磺胺喹恶啉人工抗原合成及鉴定

""" !屈艳南!,,侯玉泽!,邓瑞广",张改平",,刘庆堂",职爱民",刘宣兵!,,李彬彬!,,柴书军" (!"河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳#$!%%&;’"河南省农业科学院动物开放式免疫学重点实验室，河南郑州#(%%%’)

摘)要：国内首次用重氮化法将磺胺喹恶啉 *+) (分别与牛血清白蛋白,*-) (和卵清白蛋白 ./-) (偶联，制备免疫抗原 *+0,*-和包被抗原 *+0./-。紫外扫描法与 *1*0 2-34凝胶电泳法鉴定表明偶联成功，偶联比分别为 !%"! 5!、 6"75!。 *+0,*-免疫,-8, 9:小鼠，将获得了高效价、敏感性好的抗 *+血清，表明 48;*-方法鉴定偶联成功，为进一步制备抗 *+单抗奠定了基础。关键词：磺胺喹恶啉，人工抗原，鉴定

#$%&’()*)+%, *,(%&*-*.+&*/%/- )01-+20*%/3+1*%(+%&*-*.*+1+%&*4(%’ ! !"#$%0%$%!,,&’"#(0)*!,+,-./(001($%1’, 2&3-. .$0040%1’,,’’ 56" !0%107$%1’, 2&6 30080%’, 56" 9($%0:0%1!,,;0%0:0%!,, 56<36=>(0?(%’

(!"<=>?>@>AB=CDAEF GH *IA=>I=?>J K=IL>GMGNF, 8OGF?>N#$!%%&,:LA>?;’"<=>?> P=F 8?QGC?EGCF HGC ->AR?M;RRO>GMGNF, SL=>NTLGO#(%%%’,:LA>?) 56)&7+.&:$%&’()%’&)%(*+&,&$(-)#$ )( .%*/ 01 )( )"# 2&33%#3 -3()#%*, 405&*$ 675 )( -3#-&3# )"#%889*(:#* !"# 010405&*$ )#,) 2(&)%*:&*)%:#* 010 675"5.,(, 010 405&*$ 010 675+#3# 2(*;%38#$<= 9.)3&>%(.#),2&**%*:&*$ 0?00@5AB"!"# 2(*C9:&)%(*3&)%( (; 010405&*$ 010675+#3# !%"!5!&*$ 6"75!, 3#,-#2)%>#.="!"# -(.=2.(*&.&*)%<($=+%)""%:" )%)3#&*$,#*,%)%>%)=+#3#&.,(:&%*#$<=%889*%’%*: )"# 45D4 E F 8%2#+%)" 01 0 405" !"#,# 3#,9.),%*$%2&)#$ )"&) )"#"&-)#* 01+&,,922#,,;9..= .%*/#$ )( )"# 2&33%#3 -3()#%*,,+"%2"&.,( .&= )"#;(9*$&)%(*;(3;93)"#3:&%* 8(*(2.(*&.&*)%001" 8($ 9/7,):,9.;&G9%*(H&.%*#;&3)%;%2%&.&*)%:#*;%$#*)%;%2&)%(*中图分类号：+6&6"6!) ) ) )文献标识码： ) ) )文章编号： -) !%%’0%&%U’%!%) ( !!0%!$70%# ) )磺胺喹恶啉 *+) (又名磺胺喹沙啉，是一种高效抗虫剂、抗菌药，口服后吸收迅速，对禽类疾病有很好的疗效，应用广泛，但有一定毒性，且易在动物的[!]可食性组织中残留。由于 *+的良好药效，养殖场[$] **K又难以实现超微水平检针对 *+的分析较少；

测。试纸条检测是一种具有特异、敏感、快速、简便，直观等优点的新型检测手段。本研究旨在合成 *+人工抗原，为制备 *+单抗及开发 *+残留检测试纸条奠定基础。

在饲养动物过程中向饲料或动物饮用水中添加 *+,又未完全遵守国家兽药典规定的投药量、投药期和休药期的规定，导致 *+在动物源食品中大量残留。人食用这些动物源食品后，可能发生变态、过敏等反应，严重的还会产生致畸、

致癌作用。因此世界各国均制定了相对严格的兽药残留标准，我国及欧盟、日本、[’]美国等西方发达国家制定其残留标准为 !%%>N 9 N。

图 !) *+结构式

*+结构如图 !所示。关于 *+的残留分析，国内外[&,报道较多，主要是高效液相色谱法<28:) U]、 (微生[#]物学方法 **K ),相色谱 0质谱联用分析法 (液[(] ( 8:0 V*)。<28:与 8: 0 V*方法通常需要多个

