重组质粒的构建转化筛选和鉴定(2)

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

摘要

本实验通为了验证重组质粒的类型，进行了如下实验：PUC19的单酶切、连接、转化、重组子的筛选与鉴定、转化子的菌落PCR、平板复证、琼脂糖凝胶电泳等。所用的酶有Hind Ⅲ核酸内切酶，T4连接酶和Taq酶。由于Hind Ⅲ单酶切质粒产生的片段多样，需要通过一系列的筛选、副证与电泳鉴定来最终确定酶切片段的类型。

关键字 酶切 连接 转化 重组子琼脂糖凝胶电泳

引言

重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。本实验的供体是λ DNA，受体是E.coliDH5α,载体是PUC19。

DNA的酶切通常是DNA重组技术的第一步，酶切是指将不同来源的DNA上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质的不同可分为三大类，分别为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类：Ⅰ类酶的识别部位和切点不同，切断部位不定；Ⅲ类酶的识别部位和切点不同，但切断特定部位；Ⅱ类酶切断识别部位或其附近的特定部位，酶切后的双链DNA的末端是粘性末端，某些限制酶产生平末端。因此，应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是Ⅱ类酶。酶切又分为单酶切和双酶切，单酶切就是只用一个限制性内切酶去切质粒,使环状的质粒被切割为一条或多条线状DNA,单酶切操作简单，但是后期筛选工作复杂；双酶切用两个限制性内切酶,质粒上就产生了两个缺口,环状质粒变成两段线状DNA了片段，双酶切前期酶切操作复杂，但是重组效率高。本实验所选用的限制酶是Hind Ⅲ，选用方法是单酶切法。

DNA连接反应是利用DNA连接酶把载体DNA和要克隆的目的DNA片段连接在一起，成为一个完整的重组分子的反应。当载体DNA和外源DNA末端都是由一种产生粘性末端的内切酶切割产生的话（同尾酶也可以），或者两者末端被接上一段互补的多聚体的尾巴，那么经退火后可形成新的重组分子。连接后产生的重组分子中仍然保留着外源DNA两端的限制性内切酶切点，从而使我们能方便地从重组分子再次取出所克隆的DNA段。本实验所选用的连接酶是T4连接酶。

转化是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象。为了检验连接产勿，需要对转化子进行筛选，本实验将重组质粒导入大肠杆菌，用氨苄抗性的选择培养基对转化子进行筛选；通过红白斑反应对重组子进行筛选。

电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大

分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶电泳是分子生物学的核心技术之一。凝胶是电泳支持介质，具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，此时移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定 和 纯化DNA片段。

为了进一步验证重组质粒的类型，本实验进行了如下后续实验：菌落PCR、进一步的酶切反应、和一系列的DNA电泳（对菌落PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳、重组质粒的1%琼脂糖凝胶电泳、酶切重组质粒的1.2%琼脂糖凝胶电泳），最终从电泳图中确定出酶切产物的片段大小。

正文 1.材料和方法 1.1 材料和试剂

实验材料：PUC19质粒，E.coliDH5α。

实验试剂：Hind Ⅲ核酸内切酶，T4连接酶和Taq酶，琼脂糖，TEA，质粒提取

试剂盒，buffer，PCR引物，ddH2O，CaCl2，麦康凯培养基，LB液体培养基等。

1.2实验方法

1.限制性核酸内切酶的酶切反应

（1）分别在1.5ml离心管中按照表1表酶切反应体系按顺序加入各组分，每组都需要酶切自己组提出的pUC19质粒，韩霜酶切λ DNA（商品），王帅酶切pUC19（商品）。

