生物化学与分子生物学实验技术

生物化学与分子生物学实验技术

实验安全与实验基本操作

实验室常用试剂的使用安全

二甲苯

? 无色液体，有芳香气味，易挥发。用来制造、染料、塑料和药物。属低毒类，对皮

肤和黏膜有刺激作用，高浓度有麻醉作用。神经系统会受损害，还会使肾和肝受时性损伤。

? 眼睛接触：蒸气会刺激眼睛，液体导致严重刺激，发红肿胀和灼伤。通常影响是暂

时性的。皮肤接触：产生灼伤感、干燥。可以用微温的缓慢流水冲洗至少20分钟，用无摩擦性的肥皂有助于从皮肤上洗去二甲苯。

? 易燃，有爆炸危险。属于甲类防火危险物质。用二氧化碳或干粉或泡沫灭火剂，不

宜用水。

三氯甲烷

? 无色透明易挥发液体，有特殊的香甜气味。沸点：61.2℃，医药上用作麻醉剂。也

用作萃取剂和溶剂。

? 有很强的麻醉作用，在光的作用下，能被空气中的氧反应生成氯化氢和剧毒的光气。

通常加入1—2%乙醇，使生成的光气与乙醇作用而生成碳酸乙酯，以消除其毒性。

? 吸入高浓度蒸汽时，开始刺激眼、口腔、鼻孔粘摸，发生流泪、感觉麻醉、呕吐、

痉挛、直到昏睡、不省人事。

? 在空气、水分和光的作用下，酸度增加，因而对金属有强烈的腐蚀性 乙醚

? 透明、无色、易挥发有芳香刺激性气味的液体。沸点：34.6℃；对人体有麻醉性能。

当吸入含量为3.5%时，30~40分钟就可失去知觉。

? 人体过量吸入，会引起严重的急性中毒。呼气中带醚味，并出现呕吐、出汗、喷嚏、

咳嗽、头痛、记忆力减退、无力、兴奋。

? 微溶于水，易溶于盐酸，能与醇、醚、石油醚、苯、氯仿等有机溶剂混溶。应储存

于阴凉、干燥、通风的低温库房内，库温最好控制在25℃以下。远离热源、火种，避免阳光直射。

? 本品易燃。与强氧化剂反应能起火爆炸。在空气中与氧长期接触或受光照会生成不

稳定的过氧化物，受热能自行着火爆炸。着火时，可用干粉、泡沫、二氧化碳、沙土灭火。用水灭火无效，但可用水保持火场容器冷却。

乙醇

? 无色有酒味，易挥发的澄清液体。沸点78.5℃：用于溶剂、清洗剂、分析试剂等。

属微毒类，对眼睛黏膜有轻微刺激作用。

?

?

乙醇可使皮肤发干，长期受大剂量作用时，可使神经系统、消化器官等发生严重的器质性疾病。

易燃，手热或遇明火有燃烧爆炸危险，燃烧时，发出兰色火焰。蒸气能与空气形成爆炸性混合物，在火场中，受热的容器有爆炸的危险。着火时，用二氧化碳、雾状水、干粉、1211或抗泡沫灭火。用水冷却火场中的容器，驱散蒸气，赶出溢出液体，使其稀释成为不燃性混合物