!:材料和方法!;!:材料与仪器磺胺喹恶啉 *+)牛血清白蛋白,*-)鸡卵清 (、 (、 )实验用水为重蒸去蛋白 ./-)美国 *ANR?公司； (离子水 11W)实验室自制； ( )氢氧化钠等其它试剂 )国内市售分析纯级；实验动物) *2X级 U周龄雌性,?MQ 9:小鼠，购自郑州大学医学院实验动物中心，由河南省动物免疫学开放式重点实验室饲养。@0&%%%紫外扫描仪@/)日本岛津； ( ) 1@0U%%蛋白核酸分析仪),=IYR?>公司；&P0!7高速冷冻离心机 )德国 *;3V-公司； ((%型酶标仪 )美国

液—液分配 884) (和浓缩步骤，操作复杂，仪器设备要求高，不便于养殖场用于大规模筛查自检，且直接

收稿日期：’%%60%70!$) !通讯联系人作者简介：屈艳南 (!67&0)女，,在读硕士研究生，研究方向：食品药残快速检测。基金项目：十一五”“国家科技支撑计划 (’%%U,-P%’-’!)。

$ !"#

!"#$%&’公司；凝胶成像系统、()*+,-酸度计.美国(/00/公司；超净工作台.美国1#23&45"678"9"5公/:,;<电子天平.德国=:>>?:%公司；@A$B@司；

电热恒温水槽.上海一恒科技有限公司；C=$,D<电泳仪.大连捷迈科贸有限公司；,$*+自动双重纯水蒸馏器、*+$+定时恒温双向磁力搅拌器.上海亚荣生化仪器厂。

按下式计算4F与!4/在4F$!4/人工抗原中

［*］

的克分子浓度比，即偶联比：

K4FMK!4/H/K4F3 A!!4/3$/K!4/3 A!4FM/K!4/3

A/4F3$/K4F3 A/!4/3

计算4F与PT/在4F$PT/中的偶联比，方法同上。

-E,E,E,.4@4$R/U凝胶电泳鉴定.配制各种电泳溶液，浓缩胶浓度DV，分离胶浓度-<V［-<］，浓缩胶电压-,<T，分离胶电压;<T，上样量为,<!?，考马斯亮蓝染色+NIW，置脱色液中脱色过夜。

-E,E,E+.动物免疫鉴定.用4F$!4/疫;周龄雌性!/?!MK小鼠D只，免疫剂量D<!JM只，<E,3?M只，背部皮下分IN;点注射。首免，用无菌R!4溶解4F$!4/，与等量1K/混合，充分乳化；加强免疫，用无菌R!4溶解4F$!4/，与等量1)/混合，充分乳化，共免I次，每次间隔+周，最后-次免疫后-<’断尾采血分离血清，:?)4/方法检测抗4F多克隆抗体（Q/X）效价及敏感性。

Q/X效价测定：采用间接:?)4/测定Q/X效价。4F$PT/包被，包被浓度-!JM3?，包被量-<<!?M孔，+SO温育,W，R!4>洗板I次，每次间隔+3"7（下同）；用DV猪血清封闭,<<!?M孔，+SO温育-W，洗板；加多抗血清（Q/X），D<!?M孔，用封闭液倍比稀释，设阴性对照（0K）和空白对照（!K），+SO温育-D3"7，洗板；加%&=)JU$(%R，-Y-<<<用封闭液稀释，D<!?M孔，+SO温育,D3"7，洗板；加酶底物>=!显色-<<!?M孔，%>-<3"7；终止反应，-<<!?M孔,3#LM?(,4PI，读P@ID<73值；结果判断，以待测孔P@ID<73值"

［--］0KP@ID<73值的,E-倍（RM0",E-），判为阳性。

!"#$实验方法

-E,E-.4F人工抗原的制备.4F为小分子物质（=GH+<<EI），本身并不具有免疫原性，需要将其偶联到大分子载体蛋白上形成人工完全抗原才能免疫动

［B］

物。根据4F的分子结构与性质，采用重氮化反应

将它与载体蛋白偶联。

制备：称取4FIE<3J，加免疫抗原（4F$!4/）<EB3?(KL（-3#LM?），<NIO冰浴避光搅拌反应D3"7，逐滴加入单蒸水溶解的0&P(溶液，A)试纸刚刚变蓝时停止加入。搅拌反应D3"7，加!4/B3J，调Q(至*，<NIO冰浴搅拌反应过夜，R!4缓冲液透析S’。偶联反应路线见图,。