表1 酶切反应体系

Ⅰ 加样序号 反应体系成分 pUC19（各组） 体积（μL） 1 2 3 4 共计 ddH2O 10×M buffer DNA Hind Ⅲ（15U /μL） 13.0 2.0 4.0 1.0 20.0 Ⅱ λ DNA（商品） 体积（μL） 69.0 10.0 15.0 6.0 100.0（50+50） Ⅲ pUC19（商品） 体积（μL） 62.0 8.0 4.0 6.0 80.0（40+40） （2）每组样品混匀后4000rpm,1min离心，将液体集中于管底 （3）在37℃水浴1~2h后,将溶液存放在-20℃以待下次电泳使用。

2.第一次材料准备

（1）每组将1.5mL离心管若干放入500mL三角瓶中灭菌； （2）全班用100 mL三角瓶装2瓶20mL无菌水以待高压灭菌

（3）全班配置用2个量筒（以及搪瓷杯）配置LB液体培养基共2000ml ，并进行如下分装：25ml/100ml三角瓶×20瓶，50ml/300ml三角瓶×6瓶,100ml/300ml三角瓶×12瓶(加入1.3%的琼脂，即15.6g琼脂),放入高压锅灭菌。 （4）把使用的枪尖盒装满、包好，做好“黄蓝”标记，高压除菌；

3.对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳

（1）正确组装制胶槽、制胶板、18尺的样品梳（制两块胶）；

（2）取80mL1×TAE至250mL红盖试剂瓶中；再称0.8g琼脂糖，倒入瓶中，轻旋混匀，轻旋瓶盖，微波炉加热沸腾3-4次，至溶液澄清无颗粒；

（3）待溶液冷却至60℃左右，加入40μL 1mg/mL的溴化乙锭（EB）溶液，使EB溶液终浓度为0.5mg/mL，混匀后倒入制胶槽中，冷却凝固待用（冷却凝固时间要在30min以上）。 （4）每组取1个1.5mL离心管，加入8μL反应体系Ⅰ的酶切反应液和2μL 6/10x Loading buffer，用微量移液器吹吸混匀。韩霜取1个1.5mL离心管，分别加入4μL 反应体系Ⅱ的λDNA（商品）酶切反应液和1μL6/10x Loading buffer，用微量移液器吹吸混匀。王帅取1个1.5mL离心管，分别加入4μL 反应体系Ⅲ的pUC19（商品）酶切反应液和1μL6/10x Loading buffer，用微量移液器吹吸混匀。老师取1个1.5mL离心管，分别加入4μL 反应体系Ⅲ的pUC19（商品test）酶切反应液和1μL6/10x Loading buffer，用微量移液器吹吸混匀。

（5）待胶冷却完毕，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳槽中事先加入1×TAE电泳缓冲液）将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中，添加1×TAE至高出胶面约1mm；

（6）将上述混合好的DNA样品，按照表顺序，点样到上样孔中（1~3韩霜点样；2~6王帅点样，其他上样孔各组点各自的样）。

表2酶切反应电泳上样顺序 泳道 1 λ/Hind Ⅲ 2 3 λ/ HindⅢ（Test） 4 pUC19（商品） 5 pUC19样品 λDNA Hind Ⅲ（对照） 样量 泳道 样品 5.0μL 9 3组pUC19/ Hind Ⅲ 样量 10.0μL 5.0μL 10 4组pUC19/ Hind Ⅲ 10.0μL 5.0μL 11 5组pUC19/ Hind Ⅲ 10.0μL 5.0μL 12 6组pUC19/ Hind Ⅲ 10.0μL 5.0μL 13 7组pUC19/ Hind Ⅲ 10.0μL 6 pUC19Hind Ⅲ（T） 5.0μL 14 8组pUC19/ Hind Ⅲ 10.0μL 7 1组pUC19/ Hind Ⅲ 10.0μL 15 9组pUC19/ Hind Ⅲ 10.0μL 8 2组pUC19/ Hind Ⅲ 10.0μL 16 10组pUC19/ Hind Ⅲ 10.0μL （商品）/ （商品）/ （7）开启电泳仪电源，选择合适的电压120V和时间40min； （8）将电泳槽电极与电泳仪连接。电泳槽红色电极为正极，与电泳仪正极相连。电泳槽黑色电极为负极，与电泳仪负极相连；