冰醋酸

? 有酸性气味的无色透明液体，沸点：118.1℃。用于制造氯乙烯塑料、醋酐、有机醋

酸酯、醋酸盐（铅、铝、铜等）及醋酸纤维；也可用于染料、制药、罐头食品、食品防腐、色素生产等工业。

? 属低毒类，可经消化道、呼吸道、皮肤吸收，对眼、皮肤和上呼吸道有刺激作用。

眼睛接触：引起眼睑水肿、结膜充血；皮肤接触：轻者出现红斑，重者出现化学灼伤，有水泡和疼痛。

? 吸入：当空气中蒸气浓度不明时，应佩带有黄色色标滤毒盒（罐）的防毒面具。使

用时应有良好的通风条件和有效的防护用品，如有醋酸的泄露或溅污，应以碱液中和，然后用水冲洗，经稀释的污水排入废水系统。

注 意

? 实验过程中产生的废气、废液、废渣大多数是有害的，必须经过处理才能排放。少

量有毒气体可以通过排风设备排出室外，被空气稀释。毒气量大时，必须处理后再排出。如氧化氮、二氧化硫等酸性气体用碱液吸收。可燃性有机废液可于燃烧炉中通氧气完全燃烧。

? 大家在实验室里，接触到的化学试剂多半都有危害性，所以每个人都应该注意保

护自己，注意规范操作，同时对别人也是一种保护，而不能因为图省事或者别的什么原因而放松对安全的注意。

实验误差

绝对误差（absolute error）：

绝对误差是测量值与真实值之差。 δ= x?μ

(δ：绝对误差；x：测量值；μ：真实值） 绝对误差是以测量值的单位为单位，可以是正值，也可以是负值。测量值越接近真实值，绝对误差越小。

真实值是一个可以接近而不可达到的理论值。上式可以写成： μ= x-δ

说明在已知绝对误差值的情况下，真实值可以从测定值减去绝对误差而求得。 相对误差（relative error）：

为了反映误差在测量结果中所占的比例，分析工作中经常使用相对误差。相对误差是以真实值的大小为基础表示的误差值，没有单位。

δ/μ=(x-μ)/μ 通常以%，‰ 或 ppm表示。

例如：测定纯NaCl中Cl的百分含量为60.52%，而其真实含量（理论值）为60.66%。则

绝对误差=60.52%?60.66% = -0.14%

相对误差=[（60.52% ? 60.66%） / 60.66% ]×1000 ‰ = -2.3 ‰ 如果不知道真实值，而知道绝对误差值，则相对误差也可以表示为： 相对误差 = δ × 100%

x

例如：用分析天平称两个重量，一个是0.0021g，另一个是0.5432g，两个重量的绝对误差都是0.0001g，可是相对误差却大不相同，一个是（1/21 ）×100%，另一个是（1/5432 ）×100%。 可见，由于两个被测组分含量高低不同，即使绝对误差相同，相对误差也不同。对高含量组分测定的相对误差应当要求小些，低含量组分测定的相对误差要求允许大些。 例如：用重量法和滴定法测量样品主要成分，相对误差需要达到千分之一，而用比色法测定样品重微量成分时，相对误差只要求达到百分之几即可 2. 系统误差

系统误差（systematic error）也叫“可定误差”，是由某种确定的原因引起的，一般有固定的方向（正或负）和大小，重复测定时重复出现。根据系统误差的来源，可分为： （1） 方法误差

方法误差是由于不适当的实验设计或所选方法不恰当所引起的，通常影响较大。比如：滴定分析中终点与化学计量点不相符合、重量分析中沉淀的溶解度过大或有共沉淀等，都会产生误差。

（2） 仪器或试剂误差

是由于仪器未经校准或试剂不合规格引起的。例 如：天平砝码不准、容量仪器刻度不准或试剂不纯等，均能产生这种误差。 3） 操作误差

操作误差是由于分析者操作不符合要求引起的。 例如：分析者对滴定终点颜色改变的判断能力不够高，总是偏深或偏浅，便会产生误差。 由于系统误差是重复的以固定方向和大小出现，所以能用加校正值的方法加以消除，但不能用增加平行测定次数的方法消除。 3.随机误差（accidental error ):

也称偶然误差，是由于偶然的原因，如测量条件、实验室温度、湿度等变动而未能得到控制的条件波动引起的，其大小和正负都不固定。 偶然误差的出现看起来似乎没有规律，但多次测量就会发现绝对值相同的正负偶然误差出现的概率大致相等，它们之间能完全或部分抵消。因此通过增加平行测定次数，就可以减免测定结果中这种误差。也可以通过统计学方法估计出偶然误差值，并在测定结果中予以正确表达。

