病毒TCID50测定方案

TCID50测定方案

2012112339

1 简介

TCID50(Tissue Culture Infective Dose)，半数组织培养感染量，又称50%组织细胞感染量，指能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变(Cytopathic effect，CPE)的病毒量。

将不同稀释度的病毒接种到96孔板上培养的单层细胞上。观察细胞病变，待细胞不再病变时记录每个稀释度出现病变和未出现病变的孔数，按照Reed-Muench公式计算TCID50值。

2 试剂

试剂

DMEM-basic培养基 胰蛋白酶

胎牛血清Fetal bovine serum PBS

来源 Gibco，上海 Gibco， Hyclone， Hyclone，

保存条件 4℃保存 -20℃冻存 -20℃冻存 -20℃冻存

3 仪器与耗材

仪器

CO2培养箱 生物安全柜 倒置显微镜 显微照相系统 高速冷冻离心机 电子天平 移液器 液氮罐 电冰箱

规格

耗材 细胞培养瓶 无菌离心管 一次性移液管 细胞培养板

规格

25cm2

15mL，50mL

1mL，2mL，5mL，10mL 96孔

4 细胞及培养基

DF-1细胞株

细胞生长液（500mL）：20?S（胎牛血清）+1%双抗（青链霉素）+剩余用DMEM

100mL 5mL 395mL

细胞维持液（50mL）： 1%双抗（青链霉素）+ DMEM（无血清）+1?S

0.5mL 49mL 0.5mL

细胞冻存液（50mL）：70%DMEM-basic + 20?S + 10%DMSO 35mL 10mL 5mL 4℃保存备用

5 病毒株及培养方法

禽流感病毒（Avian influenza virus ，AIV），H5N1株；禽白血病病毒（Avian leukosis virus ，ALV），HPRS-103株；禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus ，IBV），H52株； 禽传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus ，IBDV），B87株。

1

病毒培养方法：DF-1细胞培养和鸡胚培养。

6 操作步骤

6.1 DF-1细胞的传代

1. 吸弃细胞培养瓶中旧的培养液；

2. 加入灭菌PBS 5mL清洗细胞，重复两次； 3. 加入1ml 0.25%的胰蛋白酶消化；

4. 约40s左右（置于显微镜下观察，发现细胞圆缩、胞间隙增大），站立放置细胞瓶，并加入细胞生长液10mL，反复吹打瓶壁细胞(吹打过程要轻柔且尽可能不出现泡沫)，并将细胞吹散，之后取两只新的细胞培养瓶，开盖待用；

5. 向原细胞瓶中再加入细胞生长液10mL，并吹吸混匀，然后吸取约7ml细胞悬液加入到2个新的培养瓶中； 6. 37℃ 5%CO2中培养3天，期间观察细胞生长情况，细胞长至占瓶壁70%-80%时可接种病毒，长满可传代。

6.2 DF-1细胞的冻存

1. 取生长48-72h的DF-1细胞，吸弃旧的培养液； 2 .吸取无菌PBS 5mL清洗细胞，重复两次； 3. 加入1mL 0.25% 胰蛋白酶消化；

4. 约40s左右后，加入3mL DF-1细胞生长液终止消化，并吹打细胞瓶壁，使细胞悬浮于生长液中；

5. 吹吸细胞，使混匀，之后将细胞悬液转移至50mL无菌离心管中； 6. 1000rpm，室温离心10min；

7. 弃上清，加入细胞冻存液，置-20℃、-80℃梯度冻存，最后保存于液氮中。

6.3 TCID50的测定 6.3.1 96孔板培养细胞

1. 取1瓶长满的细胞，吸弃培养瓶中旧的培养液； 2. 吸取无菌PBS 5mL清洗细胞，重复两次； 3. 向瓶内加入1ml 胰蛋白酶消化；

4. 约40s左右后（置于显微镜下观察，发现细胞圆缩、胞间隙增大），站立放置细胞瓶，并加入细胞生长液10mL，反复吹打瓶壁细胞(吹打过程要轻柔且尽可能不出现泡沫)，并将细胞吹散；

5. 吸取一滴细胞悬液置于细胞计数板上，对细胞进行计数；

6. 加入细胞生长液稀释细胞悬液至含细胞22.2万个/mL（约4万个/孔）；

7. 取一块96孔板，每孔加100μl的细胞悬液（枪头紧贴孔的一侧壁且不接触孔底，缓缓将细胞打下去，每加8孔，将未加的细胞悬液均匀混合），铺好后静置5min观察细胞，再放入37℃培养箱中培养至细胞长到70%-80%。

6.3.2 96孔板接种病毒

1. 将病毒室温解冻。吸取细胞维持液 9mL，再吸取1ml病毒液，用0.22μm微孔滤膜过滤至15ml无菌离心管中，记为1号管；

2. 另取10只1.5ml无菌离心管，编号2-11，将1中病毒悬液用细胞维持液10倍递次稀释成10-2至10-11 不同的稀释度；

2

3. 弃去96孔板中的旧培养液（甩板法：紫外灭菌前将铺有纱布的托盘置于工作台灭菌），分别在每孔加入100μl的无菌PBS洗涤，重复两次；

4. 每孔接种100μl上述梯度稀释的病毒液，每个稀释度接种8孔。并设置1列正常细胞对照组，每孔加100μl细胞维持液，37℃ CO2培养箱中吸附1h。（图1） 细胞对照组 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1

图1 96孔板中病毒接种 1：细胞对照组；2-12：为接种病毒组

5. 1h后每孔加入细胞维持液100μl，放入37℃培养箱中继续培养。

6. 每日在倒置显微镜下观察细胞病变（70%以上的细胞出现CPE判为感染），记录病变程度和孔数（并拍照），待细胞病变不再继续（约72h后）后判定并记录结果（表1）。

表1 病毒液稀释度 出现CPE孔数

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10

无CPE孔数

累 计

CPE孔数

无CPE孔数

出现CPE孔所占的%

7 .按照Reed-Muench计算法计算（本实验用100TCID50/0.1ml）：

距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）

X：lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数 TCID50=10-X/0.1ml

含义：将该病毒稀释10X接种100μl可使50%的细胞发生病变。 示例：

细胞病变情况统计及致病百分率计算

3

累 计

病毒液 稀释度 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11

出现CPE孔数 8 8 8 7 6 4 5 2 1 0 0

无CPE 孔数 0 0 0 1 2 4 3 6 7 8 8

无CPE孔数

0 0 0 1 3 7 10 16 23 31 39

CPE孔数

出现CPE孔所占的%

49 41 33 25 18 12 8 3 1 0 0

100% 100% 100% 96.2% 85.7% 63.2% 44.4% 15.8% 4.2% 0 0

② 按照Reed-Muench计算法计算TCID50（本实验用100TCID50/0.1mL）

=0.7

TCID50数=0.7×1+6=6.7 TCID50=10-6.7/0.1mL

也既是说，此病毒之10-6.7接种100μL可使一批细胞有50%病变的可能性。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/m8u7.html