DNA的粗提取与鉴定

DNA的粗提取与鉴定（选修）

一、实验原理

1．DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl溶液浓度的变化而改变的。当NaCl物质的量浓度为0.14mol / L时，DNA的溶解度最低。

2．DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的其他许多物质则可以溶于酒精溶液。 3．DNA遇二苯胺会染成蓝色（遇甲基绿溶液被染成蓝绿色）。 4．鸟类红细胞有细胞核，核内DNA与蛋白质结合成染色质。

二、实验步骤

实验步骤 制备鸡血细胞液 （由教师完成） 1．提取鸡血细胞细胞核物质 操作方法 实验原理 取质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶液100mL，柠檬酸钠能防止血液与新鲜的鸡血混合并搅拌，然后在冰箱内静置一凝固，静置使血细胞天，除去上清液，即得鸡血细胞液 与血浆分离 取20mL蒸馏水与约5－10 mL的鸡血细胞液混合并沿一个方向快速充分搅拌，然后用单层纱布过滤，取滤液于烧杯中 取质量浓度为2mol/L的NaCl溶液40mL与上述滤液混合后，沿一个方向轻轻搅拌，核中DNA溶解，染色质中的DNA与蛋白质分离 沿烧杯内壁慢慢加入蒸馏水并沿一个方向轻轻搅拌，至白色丝状粘稠物不再增加时停止加水 用多层纱布过滤，取纱布上的粘稠物 使细胞过度吸水而破裂 DNA在高浓度NaCl溶液中溶解度大 DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的降低而降低，蛋白质相反 2．溶解DNA 3．析出含DNA的粘稠物 4．滤取含DNA的粘稠物 用镊子夹取纱布上的粘稠物放入20mL质量浓度5．DNA的再溶解 为2mol/L NaCl溶液中，沿一个方向搅拌至完全溶解 6．再过滤 7．提取较纯净的DNA 用两层纱布过滤，取其滤液放入小烧杯中 同2 取体积分数为95％的、冷却的酒精（约为滤液的DNA不溶于酒精而形1.5－2倍）与滤液混合，沿一个方向缓慢搅拌，成沉淀 待出现丝状物时用玻璃棒将其卷起 取两只试管：1号：0.015mol/L NaCl 5mL＋4mL 二苯胺；2号：0.015mol/L NaCl 5mL＋丝状物＋DNA遇二苯胺会染成4mL二苯胺。沸水浴5min；观察比较其溶液颜色蓝色 变化 8．鉴定DNA 三、实验成功的关键及注意事项

1．血细胞加水以后，必须充分搅拌，不应少于5min。否则，血细胞核不会充分破碎，释放出的DNA就会减少，过滤时采用单层纱布。

2．当NaCl溶液加入到血细胞滤液中后，必须充分晃动烧杯，使二者混合均匀，这可以加速核蛋白解聚，游离出DNA，并使DNA充分溶解于NaCl溶液中。

3．析出DNA的步骤中必须充分加水，才能稀释NaCl溶液，使DNA溶解度变小，蛋白质溶解度增大，二者分离。同时应用玻璃棒不停地缓慢搅动，使DNA聚集（玻璃棒有吸附DNA的作用）。如果在此步骤中，4．在析出的DNA充分溶解。

5．用冷酒精浓缩和沉淀少5℃以下)中至少存放的NaCl溶液加入2份冷的酒精中。酒精处理后，悬浮于溶液中的丝状物较少，可将混合液放入冰箱中再冷却几分钟，然后再用玻璃棒卷起丝状物。

6．在进行步骤3、向，以便获得较完整的手缓慢转动5～10 min。7．盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的易被玻璃容器吸附，由于细胞内提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程中DNA的损失。整个实验共有“三次过滤，两次析出，六次搅拌”：三次过滤：第1、3使用纱布为多层。

六次搅拌：除最后一次搅拌外，前余各步搅拌都要不停地轻轻搅拌。两次使用蒸馏水：步骤步骤3是为了稀释NaCl（另一次析出是在步骤三次加入NaCl溶液：在步骤物质的量的浓度为0.015 mol/LDNA时，所用的】之后才能使用。二者的体积比为卷起。进行步骤DNA

