究方法与技术简介

钙是人体内极其重要的金属离子，广泛存在于细胞和体液中。它在细胞活动乃至生命过程和疾病的发生、发展中扮演重要角色，已成为化学、生物学、基础和临床医学及其它许多科学研究的一个重要领域。

一、细胞内游离钙研究方法与技术

（一）钙指示剂

钙指示剂是近十多年来发展起来的一类离子指示剂，也称离子探针或染料，已成为观察细胞内游离离子浓度及其动态变化和空间分布极有价值的工具。目前常用钙指示剂根据其物理特性一般可分为两类

1、钙荧光指示剂：是指在一定波长的激发光照射下，钙指示剂复合物可发出荧光。属于此类的指示剂有Fura-2 、Quin-2、Fiuo-3、 Indo-1等。

2、光吸收指示剂：是指它们与钙离子结合后，其吸收光谱峰值随Ca2+——指示剂复合物浓度的不同而变化，据此便可观察细胞内游离钙的动态变化并测定细胞内钙浓度。属于此类指示剂的有Purpurate diacetic acid (PDAA)、AntipyrylazoⅢ等。光吸收指示剂一般属于低钙亲和力指示剂。

（二）双波长荧光分光光度计测定方法

应用双波长荧光分光光度法不仅可以检测细胞悬液，单层培养细胞及单个细胞内游离钙浓度的变化，也可以测定细胞内瞬间平均钙浓度的变化及亚细胞水平钙离子的梯度分布等。各种细胞测定方法差异在于标本的制备过程，其余步骤基本相同。基本方法为制备标本的细胞悬液，加入荧光指示剂，用双光束荧光分光光度计测定荧光。测定条件：激发光光栅5nm，发射光光栅10nm，以300-420nm扫描激发光谱，然后固定激发波长在高峰波长，观察不同实验条件下荧光强度的变化，由公式计算游离钙浓度。

二、钙结合蛋白的研究方法

钙结合蛋白的研究方法包括钙调素的纯化及测定、钙调素的表达与突变的研究方法、钙调素结合蛋白检测方法及钙依赖性磷脂结合蛋白的研究方法。

三、细胞内钙释放研究方法

1、放射性标记法测定钙释放：

将分离的内质网或线粒体囊胞用放射性标记的钙离子负载，负载后的囊胞置于一滤器上，通过过滤与负载液分离。在滤器中加入各种促钙释放介质后，定时测定滤器中残留的放射活性即可推断内钙释放情况。

2、三磷酸肌醇刺激内钙释放的研究方法

制备细胞或细胞器悬液，加入钙离子荧光指示剂负载，再加入一定浓度的三磷酸肌醇（IP3）刺激内钙释放，观察荧光强度的变化即可反应钙释放情况。

四、钙离子受体测定方法

从牛或人甲状旁腺细胞的cDNA文库中筛选出编码钙离子受体的cDNA，将其mRNA注入爪蟾卵细胞，使其表达，在细胞膜上形成具有天然活性的钙离子受体。当细胞培养液中存在一定浓度的钙或其它阳离子时，激活钙受体，使胞内钙离子浓度增加，打开氯离子通道，测定氯离子通道电流的变化，便可用于筛选钙离子受体激动剂或拮抗剂。

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第五节 放射配体受体结合实验方法与技术

一、基本概念

1、受体（ receptor） 一类介导细胞信号转导的功能蛋白质，可与周围环境中微量化学物质发生特异性结合，通过信息放大系统，触发后续的生理或药理效应。

2、配体（ligand） 能与受体特异结合的物质，如神经递质、药物或激素等。

3、判断受体的标准 真正的受体必须具备：饱和性、特异性、可逆性、高亲和性、结构专一性、立体选择性、区域分布性、亚细胞或分子特征、有内源性配体等。

4、受体的基本分类 化学门控离子通道受体； G蛋白耦联受体。

5、受体调节的方式

1）共价调节（covalent modification） 尤其是蛋白磷酸化反应在受体的脱敏过程中起了非常重要的调节作用。以乙酰胆碱受体为例，细胞内cAMP升高所引起的蛋白磷酸化可使乙酰胆碱受体对乙酰胆碱的脱敏速度增加8～10倍。

2）非共价调节（non-covalent modification）影响受体功能的非共价调节机制包括①膜电位的变化；②机械性改变受体的分布（斑片钳技术）；③受体和其他膜蛋白（如G蛋白）或某些小配体（阴离子，阳离子，核苷酸）之间的变构影响；④膜脂质环境的改变等。

3）协同性调节（coordinate regulation）已知不同受体可含有同源受体区如胰岛素受体和上皮生长因子-抗溃疡素受体中的酪氨酸激酶区。由此可推测一种受体被激活后可能通过一共同密码（code）来调节同一细胞上的其他许多受体。

4）链锁反应（receptor cascades） 另外一种可能的调控机制，即一个受体被激活之后，可能会释放一种细胞外信使，激活第二个细胞表面受体。称之为放大性的链锁反应。

二、放射配体结合法的应用领域

1、阐明药物作用机制；2、新药设计和药物筛选；3、探讨疾病的病因、发病机理，提高临床合理用药和诊断水平；4、测定组织或血液中药物浓度；5、探寻新的受体、受体亚型和内源性配体。

三、放射受体结合实验技术简介

1、放射配体的选择 需要非常高的选择性，并要求与靶受体有很高的亲和性，解离常数最好小于10nmol/L，还要考虑配体的生物学以及生物化学特征。拮抗剂性配体必须能阻断激动剂与靶受体结合引起的生物学效应。放射性受体结合试验中，最常用的放射性同位素是氚，[3H]配体的主要优点是氚化过程不影响配体的生物活性，使用较安全，其信号必须用闪烁技术加以放大。放射配体的另一个重要特性是特异性结合与非特异性结合的比率，理想的配体应有不少于99%的特异性结合。

2、组织的选择和制备 用于放射受体结合试验的理想的组织应含有高密度的靶受体和低密度的与配体非特异结合的受体。用于放射受体结合试验的组织可取自脑、外周组织、天然表达或移植受体的细胞株等。

3、缓冲液 最常用的缓冲液是50mmol/L，PH为7.4的Tris-Cl的缓冲液；重碳酸盐、磷酸盐和HEPES缓冲液亦可用于结合试验。

4、非特异性结合的测定 非特异性结合的测定原理是加入大量的对靶受体具有药理活性的并可使受体饱和的非放射性配体。特异性结合量是指配体与靶受体结合量，可由总结合量中减去非特异性结合量求出。

5、孵育条件 结合实验应该用能产生最大特异结合和适宜的孵育条件。需要经过大量的实验才可摸索出最佳的测定条件。

6、放射配体-受体复合体与游离放射配体的分离

最常用的最有效的分离方法是过滤，结合试验中最常用的滤纸是玻璃纤维滤纸。通常用2～5ml冷缓冲液冲洗2～3次就足够了。过滤完成后，滤纸置于盛有闪烁液的闪烁瓶中进行液闪测定。当放射配体解离较快时，可用离心的方法将放射配体-受体复合物从游离配体中分离出来。其它方法还有：凝胶过滤色谱法、凝胶过滤透析术、免疫沉淀法等。

