引进荧光定量PCR法在巨细胞病毒感染中的临床应用

项目名称：引进荧光定量PCR法在巨细胞病毒感染中的临床应用

负责人：

技术内容综述：人巨细胞病毒是危害人体健康的最严重的病毒之一，通过人与人直接接触传播。感染的临床表现呈现多样性，诊断必须结合实验检查。有效的预防和降低CMV疾病的发生，降低感染者的死亡率，关键是运用早期、快速、准确的检测方法，本技术应用荧光定量PCR检测患者血液、体液及母亲乳汁中的HCMV-DNA，并与血HCMV-IgM抗体检测做比较，探究FQ-PCR在小儿HCMV感染诊断治疗中的应用价值。结果：在怀疑为活动性CMV感染的169例患者中，PCR法的阳性检出率为75.1%，血清IgM法为52.1%，两种方法阳性率为86.4%；18例尿液CMV-DNA阳性的患者查出母亲乳汁中CMV-DNA，含量为1.7X10~4.5X103copies/mL。综上所述PCR可以准确的检测患者体液及血液中的CMV含量，提示体内复制情况，对于临床诊断和治疗有决定性的指导意义。

与当前国内外同类技术综合比较，有何先进性：目前对HCMV感染的实验室诊断的方法主要有血清学检测、病毒分离、抗原及DNA检测，但上述方法在快速、准确诊断HCMV感染，指导临床治疗方面存在一定的局限性。IgM是抗原刺激机体后最早出现的抗体，半衰期较短，它在体内持续时期一般不超过4个月，从患者血清中检出CMV-IgM抗体，表明患者最近发生了原发性CMV感染或者活动性CMV感染，病毒在体内复制。所以IgM检测是判断HCMV感染的一个重要依据，但是其具有灵敏性和特异性不高的特点。新生儿产生IgM能力弱，血清中CMV-IgM敏感性较低。随着荧光定量PCR法新技术的引进及发展，巨细胞病毒感染的检测手段日新月异，FQ-PCR已经成为检测活动性CMV感染和指导临床用药的重要方法，FQ-PCR可以拷贝数量直观了解CMV感染程度，从

分子水平上检测CMV感染情况及抗病毒效果，且病毒具有噬上皮细胞特性，使其易于感染在肾脏细胞内，随尿排出，因此可以从尿液中检测出CMV-DNA含量，说明体内CMV病毒感染情况。由此证明，FQ-PCR在巨细胞病毒感染的早起诊断及治疗中，具有领先及超越现有技术的优越性。

采用的新技术、新方法的科学依据和解决的关键技术问题：PCR的基本过程类似于DNA的天然复制，特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR基于荧光共振能量转移原理。当一个荧光基团与一个荧光淬灭基团的距离邻近至一定范围时，就会发生荧光能量转移，淬灭基团会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不出荧光。但是如果荧光基团一旦与淬灭基团分开，淬灭作用即消失。因此，可以利用FRET，选择合适的荧光基团和淬灭基团对核酸探针或引物进行标记，再利用核酸杂交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合或分开的原理，建立各种实时荧光PCR方法。

荧光定量PCR技术解决了现有技术无法解决的缺陷，其在实验测定中具有：①高特异性：首先是引物的特异性，引物延伸时，碱基配对的正确性，Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性以及靶基因的特异性与保守性。②高灵敏度：PCR扩增产物的量以指数方式增加，其能在2~3小时内，将一个分子靶DNA，扩增至10亿个分子。也就是说，只要反应管中有一个分子，就能将其扩增至能检出的水平。如将一些干扰因素考虑在内，一个反应体系中，如有2~3以上靶分子，即可成功地通过PCR扩增，将其检测出来。③简便快捷。④可使用特定的低纯度标本。

社会效益：①优生优育：孕妇在孕期中感染HCMV，容易导致胎儿畸形。对于HCMV特异性抗体IgM检测阳性，和（或）特异IgG滴度升高4倍，或特异的低亲和力IgG抗体阳性时，需要采取孕妇羊水进行HCMV的PCR检测，已明

确是否有现症感染，从而进一步采取相应的对策提供准确的依据。②器官移植、免疫缺陷患者、抗肿瘤治疗中HCMV感染的监测：器官移植后因为免疫抑制的使用，免疫缺陷患者和恶性肿瘤患者抗肿瘤治疗造成免疫系统的损伤，一旦感染在平时不会有太大问题的HCMV，则可能出现严重的后果，导致治疗失败，甚至患者死亡。采用PCR方法，对这些患者进行HCMV感染的监测，有助于临床相应治疗措施的及时采取，避免严重后果的发生。③抗病毒治疗的药物疗效的监测。④早期诊断：采用高灵敏高特异的实时荧光PCR方法检测HCMV,有助于HCMV感染的早起诊断。⑤鉴别诊断：可用于与其他病原体所致疾病如病毒性肝炎等的鉴别诊断。⑥病因学研究：可用于死胎、畸胎、流产、低体重儿、婴儿肝炎综合征的病因学研究 。⑦CMV与肿瘤的关系研究⑧新生儿及小儿病毒感染临床诊断：巨细胞病毒感染是我国小儿中最常见的感染性疾病，其感染情况在临床上表现多样化，可以引起溶血性黄疸，肝炎，各种畸形和视听神经的损害，肺炎等，免疫力底下的患儿甚至可以引起多脏器的损害。因此，随着HCMV感染并给予抗病毒治疗是减轻症状、减低患儿的死亡率的关键。 对专业或学科的影响与论文发表情况：

自20世纪70年代初从PCR技术的早起设想，发展至今PCR经历了漫长的过程，直到近些年PCR日益壮大，涉及了各个领域，在PCR基本要素的基础上的技术革新不断出现，让极少量嵌入的或者遮蔽的遗传物质都能被扩增产生大量一般实验室都能得到的、用于鉴定和分析的材料。自从近年引进我国后，更是进入了一个PCR“爆炸”的年代，在医疗领域占有了重要的不可替代的低位。 王岩 荧光定量PCR法在检测246例小儿巨细胞病毒感染中的应用.黑龙江医药杂志，2010，33（6）

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