系统误差和偶然误差往往不能区分。比如：在观察滴定终点的颜色变化时，有人总是偏深，产生系统误差。但多次测定中偏深程度不一样，又必然有偶然误差。 5.提高分析准确度的方法 （1）选择恰当的分析方法

不同方法的准确度和灵敏度不同。重量分析法和容量分析法灵敏度虽然不高，但对常量组分的测定可以获得比较准确的结果，一般相对误差不超过千分之几。但对于微量和痕量组

分的分析，常常做不出来，谈不上精确度。 仪器分析法对测定常量组分无法准确，但对测定微量和痕量组分灵敏度很高，尽管相对误差较大，但绝对误差不大，能符合准确度的要求。

总之，必须根据分析对象，样品情况以及对分析结果的要求，选择恰当的分析方法。 （2）减小测量误差

为了保证分析结果的准确度，必须尽量减小各步的测量误差。

例如：一般分析天平的称量误差为+0.0001g，用减重法称量两次，可能引起的最大误差是+0.0002g，为了使称量的相对误差小于0.1%，取样量就不能小于0.2g。 （3）消除测量中的系统误差

A、校准仪器：对砝码、滴定管和移液管进行校准。

B、做对照实验：用含量已知的标准试样或纯物质当样品进行分析，由分析结果和其已知含量的差值，确定分析的误差。

C、做空白实验：在不加样品的情况下，以与样品相同的方法、步骤进行分析，把所得的结果作为空白值从样品分析结果中减去。这样可以消除由于试剂不纯或容器不符合要求所带进的误差。 8.有效数字

有效数字是指分析工作中实际测到的数字，允许最后一个数字是可疑数，反映测量值的准确度，要与测量的方法相适应。

一般分析数据保留4位有效数字，保留的位数太多无实际意义，反而增加计算的麻烦。要注意0.0052的有效数字只有2位，3个0是用于定位的无效数字。 修约有效数字的原则是四舍六入五成双。如23.455±0.546修约为23.46±0.55， 28.445±0.675修约为28.44±0.68，要避免出现0.00002±0.00001之类的数字，或3658.2543±0.0058之类的数字。

五、生物化学常用缓冲液 （一）基本概念

? Bronsted-Lowry酸碱理论（酸碱质子理论）:

1923年由丹麦化学家J.N.Brφnsted和英国化学家T.M.Lowry同时提出了酸碱质子学说，认为凡能释放质子的分子或离子（如：H2O，HCl，NH4+，HSO4- 等）称为酸，凡能接受质子的分子或离子（如：H2O，NH3，Cl-等）称为碱。因此，一种酸释放质子后即成为碱，称为该酸的共轭碱，同样一种碱与质子结合后，形成对应的酸，称为该碱的共轭酸。 如盐酸在水中的解离： HCl Cl- ＋H+ HCl是酸，Cl-是它的共轭碱。

pH = pKa+log{[质子受体]/[质子供体]} ? 缓冲体系的设计：

1960年，N.E.Good和他的同事们提出，适合生命科学研究使用的缓冲体系应具有以下特性：

① pKa值在6-8之间； ② 在水中的溶解度高； ③ 不易穿透生物膜； ④ 盐效应小；

⑤ 离子浓度、溶液组成和温度对解离的影响小； ⑥ 不与金属离子生成复合物或沉淀； ⑦ 该缓冲剂化学稳定；

⑧ 紫外和可见光波长范围内光吸收小； ⑨ 易制得高纯度的盐。 （二）生物化学常用缓冲液 ? 磷酸盐缓冲液：

磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级解离，有二个pKa值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽： NaH2PO4： pKa1＝2.12， pKa2＝7.21 Na2HPO4： pKa1＝7.21， pKa2＝12.32 配酸性缓冲液： 用NaH2PO4，pH＝1-4，