（9）启动电泳，待观察到负极有气泡升起方可离开；

（10）电泳结束，关闭电源，取出凝胶，在紫外灯下观察电泳条带。

4. 第二次材料准备

（1）每个500 ml三角瓶配制250ml 麦康凯培养基，共配制12瓶。（除第2大组多配两瓶，其余每个小组各配1瓶）：取13g麦康凯琼脂，重蒸水溶解、定容至250mL，高压除菌；

（2）包装14套培养皿，每套12个皿，高压除菌； （3）准备6盒无菌牙签与100ml 烧杯，中高压除菌； （4）准备12组无菌试管，每组4支，高压除菌； （5）将无菌Ep管塞满到500ml三角瓶中，高压除菌；

（6）把使用的枪尖盒装满、包好，做好“黄蓝”标记，高压除菌；

5.载体与外源DNA的连接反应

（1）分别在1.5ml离心管中按照表3表酶切反应体系按顺序各组分，其中3组和10组用的是自己提的pUC19质粒，其他组用商品化的pUC19质粒。每组都用自己提的λ DNA。

表3 连接反应体系

加样顺序 1 2 3 4 5 合计 成分 ddH2O 10×T4 Ligase Buffer pUC19/Hind Ⅲ λ DNA /Hind Ⅲ T4 DNA Ligase（350 U/μL） 体积（μL） 3.2 1.0 2.0（50ng） 3.0（135ng） 0.8 10.0 （2）每组样品混匀后，4000rpm离心1min，集液于管底。 （3）将样品至于16℃条件下过夜。

6. E. coli受体菌DH5α的准备

（1）倒LB平板，划线活化E.coli 受体菌DH5α；

（2）挑取单菌落至5mL LB液体中，37°C振荡培养过夜； （3）将过夜培养物按1%转接至新鲜20mL LB液体，37°C，220rpm培养2-2.5hr后，将菌液置于冰浴中。

7.平板制备

每组倾注12个麦康凯培养基平板，其中1组做不加氨苄的对照组，其他组都做加氨苄的实验组。

（1）将热的麦康凯培养基室温冷却至55-60°C左右；

（2）加入终浓度100μg/mL的Amp 250μl（1组不加）于培养基中； （3）无菌操作倒平板12个。

8.制备E. coli感受态细胞

（1）用搪瓷杯取满冰 （2）取2个1.5mL Ep管，分别加入1.5mL E.coliDH5α菌液，4℃离心机4000rpm, 5min离心，弃上清；

（3）利用Ep管中残留液体涡旋细胞；

（4）分别向2个Ep管中加入800μL预冷的0.1M CaCl2; （5）冰浴悬浮细胞；

（6）用4℃离心机4000rpm，5min离心，吸弃上清；

（7）分别向2个Ep管中加入100μL冷0.1M CaCl2，用枪尖轻轻吹悬细胞； （8）冰浴20 min;

（9）将其中一管的液体取50μL至一新的Ep管，做好标记“3”，剩下的残留50μL的管标记为“2”，没有分装的装有100μL感受态细胞的标记为“1”。此时感受态细胞制备完成（现用或者48小时内使用，4℃存放）。

9.连接产物转化E. coli感受态细胞

（1）按照表4的步骤由1到7进行实验。

表4连接产物转化E. coli感受态细胞步骤

步1→7 实验设组 骤1 感受态细胞（μL/管） 2 3 4 5 6 7 DNA（μL） 冰浴 热击 冰浴 复苏 培养基 涂布平板 50μL×2 Ⅰ-试验组样量 Ⅱ-转化对照 Ⅲ-细胞对照 1000 连接物5.0 向每个Ep50 pUC19 1.0（自提） 管中加入10min 90s 5min 0.9mL LB ，0.5～1 h 50 麦康凯+Amp 麦康凯+Amp 麦康凯+Amp 麦康凯 50μL×1 50μL×1 100μL×2 150μL×2 200μL×2 50μL×1 (2)平板正置于操作台上10分钟后，倒置于37℃温箱中培养16～20h。