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第六节 免疫药理学实验方法与技术简介

免疫药理学是介于免疫学和药理学间的边缘学科，主要研究药物对机体免疫系统和免疫功能的作用及其机制，为某些疾病药物治疗提供理论基础。

免疫药理学方法一般是采用体外的试管内研究和体内的整体研究相结合，体外试验研究可澄清药物对免疫应答某一特定环节如T细胞增殖、细胞因子等产生的具体影响，而整体研究则可探讨药物对抗原介导的的免疫应答、正常的体液免疫及细胞免疫功能、同种异体移植排斥反应、异常免疫应答如超敏反应和自身免疫病以及初次及再次免疫应答等的影响。在未来免疫药理学的研究领域中，基因工程、基因治疗、细胞因子治疗以及其它各种生物治疗的研究和应用将是研究的热点和前沿区域。

一、免疫细胞的分离与纯化

体内外的免疫药理学实验研究都需要从动物或人的血液或淋巴组织中分离免疫细胞，获得高纯度的免疫细胞是进行本研究的最基本的前提条件。

外周血中白细胞的分离常用自然沉降法和高分子聚合物沉降法；外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells，PMNC）分离多采用密度梯度离心法。

从淋巴组织中分离淋巴细胞悬液---制备脾细胞悬液、淋巴结细胞悬液、胸腺细胞悬液。

淋巴细胞的分离纯化包括：①分离PMNC中的淋巴细胞和巨噬细胞 常用方法有玻璃粘附法、磁铁吸引法、羰基铁乳胶分层液法、补体溶解法及葡聚糖凝胶过滤法等。②T细胞、B细胞及T细胞亚群的分离纯化 常用技术：E花结分离法、Percoll非连续性密度梯度离心分离法、洗淘法（panning）、补体细胞毒法、尼龙毛分离法、磁性激活细胞分离器（magnetic activated cell sorter，MACS）分离技术及流式细胞术（flow cytometry，FCM）。

二、药物对免疫系统功能影响的实验技术简介

1、对免疫细胞表面抗原分子的影响 对细胞表面的CD（cluster of differentiation，分化簇）抗原的检测与分析可通过细胞毒法、葡萄菌体蛋白A法、免疫细胞化学法和免疫荧光染色分析法等，借助流式细胞仪进行的免疫荧光染色分析法使该项技术的标准化、定量化和自动化水平大大提高，体内外药理试验均可采用之。

2、对免疫细胞功能的影响 常用：3H-TdR掺入试验、固相抗CD3单克隆抗体诱导细胞增殖的检测、混合淋巴细胞反应、抗原刺激的T细胞增殖反应、预激淋巴细胞对抗原的增殖反应等。

3、淋巴细胞功能的体内实验 小鼠接触性超敏反应、移植物抗宿主反应（graft-versus-host disease，GVHD）、迟发性超敏反应（delayed-type hypersensitivity，DTH）、体内检测TH细胞活性。

4、对B细胞影响的体内外实验 血清中IgG、IgA、IgM的测定（单向免疫扩散法、散射比浊法）；抗体生成细胞检测（溶血空斑试验、溶血分光光度法）。

5、对单核巨噬细胞功能的影响实验 巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、白色念珠菌3H葡萄糖掺入实验、单核巨噬细胞对肿瘤细胞的细胞毒反应测定、单核因子测定等。

6、对超敏反应影响的体内外实验 总IgE水平测定：酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫单扩散法（radioactive single radial diffusion，RSRD）、免疫斑点法（dot immunobinding assay，DIBA）、反向被动血凝法（reversed passive hemagllutination assay，RPHA）、纸片放射免疫吸附试验（paper radio immunosorbent test，PRIST）。特异性IgE抗体测定：ELISA、放射过敏原吸附试验（radioallergosorbent test，RAST）、P-K试验、被动皮肤过敏反应（passive cutaneous anaphylaxis，PCA）、皮内试验（intradermal test）。人外周血单个核细胞体外合成IgE的测定：微量固相放射免疫测定法（microtiter solid-phase radioimmunoassay，MSPRIA）和ELISA法。参与I型超敏反应介质的测定：相应介质试剂盒测定，如LTs试剂盒。动物模型：如过敏性哮喘模型等。

三、影响免疫功能的药物药效学研究原则

根据药物对免疫功能的影响进行分类，可分为免疫增强剂、免疫调节剂和免疫抑制剂。

1、免疫增强剂和免疫调节剂的免疫药理学研究

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免疫增强剂和免疫调节剂可分为两大类：生物类和化学合成化合物类。生物制品类包括菌苗、细菌的某些成分如脂多糖、真菌产物、免疫细胞的产物如细胞因子和免疫球蛋白、免疫细菌如LAK细胞、自然化合物及中草药及其单体成分等。化学合成化合物类包括含硫化合物、多聚核苷酸等。这些药物的药理作用因用药方案不同，如给药途径、用药剂量和用药时间等，会导致不同的药效；另外，药物本身的纯度和药物受试对象的种系、年龄、疾病类型与程度及遗传背景亦会对药效产生一定的影响，因此，在进行实验设计时要全面考虑这些因素。

临床上免疫增强剂和免疫调节剂主要用于原发性和继发性免疫缺陷病、自身免疫病、肿瘤及慢性微生物感染的治疗，故选择实验动物模型时，应考虑采用免疫缺陷模型动物、荷瘤动物、自身免疫病模型及相应病原体感染动物模型。

2、免疫抑制剂的免疫药理学研究

免疫抑制剂的筛选程序一般是先进行体外实验，然后进行体内实验。动物的体内实验多采用实验性过敏性脑脊髓炎和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎的病理模型和新西兰NZB小鼠。在动物实验时，应考虑动物的品系、对免疫应答所影响的环节、治疗指数、给药途径、最佳治疗方案等。在免疫药理学研究之后，还应进行基础药理学研究、药物的急性和慢性毒性研究、药物的动力学研究等。

第七节 肿瘤药理实验方法与技术

肿瘤药理实验方法无外乎体内和体外实验两种。从实验目的上看，又可以分成抗癌作用和抗癌作用机制研究两种。

一、抗癌作用研究

（一）体外实验法：用培养的肿瘤细胞系进行。

1、噻唑蓝（MTT）法 在培养的活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶可将黄色的四氮唑（MTT）催化成不溶性的蓝紫色的甲替，将甲替用二甲基亚砜（DMSO）溶解后，利用酶标仪（试验波长570nm，参比波长450nm）测定光密度值，按照公式

实验组光密度值

肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1 - ）×100%

对照组光密度值

计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。用系列浓度的药物可制作肿瘤细胞生长抑制率的量效曲线。

2、染料排斥法 本方法是根据活细胞具有排斥某些染料的功能，而死细胞因胞膜破坏而易于被染料着色的原理，在培养的对数生长期的细胞悬液中加入伊红、台盼蓝、或苯胺黑等染料，在室温下放置5分钟后，在15分钟用血球计数板计数200个细胞。根据公式

未染细胞数

活细胞率（%）= ×100%

细胞总数

3、生长曲线法 本方法是根据肿瘤的Gompertzian生长曲线而设计。培养的肿瘤细胞在初期为指数增殖期，随着细胞密度的增加，因代谢产物的积聚和营养物质的消耗，增殖趋于减缓乃至停止，进入所谓的平台期。在培养后的的即刻、1、2、3、4、5、7天的细胞，用台盼蓝染色，细胞计数，然后取细胞对数对培养时间作图可获细胞生长曲线。1）将生长曲线外延至Y轴可获得截距No`，用公式