配中性缓冲液： 用混合的两种磷酸盐，pH＝6-8， 配碱性缓冲液： 用Na2HPO4，pH＝10-12。

用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。 磷酸盐缓冲液的优点为：

①容易配制成各种浓度的缓冲液； ②适用的pH范围宽； ③pH受温度的影响小；

④缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的变化小于0.1。 其缺点为：

①易与常见的钙Ca++离子、镁Mg++离子以及重金属离子缔合生成沉淀；

②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。 ? Tris（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液：

Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。 Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围，例如： Tris-HCl缓冲液： pH＝7.5-8.5 Tris-磷酸盐缓冲液： pH＝5.0-9.0 Tris-HCl缓冲液的优点是：

①因为Tris的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液；

②对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。 其缺点是：

①缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十倍，pH值的变化大于0.1； ②温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，例如：4℃时缓冲液的pH＝8.4，而37℃时的pH＝7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于0℃-4℃。

③易吸收空气中的CO2，所以配制的缓冲液要盖严密封。

④此缓冲液对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。

? 有机酸缓冲液：

这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成，pH范围为酸性，即pH＝3.0-6.0，最常用的是甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等。 有机酸缓冲液的缺点是：

①所有这些羧酸都是天然的代谢产物，因而对生化反应过程可能发生干扰作用；

②柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子（Fe3+、Zn++、Mg++等）结合而使缓冲液受到干扰；

③这类缓冲液易与Ca++离子结合，所以样品中有Ca++离子时，不能用这类缓冲液。 ? 硼酸盐缓冲液：

常用的有效pH范围是：pH＝8.5-10.0，因而它是碱性范围内最常用的缓冲液，其优点是配制方便，只使用一种试剂，缺点是能与很多代谢产物形成络合物，尤其是能与糖类的羟基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。 ? 氨基酸缓冲液：

此缓冲液使用的范围宽，可用于pH=2.0-11.0，例如最常用的有： 甘氨酸-HCl缓冲液：pH=2.0-5.0，

甘氨酸-NaOH缓冲液：pH=8.0-11.0， 甘氨酸-Tris缓冲液：pH=8.0-11.0，（广泛使用的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液），

组氨酸缓冲液：pH=5.5-6.5，

此类缓冲体系的优点是：为细胞组份和各种提取液提供更接近的天然环境。 其缺点是：

①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似，也会干扰某些生物化学反应过程，如代谢过程等。 ②试剂的价格较高。 六、 pH值的测定

测定溶液pH值通常有两种方法，最简便但较粗略的方法是用pH试纸，分为广泛和精密pH试纸两种。

广泛pH试纸的变色范围是pH=1-14、9-14等，只能粗略确定溶液的pH值。

精密pH试纸，可以较精确地测定溶液的pH值，其变色范围是2-3个pH单位，例如有pH=1.4-3.0、5.4-7.0、9.5-13.0等许多种，可根据待测溶液的酸、碱性选用某一范围的试纸。 测定的方法是将试纸条剪成小块，用镊子夹一小块试纸，用玻璃棒蘸少许溶液与试纸接触，试纸变色后与色阶板对照，估读出所测pH值。切不可将试纸直接放入溶液中，以免污染样品溶液。

紫外可见分光光度法 一、基本原理

（一）Beer-Lambert 定律

当一束单色光通过溶液时，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就会减弱。设入射光的强度为I0，透过浓度为c，液层厚度为b的溶液后，透射光的强度I必定小于I0，随浓度和厚度的增加，光被吸收的程度亦增加，透射光的强度则减小。透射光强度与入射光强度的比值，称为透光度(transmittance)，以T表示。实验证明，当液层厚度b和溶液浓度c按算术级数增加时，透光度T按几何级数减小，数学式为： A＝-lgT＝abc A：吸光度，又称光密度“O.D”； T：透光度， T＝I / I。；

a：吸光系数（L·mol－1·cm－1）；比例常数，称吸光系数 b：样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收池，则b=1cm； c：样品浓度（mol/L）。