图,.4F偶联反应式

包被抗原（4F$PT/）的制备：PT/取;ES3J，具体方法及化学物质用量同上。-E,E,.人工抗原的鉴定

-E,E,E-.紫外扫描鉴定及偶联比估算.人工抗原的紫外扫描鉴定：将人工抗原用R!4稀释到适当倍数按下式计算蛋白后，测定,B<73和,;<73的P@值，

［*］的浓度即抗原的浓度：

敏感性鉴定：采用阻断:?)4/鉴定其敏感性。4F$PT/包被，包被浓度-!JM3?，包被量-<<!?M孔，+SO温育,W，R!4>洗板I次，每次间隔+3"7（下同）；DV猪血清封闭，,<<!?M孔，+SO温育-W，洗板；加P@ID<73为-E<的小鼠血清D<!?和不同浓度的4F标准品作抑制剂，设0K和!K，+SO温育-D3"7，洗板；加%&=)JU$(%R，-Y-<<<用封闭液稀释，每孔D<!?，+SO温育,D3"7，洗板；加酶底物>=!显色，每孔-<<!?，室温反应-<3"7；终止显色反应，每孔加入终止液,3#LM?(,4PI-<<!?，用酶标仪读P@ID<73值；

计算抑制率（!M!<，!<为4F<浓度的标准品吸光值，

［-,］!为其他4F不同浓度的标准品吸光值）。以!M

蛋白浓度（3JM3?）H-EIDP@,B<$<ESIP@,;<

据此用R!4缓冲液配制4F和!4/标准溶液，调节4F与!4/标准溶液浓度与4F$!4/溶液中蛋白质的浓度一致，在波长,,<NI,<73范围内进行紫外扫描，根据扫描图谱进行人工抗原鉴定。偶联比的估算：将4F、!4/及4F$!4/人工抗原配制成一定浓度的溶液，使4F、!4/溶液浓度与4F$!4/浓度相同（方法同上），对它们分别进行紫外扫描，得到P@值/4F3、/!4/3（分别为4F在4F和!4/最大吸收波长处的P@值）和!4F3、!!4/3（分别为!4/在4F和!4/最大吸收波长处的P@值）；根据算式：AHP@值MK?（A为克分子消光系数；K为各物质浓度；?为光径），分别计算出A/4F3、A/!4/3、A!4F3、A!!4/3，分别为4F、!4/的两个摩尔消光系数。

定点检测4F在4F和!4/的最大吸收波长处的P@值即：/K4F3、/K!4/3。

!<为纵坐标，以4F浓度的对数值为横坐标，在半对数坐标轴上绘制4F对4FQ/X的抑制曲线，根据曲线趋势推导回归方程，计算4FQ/X对4F的D<V抑制浓度（D<V)7W"X"8"Z65#756782&8"#7，)KD<），以)KD<衡量其敏感度。

#$结果与分析

#"!$人工抗原的鉴定结果

,E-E-.[T鉴定结果.

如图+。由图可见，4F$!4/

曲线与!4/曲线形状差异较大，,B<73处的!4/特征吸收峰与,D+73处4F特征吸收峰叠加并位移至,;-73处，在,D+734F特征吸收峰处4F$!4/吸收

［-+］峰明显上升，表明人工抗原偶联成功。

$!"#

表 !"间接#$%&’测小鼠抗&(血清效价序号 ! ) . )** )23.+ )23.+ !25)+** !244, )2.4. )2.*5,** !2*+, !2+44 *243)抗血清稀释倍数 !-** *2-!, *2,4) *2.3* .)** *2.)* *2+!) *2!4) -+** *2!5* *2))5 *2!.+ !),** *2!). *2!.+ *2*,3/0 *2*45 *2*4*2*4, 10 *2*44 *2*4) *2*4.

表 )"小鼠抗血清对&(的抑制效价序号 !号 )号 .号 !**** *2))3 *2+!) *2!*) 3*** *2.!4 *2+4* *2!3. )3** *2+54 *2+55 *2),!&(标准品浓度 67 8 9$) ( !)3* -)3 *23). *2-4, *233*2-+, *2.!. *2.-* .!)23 *2445 *24*) *2+-, !3-2)3 *2,!* *245. *23*, * !2*43 !2*4*25,-

图 ." 1&’、和&(:1&’的紫外扫描光谱&(""因此确定&(已与两种载体蛋白都偶联成功。根据公式可以算得&(: 1&’的偶联比为 !*2!;!,&(:<=’偶联比为 52,;!。 )2!2)"&>&:?’@#鉴定结果"如图+。由图可见， 1&’的泳动速度大于&(: 1&’,说明&(: 1&’的分子[!+:!3]量大于 1&’,证明&(与 1&’已成功偶联。

图 3"&( F’G对&(的阻断#$%&’抑制曲线法，进一步证实了重氮化法适用于芳香胺而@’法适[!4]合于脂肪胺的报道。影响人工抗原免疫原性的因

素有多种，主要因素包括载体蛋白的性质、半抗原的分子空间结构、间隔臂的长度和分子结合比。本研究选用理化性质稳定，不易变性，价廉易得的 1&’作载体蛋白， 1&’分子内含自由氨基多，在较大 FS范围和不同离子强度下均能保持较大的溶解度，更有利于偶联反应