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对增殖细胞的杀伤力=No-No`×100%No

计算药物对增殖细胞的杀伤力（No`是对照组的的截距）

2）用Nt代表接种后t小时的细胞数， 用公式

TD = 0.301t / logNt - LogNo

计算药物对细胞增增时间（TD）的影响。

3）取平台期每毫升的细胞均数，比较细胞生长的饱合密度（Ns）。

4、集落形成法 本方法利用分裂≥6代以上的克隆原单细胞子细胞可形成集落成簇（每簇细胞数＞50）的能力，比较药物对单个肿瘤细胞增殖能力的影响。本方法有贴壁法和半固体培养法两种。

1）贴壁法 需要选用贴壁生长的细胞， 按500细胞/ml的浓度接种到35mm培养皿中，培养后弃去培养基，用瑞氏-姬姆萨染色后，在20×解剖显微镜下计数含有50个细胞的细胞集落。

2）半固体软琼脂培养法 取对数生长的细胞，用含小牛血清的培养液稀释成1000细胞/ml的悬液；溶化5%的琼脂液，并按1：9的比例与含小牛血清的新鲜培养液混合，倒入35mm培养皿（1ml/皿），室温下待琼脂凝固，取0.94ml的细胞悬液，加0.04ml的5%琼脂, 加到已制备的琼脂平皿中，室温下凝固。移入培养箱培养。在16×解剖显微镜下计数直径大于75μm的细胞集落。以集落形成抑制百分率对对数剂量作图，可得“S”型曲线，从曲线上求取半数抑制浓度IC50；以集落的存活分数与剂量作图，可获得克隆原细胞存活曲线，方程为S=1-(1-e-D/Do)n，S为存活分数， D 为剂量， Do为存活分数每下降1/ e时所需的药物剂量， n为外推值。Do越小， 药物的杀伤力越大，N越大杀死细胞的药物剂量越大。

5、硫化若丹明B法（SRB）法 硫化若丹明（sulforhamine B）呈粉红色，溶于水，可与生物大分子的碱性氨基酸结合，这种结合物在波长515nm时的读数与细胞表现出良好的线性关系，可用于细胞的定量。测试的细胞先用TCA固定，去除固定液，加入SRB， 室温下静置， 然后去除未结合的SRB， 用非缓冲tris碱液溶解结合的SRB，在自动化分光光度平板读数仪（515nm波长）测定OD值。可根据下述公式计算:

T - T0

生长率（%）= ×100%

C - T0

C、T和To分别为对照组细胞，为给药组细胞，另外的对照平板加药时的细胞的OD值。

T - T0

杀伤率(%) = ×100%

T

T - T0

50%生长抑制所需的药物浓度(GI50) = ×100%

C - T0

T - T0

杀死50%细胞所需的药物浓度(LC50)= ×100%

T0

(二) 在体试验法

1、小鼠白血病L1210 系用甲基胆蒽诱发DBA/2小鼠而得。取接种于DBA/2小鼠第6～7天之腹水，

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制成细胞悬液，每只小鼠（DBF1或CDF1）腹腔接种活细胞1×105，观察体重变化，计算平均存活时间T/C（T--治疗组存活时间，C--对照组存活时间）。T/C大于125%，并可重复，认为有抗癌活性，T/C大于150%，并可重复，认为具有显著活性。

2、大鼠Walker-256瘤 本瘤细胞接种在皮下或肌肉成为实体瘤，接种于腹腔则成为腹水瘤。取Walker-256瘤体制成瘤细胞悬液，按106个细胞接种于大鼠大腿肌肉。计算瘤重和T/C。重复实验T/C≤42%，认为有活性。

3、Lewis 肺癌 是一个在C57BL/6小鼠上发现的自发性肺内未分化的上皮样癌。该癌细胞恶性程度高，皮下、肌肉接种对药物的敏感性低，但可向肺转移，静脉接种可在肺形成瘤集落。方法是取接种于C57BL/6小鼠肌肉或腋窝皮下的13～15天的Lewis肺癌，制成细胞悬液接种2×106个细胞于BDF1小鼠皮下或腹腔内，12天后处死动物，作皮下接种者直接摘取肿瘤称重，作腹腔接种者，将双侧后肢从髋关节处剪下，荷瘤肢重减去正常肢重即为瘤重。重复实验T/C≤42%为有活性。

二、抗癌作用机制研究

（一）药物作用周期特异性研究

进行药物作用细胞周期性实验必须首先制备同步化的细胞，常用的体外培养细胞同步化的方法有机械振荡法、双胸苷同步法、含羞草氨酸俘获法和离心洗脱法。

1、机械振荡法 机械振荡法分离同步化细胞是基于单层贴壁生长的细胞在进入有丝分裂期时, 胞形变圆，松散地附在支持物上，利用摇晃或拍击培养瓶可以剥离出这些细胞，利用此方法可以得到较纯的M 期细胞。双胸苷同步法的原理是先以高浓度的TdR处理细胞，使细胞内的dTTP升高，后者抑制CDP 向dCDP的转变，DNA复制受阻，S期细胞停滞在S 期，其它期细胞积聚在G1/S边界；撤TdR，让原处于S期的细胞完全越过S期，再给予TdR，让越过S期的细胞进入G1/S边界，然后撤去TdR，让细胞重新生长，同时进入S期。因此，本方法可以得到较纯的S期细胞。

2、含羞草氨酸俘获法 含羞草氨酸可将细胞集结于G1/S边界，阻止细胞进入S期。在撤除含羞草氨酸后，细胞可同步进入S 期。

3、离心洗脱法 离心洗脱法的原理是进入细胞周期的的体积呈线性增加。G1期细胞体积最小，离出口最近而被最先洗出。G2/M细胞体积最大离进气口最近而被后洗出。

在上述同步化处理尚需配合以同步化程度的检测，检查的方法有两种：流式细胞光度技术和放射性同位素技术。前者通过测定细胞的荧光强度来定量细胞的DNA量； 后者则利用测定掺入到DNA中的3H-胸苷（3H-TdR）或溴脱氧尿苷（BrdU）的量来获知处于S 期的细胞量。

（二）药物抗微管作用 利用微管蛋白在37℃聚合，在冰浴上解聚的特点，测定微管蛋白或微管液的OD值，分别获得S型的聚合曲线和倒S型的解聚曲线， 比较药物对曲线的影响， 用下式计算抑制率。

实验组光密度值

抑制率（%）=（1 - ）×100%

对照组光密度值

（三）药物与DNA结合能力检查

吸收光谱移动法 原理是DNA与药物形成复合物后吸收光谱发生改变，吸收峰产生位移，位移波长随DNA/ 药物复合物的量增加而增加。利用紫外分光光度计进行紫外吸收光谱扫描，可观察到这些改变。

荧光光谱移动法 原理是在激发光的激发下，DNA-药物复合物的荧光发射光谱发生改变，谱峰向短波方向移动，荧光强度增强，同时激发光谱说发生改变。用荧光分光光度计测定激发光谱和发射光谱可观察到这些变化。

（四）药物造成的DNA损伤

彗星（Comet）微凝胶单细胞电泳法 正常的DNA为负超螺旋结构， 在pH<9.0时以双链形式存在, 在pH>12.0时则完全解链。DNA受损后链断裂, 成为一个松散的结构, 在电场的作用下,松散的DNA离开细胞核向正极移动, 形成彗星似的拖尾,变换不同pH缓冲液可检测断裂的是双链还是单链。

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碱洗脱法 收集细胞于滤膜上，用细胞溶解液裂解细胞并洗去RNA和蛋白质，暴露DNA，用洗脱液进行洗脱，若DNA发生链断裂，则易于经滤膜洗出。