吸光度与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，称为朗伯—比尔定律，简称比尔定律，即光的吸收定律。其数学表达式为：A=abc

吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性：

即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。

若溶液中各溶质的吸光系数ε相同，则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。

例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定 260nm的吸光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，已知其摩尔吸光系数 = 8.2×103 M-1cm，计算其摩尔浓度。 L）。

∵A＝εbC

∵A＝（溶剂加样品的吸光度）－（溶剂的吸光度） ∴A＝0.650－0.070＝0.580 ∵b＝1cm

∴C==7.1×10-5 mol / L 吸收池使用注意事项：

① 要彻底清洗，尤其是盛过蛋白质等溶液，干后形成一层膜，不易洗去，通常杯子不用时可放在 1％洗洁净液中浸泡，去污效果好，使用时用水冲洗干净，要求杯壁不挂水珠，还可以用绸布丝线或软塑料制作一个小刷子清洗杯子。

② 严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。

③ 严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。

三、分光光度法的定性与定量方法 （一）定性方法：

一系列不同波长的单色光照射待测溶液，可测的一系列相应的吸光度。以吸光度为纵坐标，以波长为横坐标作图，可以得到待测物质的吸收曲线。通过与标准品比较而定性。

（二）定量方法：

根据比尔定律，物质在一定波长处的吸光度与浓度之间有线性关系。因此，只要选择一定的波长测定溶液的吸光度，即可求出浓度。 1.吸光系数法（绝对法）：

根据比尔定律A= εc l ，若 l 和吸光系数ε或E1m已知，即可根据测得的A，求出被测物的浓度。

C = A / εl

通常ε或E1m可以在手册或文献中查到。 示例见课本P10. 2.标准曲线法:

在有些情况下，如单色光不纯等情况，测得的吸光值随所用仪器不同而有相当大的变化。若此时用吸光系数换算成浓度，将产生很大的误差。 但如果只用一台固定的仪器，则可认定在固定的工作状态和测定条件下，浓度与吸光度之间的关系在许多情况下是线性关系或接近于线性关系。 A=KC(K只为比例常数，而非物质常数）

依据上式的关系进行定量是分光光度法中比较简便易行的方法。 标准曲线的制作

（1）配置一系列浓度不同的标准溶液。

（2）在测定条件相同的情况下，分别测定其吸光度。

（3）以标准溶液浓度为横坐标（不必考虑显色剂等引起的浓度变化），以相应的吸光度为纵坐标，绘制A-C关系图。

（4）在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出浓度。

离心机的使用

1.使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。

2.离心前必须仔细检查转头各孔内有无异物。

3.若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。

4.装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。

5.离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。

6.每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。

7.离心时不准开盖，不准用手停止转头。

移液器的使用

设定移液体积

从大体积调节到小体积时，为正常调节方法，逆时针旋转刻度即可；

从小体积调节至大体积时，可先顺时针调至超过设定体积的刻度，再回调至设定体积，这样可以保证最佳的精确度。

装配移液器吸头

单道移液器，将移液端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可

用移液器反复撞击吸头来上紧的方法是不可取的，这样操作会导致移液器部件 因强烈撞击而松散，严重的情况会导致调节刻度的旋钮卡住。

多道移液器，将移液器的第一道对准第一个吸头，倾斜插入，前后稍许摇动上紧，吸头插入后略超过O型环即可。 养护：

1、如液体不小心进入活塞室应及时清除污染物；

2、移液器使用完毕后，把移液器量程调至最大值，且将移液器垂直放置在移液器架上； 3、根据使用频率所有的移液器应定期用肥皂水清洗或用 60 ％的异丙醇消毒，再用双 蒸水清洗并晾干；

