微生实验报告 2012.10.17 实验二 细菌的芽孢染色 - 图文

微生实验报告

姓名：王晶晖

专业年级：2011级生物技术 学号：040312011032

实验三 细菌的芽孢染色

一、实验目的

学习细菌芽孢的染色方法原理及操作步骤。 二、实验原理

芽孢是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈球形或椭圆形。细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低不易着色，若用一般的染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色但一旦染上色后有难以脱色这一特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同一个原则，除了用着色力强的染料外，还需加热，以促进芽孢染色。当染芽孢时，菌体也会着色，然后水洗，芽孢染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色，然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，容易辨认。 三、实验器材

1、菌种：培养24~36h的苏云金芽孢杆菌或者枯草芽孢杆菌。 2、染色剂和试剂：5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液。

3、器材：小试管，滴管，玻片搁架，接种环，擦镜纸，镊子，显微镜等。 四、实验方法

1、涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。

2、晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火上通过2~3次。 3、染色：

（1）加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料一铺满涂片为度），然后将涂片用试管夹夹住，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计时，维持15~20min。加热过程中要随时交替添加染色液和蒸馏水，切勿让标本沸腾或干涸（加热时温度不能太高）。 （2）水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。 （3）复染：用0.5%番红水溶液染色3min。 （4）水洗、晾干或吸干。

（5）镜检：先用低倍物镜，再用高倍物镜，最后在油镜下观察芽孢和菌体的形态。 4、结果：芽孢呈绿色，菌体呈红色。 五、实验报告

六、实验分析

最后的形态观察还可以，只是由于第一次接触孔雀绿溶液，前几次的染色都不算成功。 七、思考题

1、为什么在孔雀绿染色液加热中，要等玻片冷却后才能用水洗？

答：因为热的玻片如果突然用水冲洗，那么很容易造成玻片的破损或破裂。

2、若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到菌体，你认为这是什么原因？ 答：

1、可能菌种培养的环境太恶劣了，营养体几乎都变成芽孢了。 2、可能复染出现问题，菌体没有染上颜色。

实验四 细菌的鞭毛染色

一、实验目的

学习细菌鞭毛染色法的原理及方法。 二、实验原理

细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生的位置和数量是细菌的一个重要的形态特征。细菌的鞭毛极细，直径一般为0.01~0.02um，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让其沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染

剂由丹宁酸和氯化高铁或明矾等配成。 三、实验器材

1、菌种：培养12~16h的变形杆菌或大肠杆菌斜面。

2、染色液与试剂：鞭毛染色液A液与毛染色液A液液，蒸馏水，香柏油，显微镜擦镜纸。 3、器材：载玻片，擦镜纸，吸水纸，记号笔，试管夹，镊子，接种环，双层瓶，显微镜。 四、实验方法

1、清洗玻片：选择光滑无裂痕的玻片，置于洗衣粉过滤液中煮沸20分钟。取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡5~6d，使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗，将水沥干后，放入95%乙醇中脱水。

2、菌种的准备及制片：菌龄较老的细菌毛容易脱落，在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接3~5代，以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱中培养12~16小时。然后。吸取少量蒸馏水滴在洁净玻片的一端，无菌操作状况下在斜面上取菌少许，在蒸馏水中轻沾，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端。用吸水纸吸去多余的菌液，涂片方空气中自然干燥。 3、染色：

（1）滴加鞭毛染色液A液，染4~6min。 （2）用蒸馏水充分洗净A液。

（3）用鞭毛染色液B液冲去残水，再加B液与玻片上，在酒精灯火焰上加入至冒蒸汽，维持0.5~1min（加入时应随时补充蒸发掉得染料，不可时玻片出现干涸）。 （4）用蒸馏水洗，自然干燥。

4、镜检：先低倍物镜，再高倍物镜，最后油镜观察。 结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。 五、实验报告

六、实验分析

因为细菌的鞭毛过于微小，加上染色的不成功，所以这次的实验结果是从别的小组那儿借鉴过来的。 七、思考题

1、用鞭毛染色法准确鉴定一株菌是否有鞭毛要注意哪些环节？

答：

1.要用新鲜的细菌培养物；

2.培养基中最好不要加抑菌剂，尤其是影响鞭毛的；最好用液体培养基的培养物； 3.如从固体培养基取菌，要取菌落边缘的；

4.载玻片要干净，最好用酒精浸泡过夜，干燥后再使用； 5.制片时用蒸馏水而不是生理盐水； 6.染料要纯净； 7.不能加热固定；

8.取菌不可多取，否则鞭毛叠在一起不容易观察。

实验五 细菌的荚膜染色

一、实验目的

学习细菌荚膜染色的原理和方法。 二、实验原理

荚膜是包围在细菌细胞外地一层黏液状或胶质状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由于

荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈，由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形影响观察。 三、实验器材

1、菌种：培养2~3d的褐球固氮菌，该菌在阿须贝培养基上生长时，产生丰厚的荚膜。 2、染色液和试剂：用滤纸过滤后绘制墨水或黑色素溶液，番红染色液，香柏油显微镜擦镜纸。

3、器材：载玻片，试管夹，擦镜纸，双层瓶，显微镜等。 四、实验方法

1、制菌液：加一滴绘图墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其混合均匀。 2、推片：取一清洁载玻片一端接触混合液，以30度角进行推片。 3、晾干：在空气中自然晾干。

4、镜检：先低倍物镜，再高倍物镜，最后油镜观察。

结果：背景黑色，菌体红色，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。 五、实验报告

六、实验分析

这个实验操作比较简单，只是由于观察时光线太明亮以及是负染色法，背景是黑色的，导致只看请了菌体的荚膜而看不清菌体。 七、思考题

1、荚膜染色为什么要用负染色法？

答：因为荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色。

2、为什么在荚膜染色中一般不用热固定，而用纯甲醇进行固定？

答：因为荚膜的含水量在90%以上，热固定会使荚膜皱缩变形，影响观察。

3、通过荚膜染色法染色后，为什么被包在荚膜里的菌体着色而荚膜不着色？

答：荚膜主要成分是多糖类，与染料的亲和力弱，不容易着色。而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。

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