（五）药物对DNA拓扑异构酶的影响

DNA拓扑异构酶是调节DNA空间结构的动态变化的关键性核酶，分成拓扑异构酶I和II，抑制拓扑异构酶I可以造成DNA的单链断裂，抑制拓扑异构酶II，可造成双链断裂，进而干扰DNA的复制、重组和基因表达。实验的原理是用从肿瘤细胞核提取的拓扑异构酶II处理PBR322DNA，后者是一种质粒DNA，主要存在有超螺旋、缺口状和线性DNA三种形式，琼脂糖电泳上显示出三条带，在拓扑异构酶的作用下超螺旋DNA解旋、断裂，电泳时超螺旋带减弱或消失，相应的缺口环状或线性DNA增加。如果药物对拓扑异构酶具有抑制作用，则可见超螺旋带保留。此方法亦可改进为观察药物对拓扑异构酶功能的促进和抑制作用。方法是选定不能使一定量DNA完全断裂量的拓扑异构酶处理PBR322DNA后电泳可见超螺旋带，同时加入不同浓度的药物，如果药物抑制拓扑异构酶，则超螺旋带增强，若药物增强拓扑异构酶活性，则见螺旋带减弱或消失。

（六）药物对细胞核酸代谢的影响 DNA和RNA合成均需要特殊氨基酸，用同位素标记前体物如3H-TdR，3H-UR可分别掺入到细胞DNA 和RNA中去， 用液闪法测定其同位素活性则可知细胞DNA和RNA 的合成情况。

（七）药物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用

细胞凋亡是一种受基因调控的细胞程序性死亡过程，细胞凋亡时表现为细胞体缩小，染色质浓缩成大小不等的块状，并裂解为小片段。DNA断裂长度为核小体核苷酸长度(180～200碱基对)的整倍数，提取后普通的琼脂糖电泳表现为特殊的云梯状，凋亡小体形成。检查细胞凋亡的方法有：

1、荧光显微镜的形态学检查 该方法是利用凋亡细胞染色质浓缩，DNA广泛裂解的特征和荧光化合物可嵌入DNA分子或以静电相互作用与DNA分子结合的原理，建立DNA的荧光探针。常用的方法是用Hoechst33342和PI联合染色，然后在荧光显微下用紫外光激发。凋亡的细胞对Hoechst33342具有高摄取比，加之染色质的高度浓缩，呈强蓝色荧光；正常细胞呈微弱荧光，坏死细胞则呈红色荧光（被PI染色）。

2、流式细胞光度术 该方法的原理是用DNA结合性的荧光染料标记DNA， 因为细胞发生凋亡时，内源性核酸内切酶降解、断裂DNA，断裂生成的小分子量DNA溢出细胞外，细胞内DNA总量降低，利用流式细胞光度术可以检测出DNA的这种结构和量的变化。

3、琼脂糖电泳分析法 利用该方法可检测出呈云梯状的寡聚核小体。

第八节 心脑血管药理学实验方法与技术简介

心脑血管药物实验方法很多，择其要者简介如下：

一、血压测定及相关模型

血压测定法大体分为直接和间接测压法。直接测压可选用颈动脉或股动脉插管，通过压力换能器记录血压变化，一般用麻醉动物作急性实验。常用的间接测压法主要有大鼠尾容积测压及尾动脉脉搏测压法。实验性高血压模型有：1、肾血管性高血压模型（肾动脉狭窄性高血压模型），分为2肾1夹型（两侧肾完整，一侧肾动脉狭窄）、1肾1夹型（一侧肾切除，另一侧肾动脉狭窄）和2肾2夹型（两侧肾完整，两侧肾动脉狭窄），常用动物是狗和大鼠。2、内分泌性高血压模型 常用大鼠，包括DOC盐性高血压模型、肾上腺再生性高血压模型。3、神经原性高血压模型。4、遗传性高血压模型， 根据采用的遗传学方法进行分类：①选择性近亲繁殖高血压模型（如自发性高血压大鼠SHR、Dahl盐敏感大鼠DS、米兰种高血压大鼠 MHS、遗传性高血压大鼠 GH、以色列种高血压大鼠 SBH、里昂种高血压大鼠 LH）②基因工程高血压模型 高血压转基因动物（transgenic animals of hypertension）、高血压基因敲除动物（geneknockout animals of hypertension）。

研究降压药作用机理的实验方法包括:中枢降压(毁髓猫或大鼠模型、减弱神经反射性调节实验等)；

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外周降压（神经节阻断、对传出神经递质及受体的影响、对在体血管阻力或离体血管平滑肌作用实验等）。

二、心脏与血管实验法简介

心脏实验可用在位心脏和离体心脏进行。离体心脏实验最常用的方法是Straub法、八木-Hartung法与Langendorff法。前两种方法主要观察药物直接对心脏收缩力、传导与心输出量的影响，适用于两栖类动物如青蛙、蟾蜍等离体心脏；后者适用于哺乳类动物兔、豚鼠、大鼠等，不仅可观察药物对心肌的直接作用，还可观察药物对冠脉流量的影响。本法虽然排除了神经体液的调控作用，但不能同时控制前、后负荷和心率，故又建立了离体工作心脏实验法。在位心脏实验法有Bülbring法、家兔不破坏胸膜记录心收缩力法、狗心肺装置实验法等。

冠脉血管及冠脉血流量实验法 离体实验主要有冠状动脉条实验、Langendorff离体心脏测定冠脉灌流量法；在位心脏测定冠脉血流量及心肌耗氧量、测定区域性心肌血流量、86Rb测定心肌营养血流量法。 心血管药理实验方法中的技术手段还有：清醒大鼠心功能及血流动力学实验、动物心电图、心导管技术等。

三、抗心肌缺血与再灌注损伤药物实验法简介

首先介绍心肌缺血与再灌注损伤模型的制备：①整体动物结扎冠脉后再灌注模型（常用犬、兔、大鼠进行）；②离体心脏缺氧造成全心缺氧和其后的在给氧损伤，亦可结扎离体心脏的冠脉，然后松结产生局部心肌再灌注损伤；③体外心肌培养缺糖缺氧与再给糖给氧产生再灌注损伤。

心肌缺血与梗塞范围测定：组织学检查；NBT或TTC标本染色法；心肌酶活性测定（如CK、LDH）；心表面NADH荧光照相法。

还可应用心肌代谢测定法观察药物的影响，如测定血或组织中的乳酸、游离脂肪酸（FFA）、丙二醛（MDA）等，一般用试剂盒检测。

四、脑缺血和脑血流实验法简介

阻断支配脑组织的血管，可模拟与人脑卒中相近似的病理模型，实验性脑缺血模型制备的方法主要有：

1、全脑缺血：结扎大鼠双侧颈总动脉和椎动脉；结扎大鼠双侧颈总动脉合并血压下降法；沙土鼠双侧颈总动脉阻断；结扎大鼠一侧颈总动脉合并低氧环境处理等。2、局灶性脑缺血：阻断大鼠大脑中动脉（MCAO）法；沙土鼠一侧颈动脉结扎；光化学法致大鼠局部脑血栓和颈动脉内注入血栓法等。3、自发性高血压大鼠阻断大脑中动脉致脑卒中模型。

评价脑缺血程度的方法：⑴脑功能改变（神经症状评分、脑电图改变等）；⑵测定脑血流（放射微球法、放射自显影法和氢清除法等）；⑶组织学检查（脑切片染色法、病理切片）；⑷脑代谢测定（如SOD、MDA等）。