4、避免放在温度较高处以防变形致漏液或不准； 5、发现问题及时找专业人员处理。

☆ 注意事项

1、当移液器吸嘴有液体时切勿将移液器水平或倒置放置，以防液体流入活塞室腐蚀移液器活塞；

2、正确使用移液器吸液、排液，以达高精准度。尤其注意排液的 2) 、 3) 操作； 3、平时检查是否漏液的方法：

吸液后在液体中停 1-3 秒观察吸头内液面是否下降；如果液面下降首先检查吸头是否有问题，如有问题更换吸头，更换吸头后液面仍下降说明活塞组件有问题，应找专业维修人员修理。

4、 需要高温消毒的移液器应首先

查阅所使用的移液器是否适合高温消毒后再行处理。

酪蛋白的制备

原理：等电点沉淀（选择性沉淀）利用蛋白质在等电点时溶解度最低的性质。 注意：

调节溶液到蛋白质等电点时，可以使蛋白质溶解度最低，但是并不意味着蛋白质会沉淀出来。

40℃水浴预热10分钟（HAC缓冲液同时预 热）用滴管加入HAC缓冲液约2ml（pH 4.8） 离心，3000转/分，15分钟

1、布朗运动加速蛋白分子的碰撞 2、等电点附近蛋白质的溶解度最低

用4ml蒸馏水洗涤离心，3000转/分，15分钟 除去沉淀中的可溶部分

95%乙醇洗涤离心，2500转/分，10分钟 除去沉淀中的脂类物

乙醚2ml洗涤离心，2500转/分，10分钟 脱水

0.1N NaOH 2ml溶解加水至10ml

酪蛋白是酸性蛋白质，溶解于碱性溶液中，方便下次双缩脲法测定

牛乳2ml

40℃水浴预热10分钟（HAC缓冲液同时预热）用滴管加入HAC缓冲液约2ml（pH4.8）

清液

沉淀

用4ml蒸馏水洗涤离心，

3000转/分，15分钟

清液

沉淀

95%乙醇洗涤离心，2500转/分，10分钟

清液

沉淀

乙醚2ml洗涤离心，2500转/分，10分钟

清液

沉淀

0.1NNaOH2ml

加水至10ml 待测

双缩脲法测定蛋白质浓度

一、实验目的

1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习蛋白质含量测定的原理和方法 3. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法 二、原理

一、分光光度法的基本原理及方法 （一）利用吸收光谱对物质进行定性分析 2．主要方法：

（1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长 蛋白质的最大吸收波长为280nm， 核酸的最大吸收波长为260nm （3）比较吸光度的比值

（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析 1．原理

Beer-Lambert（比尔）定律：

T=I/I0

A=lg1/T=lgI0/I

A=KCL

其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度

2．常用方法

（1）标准曲线法

? 标准曲线与样品的测定条件必须一致。 （2）标准管法

CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。

（3）摩尔吸光系数法

C=A/?（?为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为

摩尔吸光系数。 3.样品测试操作

① 打开电源开关，使仪器预热20分钟

② 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上 ③ 打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路 ④ 盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零

⑤ 取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比 ⑥ 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式(A) ⑦ 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中

⑧ 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖

⑨ 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A

⑩ 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数

实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。

肝脏DNA的粗提取

? 破碎细胞 ? 提取核蛋白

? DNA核蛋白和RNA核蛋白分离 ? 蛋白和核酸分离 原则

? 低温：抑制DNA酶的活性

? 操作柔和：防止DNA断链 DNA分离纯化的原理

? DNA或DNP在0.14MNaCl盐溶液中溶解度很低，而RNA则溶于0.14MNaCl盐溶液，利用这一性质可将生物组织中的DNA与RNA分开 ? DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取脱氧核糖核蛋白复合物-DNP后，必须将其中蛋白去除