10. 转化子的菌落PCR、平板复证及酸碱检测

（1）用马克笔将预留的麦康凯+Amp平板划线分区，用高压过的牙签挑取4个白色的单菌落在4个区域分别划线；

（2）将划线的麦康凯+Amp平板在37℃温箱倒置培养16～20h；

（3）取出4个Ep管，按照表6 PCR反应体系在冰浴中，依序向Ep管中加入如下成分，然后将刚刚划线的牙签在反应液中快速转动，使细菌在反应体系中充分混匀；

表520μL菌落PCR的反应体系 组分 ddH2O 加量（μL） 14.6

表9碱裂解法提取质粒pUC19 DNA的加样顺序 泳道 1 2 3 4 5 2组DNA样品 5μL 14 9组DNA样品 5μL 6 3组DNA样品 5μL 15 10组DNA样品 5μL 7 4组DNA样品 5μL 16 8 5组DNA样品 5μL 17 9 超螺旋marker 6μL DNA 1组超螺旋pUC19/样品/ pUC19 DNA样marker HindⅢ marker 品 样量 泳道 6μL 10 5μL 11 6组DNA样品（阳性对照） 5μL 5μL 12 7组DNA样品 5μL 5μL 13 8组DNA样品 5μL DNA 6组样品/ DNA样marker 品 样量 5μL pUC19 pUC19/ HindⅢ 5μL 5μL

图2 碱裂解法提取质粒pUC19 DNA的琼脂糖凝胶电泳

图1中泳道1和泳道3是λ/HindⅢmarker。用来指示pUC19质粒被Hind Ⅲ酶切后的条带位置，marker的条带由下至上分别为：125bp、564bp、2027bp、2322bp、4361bp、6557bp、9416bp和23130bp。而由于125bp和564bp片段太小并且marker的加样量不够，在图中没有明显的指示条带。有图1可见，线性PUC19所在位置在2322bp和4361bp之间，被检测的λ/HindⅢ marker是可用的。

图1中泳道4的样品是标准的pUC19，用于显示没有被酶切的pUC19质粒的位置，有两条带，一条超螺旋的，一条线性的，线性条带很浅，几乎看不见；泳道5是被HindⅢ酶切的标准pUC19质粒，用于指示被酶切后和没有被酶切的的pUC19质粒的位置，两条亮带分别是超螺旋和开环的PUC19,超螺旋的在下方，两条亮带之间有很弱的酶切后的线性的PUC19，由图可知，该质粒的酶切效果并不好；而泳道6是要检测的pUC19质粒被HindⅢ酶切后的电泳图像,此处的PUC19酶切完全，只有一条带。

泳道7（图1）到泳道16（图1）是各组所配pUC19被HindⅢ酶切后的产物条带。方框（图1）内的是酶切后的线性pUC19条带，方框下的条带是没有被酶切的超螺旋pUC19条带。无论是酶切完全的条带，还是没有被酶切的条带的位置

都相对于泳道5（图1）偏下，是因为我们之前所提pUC19质粒状态本身就不是很好（图2），因为碱变性法有缺陷：容易导致不可逆的变性，不适合大质粒的抽提。碱裂解法是很剧烈的方法，质粒在碱性条件下会变性，时间一长，这种变性就是不可逆的了,我们碱变性时间太长，导致质粒DNA的变性不可逆，所以实际条带位置和预估不一样。

泳道9（图1）和泳道16（图1）的被HindⅢ 酶切产物的条带较亮，是由于他们组之前提取的pUC19质粒在电泳时就存在较多的在预期位置的条带（图2泳道6和泳道15）。其他组酶切条带较弱的原因根所提取的pUC19质粒状态有关。