测定脑血流是评价脑缺血程度和药物作用的重要方法，目前常用的方法主要有：①开颅窗 显微镜下直接观察；②流量计测定法；③示踪技术 常用H2清除法；④脑组织同位素标记法；⑤大鼠脑血管在位灌流法等。

五、抗心功能不全药与抗心律失常药物实验简介

㈠ 抗心功能不全药实验法 在心功能不全动物模型上观察药物作用，制备模型至关重要，方法主要有：1、心脏压力超负荷模型：主动脉狭窄法（结扎或用特制动脉夹致腹主动脉狭窄、缩窄肾动脉、单侧或双侧肾切除等）；肺动脉狭窄法。2、心脏血容量超负荷模型：动静脉短路法、腔静脉缩窄法、主动脉瓣与二尖瓣关闭不全法等。3、化学因素致心功能不全模型：抑制心脏的药物（普萘洛尔、维拉帕米、戊巴比妥钠等）诱发心衰；阿霉素致心肌损害；氧自由基损伤心功能；心肌梗死加快速起搏造成CHF；拟似冠心病高血压的CHF等。

㈡ 抗心律失常药实验法 制备实验性心律失常通常以心电图II导联记录以观察心律失常类型、发生时间和持续时间等，进行药物研究可预防给药和治疗给药。主要方法简介如下：

1、药物诱发心律失常：氯仿致小鼠室颤；氯仿-肾上腺素致兔室性心律失常；哇巴因、乌头碱、氯化钡等诱发室性心律失常；乙酰胆碱诱发房颤等。

2、电刺激诱发心律失常：电刺激下丘脑或直接刺激心脏。

3、冠脉结扎诱发心律失常。

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4、产生窦房结功能低下及房室传导阻滞模型：阻塞窦房结动脉和房室结动脉法；缺氧营养液灌流离体窦房结和房室结标本法；维拉帕米致窦房结、房室结功能低下等。

第九节 行为药理学实验方法与技术简介

行为药理学主要研究药物对大脑学习、记忆功能及情绪活动（如焦虑、抑郁等）的影响，也包括药物依赖性的实验评价。

一、学习、记忆实验法和记忆障碍动物模型简介

学习和记忆是脑的重要功能之一。学习是指新行为（经验）获得和发展，记忆就是使获得的经验保持和再现。人类记忆区可分为三种存贮系统，即感觉记录系统，短时存贮系统和长时存贮系统。目前关于学习记忆的机制，认为“感觉记忆”即感知事物后在极短时间内的记忆，与脑的电活动有关；“短时记忆”和“长时记忆”可能与脑的神经细胞的突触效能或脑的化学变化有关，即学习、记忆有赖于全脑的整合功能，完成记忆的过程离不开知觉、情绪、注意、意图等心理功能，也离不开早已贮存的知识和经验。

（一）动物学习、记忆实验方法及模型：

1、跳台法（step down test） 简便易行，有较高的敏感性，尤适合于初筛药物。可同时观察药物对记忆过程及对学习的影响。

2、避暗法（step through test） 利用鼠类的嗜暗习性而设计。简便易行，对记忆过程特别是对记忆再现有较高的敏感性。

3、穿梭箱（shuttle box） 可同时观察被动和主动回避性反应。

4、爬杆法（pole-jump text） 适用于大鼠或小鼠。观察非条件刺激和条件刺激对动物逃避行为的影响。

5、迷津(maze) 学习、记忆的经典实验，至今仍经常采用。常用的装置有Y型迷路、水迷路和Morris水迷津。

6、小鸡的一次性味觉----回避学习行为的动物模型 Cherkin等人（1969）在前人研究的基础上，根据小鸡在自然环境中先天性的自发啄食行为而建立的小鸡一次性味觉－回避学习行为(one-trial-avoidance task)的实验模型。其优点：建立模型快，记忆保持良好；脑内注射方便；实验重复性好；实验成本低等。

7、操作式条件反射（operant conditioned reflex） 在巴甫洛夫经典的条件反射的基础上创立的一种实验方法，通过动物完成压杆或按键反应的特定活动来研究动物的学习行为。

（二）记忆障碍动物模型

1、记忆获得障碍模型 应用抗胆碱药物制备，常用东莨菪碱、樟柳碱。

2、记忆巩固障碍模型 如电休克、缺氧、使用蛋白质合成抑制剂（如环己酰亚胺、氯霉素等）。

3、记忆再现缺失模型 如乙醇可明显干扰记忆再现。

4、其他 小鼠脑缺血-再灌注模型；大鼠中脑动脉结扎-再灌注模型；脑栓塞模型；基底神经核-胆碱系统损伤模型及应激引起的学习、记忆障碍模型等。

二、抗焦虑实验方法及动物模型简介

焦虑以恐惧、忧虑、紧张不安等精神障碍为主要表现，一般认为，焦虑模型至少必须符合三个要求：①对临床有效的抗焦虑药敏感并呈剂量依赖性；②不同抗焦虑剂的相对强度应与在人体观察到的结果类似；③能够区别抗焦虑剂与非抗焦虑剂的不同效应。现有的焦虑模型包括二大类：一类是基于动物非条件反射的模型，根据其行为特点又可分为：⑴探究行为模型：大鼠高架十字迷宫（the elevated plus-mazetest, EPM）、小鼠明暗穿箱(light-dark transitions)、小鼠爬梯实验（the staircase test）、孔板实验（the holiboard test）、大鼠开场实验（the open field test）等；⑵社会行为模型：大鼠群居接触实验（the social interaction test）、分离发声实验（separation vocalization）。另一类是基于条件反射（传统学习模式）的模型，主要有Geller-Seifter冲突实验（Geller-Seifter conflict test ）、安全信号撤除实验（the safety signal withdrawal test）、Vogel冲突模型（the Vogel’s conflict test）等。这些焦虑模型虽然并非人类焦虑情绪的精确复制，但对于抗焦虑药物的评筛及探讨焦虑的生化机制发挥了重要作用。

三、抗抑郁实验方法及动物模型简介

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1、药物之间相互作用模型 一般作为抗抑郁药初筛手段。主要有：利血平拮抗（reserpine reversal）；高剂量阿朴吗啡的拮抗（antagonism of high dose of apomorphine）；5-HT诱导的甩头行为（5-HT induced head-twitches）；小鼠育亨宾增强模型（yohimbine potentiation model in mice）。

2、应激模型 包括：“行为绝望”及其衍生（“behavioural despair”and derivatives），如强迫游泳实验、悬尾实验等；获得性无助（learned helplessness）；未预知的长期应激刺激（chronic unpredictable stress）；未预知的长期温和应激刺激（chronic unpredictable mild stress）等。

3、脑损伤模型 嗅球切除模型（olfactory bulbectomy model）。

4、72s低频率差式强化程序（differential reinforcement of low rate 72-s schedule）。

四、药物依赖性动物实验方法简介

药物依赖性包括机体依赖性和精神依赖性。机体依赖性的试验评价以阿片类药物为代表，通用的实验方法主要有三种：自然戒断实验（spontaneous withdrawal test）、催促戒断实验（precipitation withdrawal test）和替代实验（substitution test）。常用动物：小鼠、大鼠、狗、猴。目前还发展了用离体组织标本进行评价，其方法主要为：①已形成阿片依赖性的整体动物身上取其离体组织进行试验；②直接将离体组织放在含阿片类药物的Krebs液中共浴一段时间后再进行试验。药物精神依赖性评价方法中认为比较成熟且应用较多的主要有两种：自身给药试验（drug self-administration）和药物辨别试验（drug-discrimination）；80年代后又发展了一种经济简便的条件性位置偏爱试验（conditioned place preference）。