的进行。间隔臂的介入长度要合适，过短则载体蛋白的空间位阻将影响细胞对半抗原的识别，不产生特异性抗体，本研究以:/ K/:作间隔臂，长度适宜，有助于半抗原结构的暴露，有利于特[!,]异性抗体的产生，不会形成新的抗原表位，避免了

“桥抗体”的出现，又产生了针对&(的特异性抗体。本研究成功合成了&(人工抗原，免疫 1’$1 8 0

图+"&(:1&’偶联物的&>&:?’@#鉴定注：为 ABCDEC;为 1&’;为&(:1&’。 ! ) .)2!2." F’G鉴定结果 )2!2.2!"间接#$%&’效价测定结果"结果见表 !。由表可知，免疫的 .只小鼠血清抗体效价均达到了 !*: .,说明获得了较好的免疫效果，其中 )号小鼠效价最高为 !;-2+ H !* .。 )2!2.2)"&( F’G敏感性鉴定"结果见表 )。&(在 !****I !3-2)3!7 8 9$范围内，只小鼠均产生了抑 .制，其中 .号小鼠抑制效果最好，将其<>+3*69值转化为 1 8 1*,再对$7&( 8 !**][进行回归分析，号小鼠 .的线性回归方程为 J K: *2).!5L M !2*.+-, )为 N *25453, 3*为 )*!254-!67 8 9$,%0见图 3。

小鼠制备出高价、特异的 F’G,为抗&(单克隆抗体的进一步研制及其免疫学分析方法的建立奠 ( 9’G)定了基础。

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!"讨论&(存在活性基团伯氨基，$B6OPQER6EC创立的以小分子半抗原与大分子载体交联合成完全抗原理[!-]论为基础，对于带有氨基的半抗原与载体蛋白的

偶联一般采用重氮化法和戊二醛@’)本研究对 (法，这两种方法进行了比较，结果表明重氮化法优于@’

$ !"#

素。对 !、因素用#$%法进行多重比较，"比较表如表&’表 (所示。

表 )*方差分析表变异来源/ !"误差总变异平方和自由度 .-,0)) 0-,,.. 0-&&(

3,-10)& (-(4.. . . . . (水平,-,),-,1,-,),-,1 !1 .(-4 7". .( 7均方 1-,12( 1-),11 1-(04)+值 1)-,11( ..-14,1! .2-,)&(!+,-,) (., .) 13-,,

图 1*底物浓度对酒度的影响.-0-.*最适发酵温度的确定*将制备好的固定化颗采取不同温粒加入含高粱粉 .,>的发酵培养基中，

表&*多重比较用$$%及#$%值秩次距 5$$%#$% .&-,3 14 1-.3) .-32& !0 .)-, 8"1 .&-) 8 0&-,3 14 1-.3) .-32& 4&-,3 14 1-.3) .-32& !. .4-) 8"0 .0-4 9

度： 0,、 04、 0(?, .(、 0.、 0&、进行酒精发酵实验，考察发酵温度对酒度的影响，结果如图 .所示。

表 2* !因素各水平均值多重比较表 !因素 6 (水平,-,)"因素 6 (水平,-,)

表 (*"因素各水平均值多重比较表

图 .*发酵温度对酒度的影响由图 .可知，低温、高温都不利于酒度的增加，该固定化颗粒的最适发酵温度为 0.?。提高温度能使糖化酶的活力有所增大，但不利于酵母发酵产酒，而且高温会导致酵母过早的衰老，被污染的可能性增大。

* *多重比较结果以/0 !1".最好，即最优组合为：加酶量 1.,:;,体<=/浓度为 (>,母添加量载酵为,-.;。

#$结论固化剂的最优组合为：酸浓度为 4>,为硼@A )-,,壳聚糖浓度为 1-,>,氯化钡浓度为 .>;当固化剂的总体积为 .,:#时，共固定化的最佳组合为：加酶量 1.,:;,添加酵母量,-.;,载体浓度为 (>。

!"#$对固定化颗粒的研究.-0-1*最适底物浓度的确定*分别取高粱粉的浓度为 1,>、 1)>、 .,>、 .)>、 0,>,配制 .,,:#的固定化酵母活化增殖培养基，接入制备好的固定化颗粒进行发酵实验，考察其对酒度的影响，结果如图 1所示。由图 1可知，最适宜的底物浓度为 .,>,随着底物浓度的增大，酒度先增大后又下降。其原因可能是：当淀粉浓度低时，酶与淀粉不能充分接触并分解为酵母所需的葡萄糖，导致酵母的发酵能力下降，而采用较高浓度的底物浓度，会使底物在被利用完之前，酒度就已经很高，从而抑制了发酵进程。

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###############################################(上接第 1(,页)

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