酶切反应的条带明亮程度（图1）和所提取的pUC19质粒（图2）的量的多少有关。大体来说，所提取的pUC19质粒（图2）的量越多，酶切反应的条带（图1）越量。但是也有特例，如：7组（图1泳道13和图2泳道12）的pUC19质粒提取量较多（图2泳道12），但是酶切时的条带很暗（图1泳道13），这说明他们组在加样或者是之前的步骤存在DNA的损失。

个别组在上样孔处存在较弱的DNA条带，是因为没有除尽的蛋白质把加样孔堵住了，导致少数DNA无法从加样孔跑到凝胶当中去。

个别组在加样孔下方都存在较窄的DNA条带，这种条带是大片段的染色体DNA杂质，DNA的分子量太大，电泳速率慢。

连续均匀很弱的长带是碱变性法提取质粒产生的染色体DNA碎片杂质。

（2）表显示的是重组质粒转化大肠杆菌之后在平板上的生长结果。

表5 转化实验结果

培养结果（单菌落平均数和菌落颜色） 有红色菌落和白色菌落，单菌落数为474 有红色菌落和白色菌落，单菌落数为884 Ⅰ-试验组 麦康凯+Amp 有红色菌落和白色菌落，单菌落数为1120 有红色菌落和白色菌落，单菌落数为1440 Ⅱ-转化对照 麦康凯+Amp 只有红色菌落 麦康凯+Amp 没有长菌 Ⅲ-细胞对照 只有白色菌落，并且菌落数远大于Ⅱ-转麦康凯 50μL×1 化对照的菌落数 未转化的受体菌（Ⅲ-细胞对照）不具有抗性，在含有氨苄的培养基上不生长。

转化了空载体的转化子（Ⅱ-转化对照）形成红色菌落。

未转化的受体菌（Ⅲ-细胞对照）在麦康凯培养基上长出白色菌落，并且菌

培养基 涂布平板 50μL×2 100μL×2 150μL×2 200μL×2 50μL×1 50μL×1 落数远大于Ⅱ-转化对照的菌落数，是因为转化效率不为百分之百。

在转化了连接产物的平板里，有红色菌落和白色菌落，红色菌落是转化的没有连接成功的载体，白色菌落是连接成功的载体。转入了重组质粒的转化子所占比例很少，约为6.6%（以50μL的涂布平板为例），说明重组效率低（重组效率=重组克隆数/总的克隆数=白色菌落数/（白色菌落数+红色菌落数））。

我们平板上的菌落密度大，说明我们的转化效率高，我们组的转化效率为

5

3.8×10（转化效率=单菌落数/载体DNA（μg），3.8×105=119×4÷（50×（5÷10）×（50÷1005）×10-3））。

红色菌落周围有雾状沉淀产生，而白色菌落周围有透明圈。

以Ⅲ-细胞对照中的不长菌落的培养基的颜色作为对照，没加Amp的培养基颜色变黄，长出大量红色菌落的培养基颜色变红。

（3）图3是菌落PCR的反应体系电泳图。

图3-1菌落PCR反应体系的琼脂糖凝胶电泳（1组至5组）

图3-2菌落PCR反应体系的琼脂糖凝胶电泳（6组至10组）

上样孔1（图3-1和图3-2）都是DL2000 marker,由上至下分别是2kb、1kb、750bp、500bp、250bp和100bp的条带。对PCR扩增片段大小起对照作用。在DL2000 marker的250bp和100bp的条带之间的PCR产物片段大小为125bp,在500bp和250bp的条带之间的PCR产物片段大小为564bp。

方框内（图3-1的上样孔2，3，16，17；图3-2的上样孔10，11）的是阳性对照和阴性对照（阳性对照在左侧，阴性对照在右侧），只有图3-2的阳性对照

和阴性对照是典型的。据推测，图3-2的阳性对照的片段大小为125bp的DNA片段。

图3-1的上样孔20有很宽的条带，由于量太大，不像是PCR扩增片段，很有可能是DNA杂质；或者是挑的菌落量过大。

图3-2的上样孔16和17有在500bp和750bp之间的片段，这种情况可能是由于众多125bp或是564bp或是125bp和564bp自连产生的；也有可能是DNA杂质。要通过进一步酶切对产物进行验证。