第十节 时间药理学实验方法与技术

时间药理学即是在药理学研究时融入时间的概念，探讨生物节律性对药效学和药动学的影响，从而建立择时给药、合理给药的药物治疗方法。

生物节律性可以表现为宏观的生理变量的节律性，亦可表现为微观的细胞、亚细胞和酶系活动、活性的节律性；可以表现为外部环境（又称授时因子或同步因子）节律性变化对机体内环境产生的节律性影响，亦可表现为机体内环境对外部环境节律性变化所产生的适应性节律性变化。对于药物与机体的相互作用来说，机体的生物节律性会对药物的药理作用产生影响，药物也可能对机体的生物节律性产生影响。因此，在时间药理学的研究中，必须做到：

1、兼顾机体内、外环境节律性的变化，严格控制实验条件的同步化 如对授时因子（动物接受的光照时间、所处的环境温度、湿度，群居还是单养、进食进水时间、食物成分和进食量）的控制和对动物机体内环境（如年龄、体重、性别、是否处于特殊的生理期：发情、妊娠、分娩等）的选择控制等。

2、选择准确、可靠、灵敏、易于监测的节律标志 标志节律是指可以灵敏地反应机体某种生理机能过程的时间特征, 并可用作监测标志的节律。如啮齿动物肝药酶活性在24:00最高，14:00活性最低。人糖皮质激素分泌量在上午8:00达峰值，24：00～8:00的分泌量为全天总量的70%。正常人胆囊的昼夜节律，胆囊面积5：00～7：00>11：00～13：00>17：0：00～19：00、23：00～1：00（P<0.01）;3：00比23：00～1：00明显增大。

3、使用特殊的监测系统和给药系统 时间药理学研究就是探讨生物节律对药物效应的影响或药物对生物节律的影响。因此，必须用特殊的仪器设备同步收集相关的节律指变化参数。常用的仪器有动物行为自动监测仪，摄食节律监测仪，体温、心血管功能监测仪，程序化给药泵等。

第二章 动物实验的基本操作与技术

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动物实验方法是多种多样的，在医学的各个领域内都有其不同的应用，其中一些基本方法都是共同性的，如动物的选择、抓取、固定、麻醉、脱毛、给药、采血、采尿、急救、处死、尸检等，不管是从事何种课题的医学研究都要用这套基本方法，因此，动物实验基本方法，已成为医学科技工作者必须掌握的一项基本功。

第一节 实验动物的抓取固定方法

一、小鼠抓取固定方法

小鼠温顺，一般不会咬人，抓取时先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠笼或实验台向后拉，在其向前爬行时，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤（见图2-1之一），将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可（图2-1之二）。有经验者可直接用左手小指钩起鼠尾，迅速以拇指和食指、中指捏住其耳后颈背部皮肤亦可。这种在手中固定方式，能进行实验动物的灌胃、皮下、肌肉和腹腔注射以及其他实验操作。如进行解剖、手术、心脏采血和尾静脉注射时，则需将小鼠作一定形式的固定，解剖手术和心脏采血等均可使动物先取背卧位（必要时先行麻醉），再用大头针将鼠前后肢依次固定在腊板上。尾静脉注射时，可用小鼠尾静脉注射架固定（图2-2），先根据动物大小选择好合适的固定架，并打开鼠筒盖，手提鼠尾巴，让动物头对准鼠筒口并送入筒内，调节鼠筒长短合适后，露出尾巴，固定筒盖即可进行尾静脉注射或尾静脉采血等操作。

图2-1 小鼠的抓取固定方法

图2-2 小鼠尾静脉注射方法

二、大鼠的抓取固定方法

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大鼠的抓取方法基本同小鼠，只不过大鼠比小鼠牙尖性猛，不易用袭击方式抓取，否则会被咬伤手指。抓取时为避免咬伤，可带上帆布手套。如果进行腹腔、肌肉皮下等注射和灌胃时，同样可采用左手固定法，只是用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指紧捏鼠背皮肤，置于左掌心中，这样右手即可进行各种实验操作。也可伸开左手之虎口，敏捷地从后一把抓住。若做手术或解剖等，则需事先麻醉或处死，然后用细棉线绳活结缚腿，背卧位绑在大鼠固定板上；尾静脉注射时的固定同小鼠（只需将固定架改为大鼠固定盒）。

三、蛙类的抓取固定方法

蛙类抓取方法宜用左手将动物背部贴紧手掌固定，以中指、无名指、小指压住其左腹侧和后肢，拇指和食指分别压住左、右前肢、右手进行操作（见图2-3）。

图2-3 蛙、蟾蜍抓取固定方法

在抓取蟾蜍时，注意勿挤压其两则耳部突起之毒腺，以免毒液射进眼中。

实验如需长时间观察，可破坏其脑脊髓（观察神经系统反应时不应破坏脑脊髓）或麻醉后用大头针固定在蛙板上。依实验需要采取俯卧位或仰卧位固定。

四、兔的抓取固定方法

（一）抓取 实验家兔多数饲养在笼内，所以抓取较为方便。一般以右手抓住兔颈部的毛皮提起，然后左手托其臀部或腹部，让其体重重量的大部分集中在左手上（图2-4），这样就避免了抓取过程中的动物损伤。不能采用抓双耳或抓提背部。

（二）固定 一般将家兔的固定分为盒式、台式和马蹄形三种。盒式固定，适用于兔耳采血、耳血管注射等情况；若做血压测量、呼吸等实验和手术时，则需将兔固定在兔台上，四肢用粗棉绳活结绑住，拉直四肢，将绳绑在兔台四周的固定木块上，头以固定夹固定或用一根粗棉绳挑过兔门齿绑在兔台铁柱上；马蹄形固定多用于腰背部，尤其是颅脑部位的实验，固定时先剪去两侧眼眶下部的毛皮，暴露颧骨突起，调节固定器两端钉形金属棒。使其正好嵌在突起下方的凹处，然后在适当的高度固定金属榛。用马蹄形固定器可使兔取用背卧位和腹卧位，所以是研究中常采用的固定方法。

图2-4 家兔抓取方法

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第二节 实验动物编号标记方法

动物在实验前常常需要作适当的分组，那么就要将其标记使各组加以区别。标记的方法很多，良好的标记方法应满足标号清晰、耐久、简便、适用的要求。

常用的标记法有染色、烙印、号牌等方法。

一、颜料涂染

这种标记方法在实验室最常使用，也很方便。使用的颜料一般用3-5%苦味酸溶液（黄色），标记时用毛笔或棉签蘸取上述溶液，在动物体的不同部位涂上斑点，以示不同号码。编号的原则是：先左后右，从上到下。

二、烙印法

用刺数钳在动物耳上刺上号码，然后用棉签蘸着溶在酒精中的黑墨在刺号上加以涂抹，烙印前最好对烙印部位预先用酒精消毒。

三、号牌法

用金属制的牌号固定于实验动物的耳上，大动物可系于颈上。

对猴、狗、猫等大动物有时可不做特别标记，只记录它们的外表和毛色即可。

第三节 实验动物给药途径和方法

在动物实验中，为了观察药物对机能功能、代谢及形态引起的变化，常需将药物注入动物体内。给药的途径和方法是多种多样的，可根据实验目的、实验动物种类和药物剂型等情况确定。