? 其中蛋白质部分可用SDS使之变性除去（同时破坏核酸分解酶）。

? 进一步纯化则利用氯仿-异戊醇震荡除蛋白，震荡时，蛋白质变性，形成凝胶，并与DNA分开，DNA则留在水层中。

? 利用DNA不溶于乙醇，因而用乙醇将DNA 从溶液中沉淀出来。 离心机的使用 ? 平衡

? 对称放入，盖上盖 ? 设定转速、时间 ? 离心开始

? 完全停止后开盖

实验步骤

? 1、取新鲜猪肝4g，用0.14mol/L NaCl — 0.15mol/LEDTA溶液洗去血液，剪碎。加入10ml 0.14mol/L NaCl — 0.15mol/L EDTA溶液，置匀浆器中研磨。（初步破碎细胞）。（已做）

? 2、取一支5mlEP管，装入糊状物（基本装满），离心5min（10000rpm），弃去上清液

? 沉淀用0.14mol/l NaCl-0.15mol/l EDTA溶液洗三次。每次加入溶液后用吸管吹打均匀再离心（同上），直到上清液无血细胞。

? 弃上清液，所得沉淀为DNP（DNA蛋白复合物）粗制品

? 3、向上述沉淀物加入0.14mol/L NaCl — 0.15mol/L EDTA溶液5ml，分装于2支10mlEP管，然后每管滴加25%SDS溶液0.5mL，边加边振荡。加毕，置60℃水浴20min （不停振荡），直至溶液变得粘稠并略透明，取出冷却至室温。此步骤使核酸与蛋白质分离。

? 4、每管加入5 mol/l NaCl溶液1mL，蝴蝶形振荡5min。加入约1倍体积的氯仿—异戊醇混合液，蝴蝶形振荡10min，离心10min（4000rpm）。 ? 此步骤后溶液分三个相：上层水相（DNA）；中层变性蛋白质相；下层有机相和残余的RNA。

? 5、吸出上清液，弃去沉淀。向上清液中缓慢加入1.5—2倍体积的95%乙

醇，DNA沉淀析出，［离心（4000rpm）10分钟］ ? 用玻棒搅出的丝状物则为粗DNA

血糖的测定

原理

?无蛋白血滤液 葡萄糖 ?碱性铜试剂 Cu(OH) 2 ?磷钼酸试剂 磷钼酸

葡萄糖 ＋ Cu(OH)2 Cu2O↓ Cu2O ＋ 磷钼酸 钼蓝

钼蓝的蓝色深浅与葡萄糖的含量成正比,用比色法可测定血糖的含量 操作 ? 临床意义

（mg/dl） 正常 怀疑 糠尿病 空腹血糖 ＜110 110-139 ≥140

餐后两小时血糖 ＜140 140-199 ≥200

服糖后两小时糖 ＜140 140-199 ≥200

1、 无蛋白血滤液的制备：取干试管一支，准确加入蒸馏水3.5ml，血液0.1ml，2/3NH2＝SO40.2ml，10％Na2WO4 0.2ml，混匀，待有澄清液出现后，过滤，收集滤液备用 编号 标准管 测定管 — 空白管 — 标准葡萄糖2.0 液 （1.0ml = 0.025mg） 无蛋白滤液— （ml） 蒸馏水（ml） — 2.0 — — 2.0 碱性铜试剂2.0 （ml）

2.0 2.0 充分摇匀，置沸水浴准确煮沸8分钟，取出切勿摇动，置于冷水浴冷却

磷钼酸试剂2.0 （ml） 混匀，放置3分钟 2.0 2.0 蒸馏水（ml） 3.0 3.0 3.0 ?将各试管摇匀后，用红色滤光片或620nm，以空白管校零点，比色。