没有条带的上样孔中的样品有两种可能：①没有连入λDNA片段的空载体，也就是挑的单菌落是红色菌落；②重组质粒连入的λDNA片段大小大于2000bp,在PCR反应中没有被扩增出来。 我们组的上样孔为12，13，14，15（图3-2）。泳道13跑出了275bp的片段，泳道12，14和15没有跑出条带，可用于重组质粒的电泳检测。

(4)图4是重组质粒（rp）的琼脂糖凝胶电泳图

图4-1重组质粒（rp）的琼脂糖凝胶电泳（1至6组）

图4-2重组质粒（rp）的琼脂糖凝胶电泳（7至10组）

上样孔1、9、15（图4-1）和上样孔1和11（图4-2）是超螺旋marker（supercoiled DNA Ladder Marker）。上样孔2、10、16（图4-1）和上样孔2和12（图4-2）是PUC19。超螺旋marker由8种超螺旋的质粒DNA 构成，DNA大小分别为：2,087 bp、3,049 bp、3,997 bp、5,026 bp、6,133 bp、8,023 bp、10,085 bp、11,849 bp；用来指示重组质粒片段大小。PUC19空载体起对照作用，PUC19片段大小约为2.7kb,在泳道上跑出两条带，2,087 bp和3,049 bp之间的

条带是超螺旋的PUC19，5,026 bp处的条带是构象改变的（线性的）PUC19。

上样孔1和2没有条带可能是：①上样时样品并没有点进上样孔；②上样时样品弥散或是点样时间过长导致样品弥散。

正常情况来说，如果不考虑质粒的构象变化，除超螺旋marker外，其他泳道中的DNA只会跑出一条带。如考虑质粒的构象变化，泳道中的DNA会跑出三条带，由下往上依次是：超螺旋、线性和开环。大多数泳道的条带都在预期范围之内，但是泳道7、11、17（图4-1）和泳道4、7（图4-2）跑出了多条带，原因是他们在挑的单克隆不纯。

λDNA被HindⅢ没切成酶切出8个片段。片段长度分别为125bp、564bp、2027bp、2322bp、4361bp、6557bp、9416bp和23130bp。当插入到PUC19载体中时，其片段大小应当加上2.7kb,而23130bp的片段太大，并且23130bp片段末端和4361bp末端可以通过氢建相连形成粘性末端。所以很难与PUC19载体再连接。因此，在电泳时出现的重组质粒（rp）片段大小应的可能情况为2.8kb、3.26kb、4.7kb、5kb、7kb、9.3kb和12kb。实际连入片段大小还需通过酶切验证。

我们组的条带在上样孔5和6（图4-2），条带大小分别在2.8kb和3.26kb（插入片段大小分别为125bp和564bp）的位置，属于小片段。

连接产物的大片段有：图4-1的泳道7和17，图4-2的泳道4和7；中片段有：图4-1的泳道11，图4-2的泳道3、8和9；其余的都是小片段。依据不同的片段大小建立不同的没切反应体系。

有些目的片段的下方还存在很弱的条带（如图4-1的泳道2、3、4），这是因为碱变性法有缺陷：容易导致不可逆的变性，不适合大质粒的抽提。碱裂解法是很剧烈的方法，质粒在碱性条件下会变性，时间一长，这种变性就是不可逆的了,我们碱变性时间太长，导致质粒DNA的变性不可逆，所以实际条带位置和预估不一样。

（5）图5是酶切重组质粒的琼脂糖凝胶电泳图

图5-1 酶切重组质粒的琼脂糖凝胶电泳（大、中片段）

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