一、皮下注射

注射时以左手拇指和食指提起皮肤，将连有5（1/2）号针头的注射器刺入皮下。皮下注射部位一般狗、猫多在大腿外侧，豚鼠在后大腿的内侧或小腹部；大白鼠可在侧下腹部。兔在背部或耳根部注射。蛙可在脊背部淋巴腔注射。

二、皮内注射

皮内注射时需将注射的局部脱去被毛，消毒后，用左手拇指和食指按住皮肤并使之绷紧，在两指之间，用结核菌素注射器连4(1/2)细针头，紧贴皮肤表层刺入皮内，然后再向上挑起并再稍刺入，即可注射药液，此时可见皮肤表面鼓起一白色小皮丘。

三、肌肉注射

肌肉注射应选肌肉发达，无大血管通过的部位，一般多选臀部。注射时垂直迅速刺入肌肉，回抽针栓如无回血，即可进行注射。给小白鼠、大白鼠等小动物作肌肉注射时，用左手抓住鼠两耳和头部皮肤，右手取连有5（1/2）针头的注射器，将针头刺入大腿外侧肌肉，将药液注入。

四、腹腔注射

用大、小白鼠做实验时，以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推 0.5～1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液（图2-5），为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。若实验动物为家兔，进针部位为下腹部的腹白线离开1cm处。

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图2-5 小鼠腹腔注射方法

五、静脉注射

（一）兔 兔耳部血管分布清晰。兔耳中央为动脉，耳外缘为静脉。内缘静脉深不易固定，故不用。外缘静脉表浅易固定，常用。先拔去注射部位的被毛，用手指弹动或轻揉兔耳，使静脉充盈，左手食指和中指夹住静脉的近端，拇指绷紧静脉的远端，无名指及小指垫在下面，右手持注射器连6号针头尽量从静脉的远端刺入，移动拇指于针头上以固定针头，放开食指和中指，将药液注入（图2-6）。用干棉球压在针眼处，然后拔出针头，继续压迫针眼至血止。

图2-6 家兔耳缘静脉注射方法

（二）小白鼠和大白鼠 一般采用尾静脉注射。鼠尾静脉有三根，左右两侧及背侧各一根，左右两侧尾静脉比较容易固定，多采用，背侧一根也可采用，但位置不易固定。操作时先将动物固定在鼠筒内或扣在烧杯中，使尾巴露出，尾部用45～50℃的温水浸润半分钟或用酒精擦拭使血管扩张，并可使表皮角质软化，以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧，使静脉充盈，用中指从下面托起尾巴，以无名指和小指夹住尾巴的末梢，右手持注射器连4(1/2)号细针头，使针头与静脉平行（小于30度），从尾下四分之一处（约距尾尖2-3厘米）处进针。此处皮薄易于刺入，先缓注少量药液，如无阻力，表示针头已进入静脉，可继续注入。注射完毕后把尾部向注射侧弯曲以止血。如需反复注射，应尽可能从末端开始，以后向尾根部方向移动注射（图2-7）。

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图2-7 小鼠尾静脉注射方法

六、经口给药

在急性试验中，经口给药多用灌胃法，此法剂量准确，适用于小白鼠、大白鼠、家兔等动物。

（一）小鼠、大鼠（或豚鼠） 用输血针头或小号腰穿针头，将其尖端斜面磨去，用焊锡在针尖周围焊一圆头，注意勿堵塞针孔，即成灌胃针；亦可用烧成圆头的硬质玻璃毛细管或特制的塑料毛细管，作为导管。灌胃时将针按在注射器上，吸入药液。左手抓住鼠背部及颈部皮肤将动物固定，右手持注射器，将灌胃针插入动物口中，沿咽后壁徐徐插入食道。动物应固定成垂直体位，针插入时应无阻力。若感到阻力或动物挣扎时，应立即停止进针或将针拔出，以兔损伤或穿破食道以及误入气管。

一般当灌胃针插入小鼠3－4cm，大鼠或豚鼠4-6cm后可将药物注入。常用的灌胃量小鼠为0.2-1ml，大鼠1-4ml，豚鼠为1-5ml。

（二）狗、兔、猫、猴 灌胃时，先将动物固定，再将特制的扩口器放入动物口中，扩口器之宽度可视动物口腔大小而定，如狗的扩口器可用木料制成长方形，长约10-15cm，粗细应适合狗嘴，约2-3cm，中间钻一小孔，孔的直途为5-10cm。灌胃时将扩口器放于上述动物上下门牙之后，并用绳将它固定于嘴部，将带有弹性的橡皮导管（如导尿管），经扩口器上的小圆孔插入，沿咽后壁而进入食道。此时应检查导管是否正确插入食道，可将导管外口置于一盛水的烧杯中，如不发生气泡，即认为此导管是在食道中。未误入气管，即可将药液灌入。

各种动物一次灌胃能耐受的最大容积小鼠为0.5-1.0ml，大鼠4-7ml，豚鼠为4-7ml，家兔为80-150ml，狗为200-500ml。

第四节 实验动物用药量的计算方法

动物实验所用的药物剂量，一般按mg/kg体重或g/kg体重计算，应用时须从已知药液的浓度换算出相当于每kg体重应注射的药液量（ml数），以便给药。

例1：家兔体重1.8kg的，静脉注射20%氨基甲酸乙酯溶液麻醉，按每kg体重1g的剂量注射，应注射多少ml？

计算方法：兔每kg体重需注射1g，注射液为20％，则氨基甲酸乙酯溶液的注射量应为5ml/kg体重，现在兔体重为1.8kg，应注射20%氨基甲酸乙酯溶液用量=5×1.8=9ml。

例2：小白鼠体重23g的，注射盐酸吗啡15mg/kg，溶液浓度为0.1%，应注射多少ml？

计算方法：小白鼠每kg体重需吗啡的量为15mg，则0.1%盐酸吗啡溶液的注射量应为15ml/kg体重，现小白鼠体重为23g，应注射0.1%盐酸吗啡溶液的用量=15×0.023=0.345ml。

第五节 实验动物的麻醉

在一些动物实验，特别是手术等实验，为减少动物的挣扎和保持其安静，并便于操作，常对动物采用必要的麻醉。由于动物种属间的差异等情况，所采用的麻醉方法和选用的麻醉剂亦有不同。

一、常用的麻醉剂

动物实验中常用的麻醉剂分为三类，即挥发性麻醉剂、非挥发性麻醉剂和中药麻醉剂。

1．挥发性麻醉剂 这类麻醉药包括乙醚、氯仿等。乙醚吸入麻醉适用于各种动物，其麻醉量和致死

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量差距大，所以安全度亦大，动物麻醉深度容易掌握，而且麻后苏醒较快。缺点是对局部刺激作用大，可引起上呼吸道粘膜液体分泌增多，再通过神经反射可影响呼吸、血压和心跳活动，并且容易引起窒息，故在乙醚吸入麻醚时必需有人照看，以防麻醉过深而出现上情况。

2．非挥发性麻醉剂 这类麻醉剂种类较多，包括苯巴比妥钠、戊巴比妥钠、硫喷妥钠等巴比妥类的衍生物，氨基甲酸乙酯和水合氯醛。这些麻醉剂使用方便，一次给药可维持较长的麻醉时间，麻醉过程较平衡，动物无明显挣扎现象。但缺点是苏醒较慢。