课后思考题

?Folin-吴法测定血糖的优缺点是什么？

?进行比色法测定时，如果测得样品的A值超过100%，该如何处理，为什么？

质粒DNA的提取

实验目的

?掌握：质粒DNA提取的原理和方法； ?熟悉：碱裂法提取质粒的基本操作步骤； ?了解：质粒小抽提取试剂盒的组成和实验 原理。 实验原理

?在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，共价闭环质粒DNA虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。

?将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，质粒DNA迅速复性，仍然为可溶状态。

?通过离心，可去除大部分细胞碎片染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA

尚在上清中，分离上清，用两倍体积乙醇沉淀质粒DNA。

实验步骤

加5mL培养物于10 mL EP管，12000 r/min×2min

除去上清，加入100 μL 溶液I，中悬浮细菌沉淀，并转入1.5 mL EP管中。

加入200μL 溶液II，快速颠倒数次，冰浴2 min

加入150μL 溶液III，温和振荡10s，冰浴5min，12000 r/min×5min

转移上清到新EP管，加入等体积酚/氯仿 /异戊醇，温和振荡，抽提2次，12000r/min×2min

上层水相转移到新EP管，加入2倍体积无水冰乙醇（-20 ℃ 冰箱中放置） ，颠倒混匀，12000r/min?10 min

弃上清，沉淀中加1 mL70%乙醇，12000g×2min

去上清，沉淀物于37 ℃恒温箱中干燥至透明状，后于 - 20 ℃保存、待用。

主要试剂及作用

溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成 (保护、缓冲) ① 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度（悬浮细胞）

② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对质粒分子的降解作用（保护作用）

③ Tris-HCl 使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用） 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) ① SDS：？

② NaOH（pH>12）：破坏细胞膜，裂解细胞

溶液III：HAc和 KAc组成的高盐溶液 (复性，分离)

① HAc溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。

② KAc会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。 实验结果及讨论

?。

PCR技术

聚合酶链式反应（PCR）概述

（一）概念

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaciton, PCR)，即PCR技术，是近年来发展起来的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。 二、PCR反应的原理和步骤

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的片段富集106～109倍。所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。

PCR反应体系的主要成分和作用

? DNA聚合酶 ? 模板 ? 引物 ? dNTP ? 缓冲体系 （一）DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶来源于嗜热水生菌的重组体，与一般的聚合酶所不同的是在高温状态仍具有活性。 可分为两大类：

1、具有校正功能的（有3’→5’核酸酶活性） 比如：Vent,pfu,pwo等

2、不具有校正功能的 （无3’ →5’核酸酶活性） 比如：一般的Taq DNA聚合酶

（二）模板

核酸模板的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

（三）引物

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

*(六）PCR反应标准体系

五、PCR的反应条件控制

（一）PCR反应的温度和时间控制 1、变性温度与时间

变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 2、退火(复性)温度与时间

退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 3、延伸温度与时间：

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。

PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

（二） PCR反应的循环次数控制

循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

六、PCR反应的特点

1、特异性强

PCR反应的特异性决定因素为引物与模板DNA特异正确的结合、碱基配对原则、TqDNA聚合酶合成反应的正确度、靶基因的特异性与保守性。 2、灵敏度高

PCR产物的生成量是以指数方式增加的。 3、简便快速

PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性、退火、延伸反应，一般在2～4h完成扩增反应。

4、对标本的纯度要求低

不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总DNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。

琼脂糖凝胶电泳的原理和方法

琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下：

(1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。

(2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳 小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。

(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。

(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。

琼脂糖凝胶电泳的缺点：

(1) 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 (2) 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。

(3) 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。

(4) 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。

目前，琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。

琼脂糖也可用作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1μg蛋白质就可检出。 三、DNA的琼脂糖凝胶电泳 在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。

但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 2)琼脂糖的浓度：

不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离,如下表所示:

2. 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系

不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA(covalently closed circular，简称cccDNA)＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA(一般为球形)不能进入胶中，相对迁移率为0(Rm=O)，而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以 长轴方向前进(Rm＞O)，由此可见，这3种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。

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