3．中药麻醉剂 动物实验时有时也用到象洋金花和氢溴酸东莨菪碱等中药麻醉剂，但由于其作用不够稳定，而且常需加佐剂麻醉效果才能理想，故在使用过程中不能得到普及，因而，多数实验室不选用这类麻醉剂进行麻醉。

二、动物的麻醉方法

（一）全身麻醉

1、吸入法 用一块圆玻璃板和一个钟罩或一个密闭的玻璃箱作为挥发性麻醉剂的容器，多选用乙醚作麻醉药。麻醉时用几个棉球，将乙醚倒在其中，迅速转入钟罩或箱内，让其挥发，然后把待麻醉动物投入，约隔4-6分钟即可麻醉，麻醉后应立即取出，并准备一个蘸有乙醚的棉球小烧杯，在动物麻醚变浅时给套在鼻上使其补吸麻醉药。本法最适于大、小鼠的短期操作性实验的麻醉，当然也可用于较大的动物，只是要求有麻醉口罩或较大的玻璃箱。由于乙醚燃点很低，遇火极易燃烧，所以在使用时，一定要远离火源。

2、腹腔和静脉给药麻醉法

非挥发性和中药麻醉剂均可用作腹腔和静脉注射麻醉，操作简便，是实验室最常采用的方法之一。腹腔给药麻醉多用于大、小鼠和豚鼠，较大的动物如兔、狗等则多用静脉给药进行麻醉。由于各麻醉剂的作用长短以及毒性的差别。所以在腹腔和静脉麻醉时，一定控制药物的浓度和注射量（见表2-1）。

表2-1 常用麻醉剂的用法及剂量

麻 醉 剂

戊巴比妥纳 动 物 狗、兔 给药方法 剂量（mg/kg）常用浓维 持 时 间 度% 静脉 30 大、小鼠、豚鼠

硫喷妥纳 狗、兔

大白鼠

小白鼠

氯 醛 糖 兔

大白鼠

乌 拉 坦 兔

大、小白鼠

蛙

蟾蜍 3 2-4小时中途加上1/5量，可维持1小时以上，麻醉力强，腹腔 40-50 3 易抑制呼吸。 腹腔 40-50 2 静脉 15-20 2 15-30分钟，麻醉力强，宜缓慢注射。 腹腔 40 1 腹腔 15-20 1 静脉 80-100 2 3-4小时，诱导期不明显 腹腔 50 2 2-4小时，毒性小，主要适静脉 750-1000 30 皮下或肌肉 800-1000 20 用小动物的麻醉。 淋巴囊注射 0.1ml/100g 淋巴囊注射 1ml/100g 20-25 10

（二）局部麻醉

1、猫的局部麻醉，一般应用0.5-1.0%盐酸普鲁卡因注射。粘膜表面麻醉宜用2%盐酸可卡因。

2、兔在眼球手术时，可于结膜囊滴入0.02%盐酸可卡因溶液，数秒钟即可出现麻醉。

3、狗的局部麻醉用0.5-1%盐酸普鲁卡因注射。眼鼻、咽喉表面麻醉可用2%盐酸可卡因。

三、麻醉注意事项

1、静脉注射必须缓慢，同时观察肌肉紧张性、角膜反射和对皮肤夹捏的反应，当这些活动明显减弱

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或消失时，立即停止注射。配制的药液浓度要适中，不可过高，以免麻醉过急；但也不能过低，以减少注入溶液的体积。

2、麻醉时需注意保温。麻醉期间，动物的体温调节机能往往受到抑制，出现体温下降，可影响实验的准确性。此时常需采取保温措施。保温的方法有，实验桌内装灯，电褥，台灯照射等。无论用哪种方法加温都应根据动物的肛门体温而定。常用实验动物正常体温：猫为38.6℃±1.0℃，兔为38.4℃±1.0℃，大鼠为39.3℃±0.5℃。

3、作慢性实验时，在寒冷冬季，麻醉剂在注射前应加热至动物体温水平。

第六节 急性动物实验中常用的手术方法

急性动物实验中常以血压、呼吸等为指标，以静脉注射、放血等为实验方法。需要暴露气管、颈总动脉，颈外静脉，股动脉，股静脉，并做相应的插管，以及分离迷走神经，减压神经及股神经等。因此手术主要在颈部及股部进行，现分述如下：

一、 兔、狗颈部手术

颈部手术的目的在于暴露气管、颈部血管并作相应的插管以及分离神经等。颈部手术成败的关键在于熟悉动物颈部及手术要领，防止损伤血管和神经现以兔为例，说明如下：

（一）动物麻醉 一般选用20%乌拉坦作全身麻醉。

（二）家兔背位固定于兔台上，颈部剪毛。剪下的毛置水中，以免飞扬。

（三）气管及颈部血管神经分离术

1、气管暴露术：用手术刀沿颈部正中线从甲状软骨处向下靠近胸骨上缘作一切口（兔长约4～6cm，狗的长约10cm）。切开皮肤后，以气管为标志从正中线用剪刀剪开筋膜，用止血钳钝性分离正中的肌群即可暴露气管，分离食道与气管，在气管下穿过一条棉线备用。

2、颈总动脉分离术：正中切开皮肤及皮下筋膜，暴露肌肉。将肌肉层与皮下组织分开。此时清楚可见在颈中部位有两层肌肉。一层与气管平行，覆于气管上，为胸骨舌骨肌。其上又有一层肌肉呈V字形走行向左右两侧分开。此层为胸锁乳突肌。用镊子轻轻夹住一侧的胸锁乳突肌，用止血钳在两层肌肉的交接处（即V形沟内）将它分开（注意，切勿在肌肉中分，以防出血）。在沟底部即可见到有搏动的颈总动脉鞘。用眼科镊子（或纹式止血钳）细心剥开鞘膜，避开鞘膜内神经，分离出长约3-4cm的颈总动脉，在其下穿两根细线备用。

3、颈部迷走、交感、减压神经分离术：于家兔颈部，在找到颈动脉鞘以后，将颈总动脉附近的结缔组织薄膜镊住，并轻拉向外侧使薄膜张开，即可见薄膜上数条神经，根据各条神经的形态、位置和走向等特点来辨认。迷走神经最粗，外观最白，位于颈总动脉外侧，易于识别。交感神经比迷走神经细，位于颈总动脉的内侧，呈浅灰色；减压神经细如头发，位于迷走神经和交感神经之间，在家兔为一独立的神经，沿交感神经外侧后行走，但在人、狗此神经并不单独行走，而是行走于迷走、交感干或迷走神经中。将神经细心分离出2-3cm长即可，然后各穿细线备用。

4、颈外静脉暴露术 颈外静脉浅，位于颈部皮下，其属支外腭静脉和内腭静脉，颈部正中切口后，用手指从皮肤外将一侧部组织顶起，在胸锁突乳肌外缘，即可见很粗而明显的颈外静脉。仔细分离长约3-4cm的颈外静脉，穿两线备用。

(四) 气管及颈部血管插管术

在前述分离术的基础上，按需要选作下列插管术。

1、气管插管术：暴露气管后在甲状软骨下1-2cm处，于两软骨环之间，剪开气管口径之半，再用剪刀沿正中线向头端剪开气管约0.5-1cm，使气管切口呈倒“T”形。用镊子夹住T形切口的一角，将适当口径的气管套管由切口向肺方向插入气管腔内，用准备好的棉线扎紧，再将结扎线固定于“Y”形气管插管分叉处，以防气管套管脱出。

2、颈总动脉插管术：颈总动脉主要用于测量颈动脉压。为此，在插管前需使动物肝素化，并将口径

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