是为了得到浓度低于血细胞内部浓度的溶液，2、5，目的都是为了溶解再增加过滤，则可得较粘稠的线状物NaCl溶液之后，必须充分搅拌，使95％酒精，必须经过充分预冷【在冰箱DNA丝状物的方法是缓慢旋转玻璃棒。,而且搅拌要轻缓，并沿同一个方7时，要将玻璃棒插入烧杯中溶液的中间，用

1～2层，次搅拌均朝向一个方向，且第一次快速搅拌，其溶解度的最低点0.14 mol/L％的酒精，也叫DNADNA。

1∶2，即将2次要用其滤出的粘稠物，使血细胞胀破；，从而使

，在步骤DNA）。

DNA(至份含DNA如果用冷DNA，容,DNA析出8中加入的（含再溶解步骤中，加入浓24 h15时，玻璃棒不要直插烧杯底部DNA分子

的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分

次要用其滤液，使用纱布为第51溶液使其达到DNA7，加入冷却的95的凝集。）中加入的量的浓度为2 mol/L实验原理的补充介绍

1.DNA的释放 DNA位于鸡血细胞的细胞核中，正常情况下不会释放出来。为了使DNA从细胞核中释放出来，实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法。蒸馏水对于鸡血细胞来说，是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞破裂。同时，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜都破裂)，于是释放出DNA，当然也有RNA。但是，释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起。

2.将DNA与蛋白质分离 根据二者的特性，即在浓度较高的氯化钠溶液(物质的量浓度为2 moL/L )中，核蛋白容易解聚，游离出DNA。而结合成DNA钠盐。这时DNA在溶液中呈溶解状态。3.DNA的析出与获取 利用DNA的氯化钠溶液中加入大量(300 mL )增高(这就是蛋白质的盐溶现象)，从而使二者分离。这时，加上不停地搅拌，溶解度下降的丝状物。再通过过滤，滤去蛋白质，的旋转频率，离心15 min ，除去上清液4.DNA的再溶解 再用较高浓度的氯化钠溶液去溶解5.DNA的沉淀和浓缩 除去了蛋白质的核酸溶液，淀法。就是将含有Na+

的DNA溶液，加入到相当于其两倍体积的体积分数为可以使DNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的将此混合液再放入冰箱中冷却几分。浓缩后的棒有吸附DNA的作用)。

6.DNA的鉴定 本实验中鉴定是：DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成呈浅蓝色)。

紫外灯照射法用蒸馏水配制质量分数为到蜡纸上，再滴1滴EB溶液染色。将蜡纸放在紫外灯的紫外吸收高峰在260 nm处)。

电泳法此方法适合鉴定纯度较高的鉴定时溶液蓝色的深浅与溶液中实验成果评价

（一）是否提取出了DNA

观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的在浓度较高的氯化钠溶液中的溶解度很高，

DNADNA的黏稠物了。如果采用离心法则更好，(含有蛋白质)，留下的沉淀物中含DNA黏稠物。必须再进一步沉淀和浓缩。DNA丝状物，悬浮于溶液中。如果出现的丝状物较少，可以DNA丝状物，可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起(配方见下述的“药品配制”)。ω-羟基-γ酮基戊醛,它再和二苯胺作用而显现蓝色0.05%的溴化乙锭(EB)溶液，(260 nm)下照射(暗室中DNA。

DNA含量的多少有关。DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制

Na+

与带负电的向含有DNA的浓度较高DNA用4 DNA。

最常用的方法是酒精沉冷酒精溶液中，混匀以后二苯胺法的原理)，可呈现橙红色的萤光DNAr/min (溶液(DNADNA在浓度较低的氯化钠溶液中溶解度小的原理，蒸馏水，稀释氯化钠溶液，使的溶解度下降，而蛋白质的溶解度逐渐呈就可以获取000

95%(因为玻璃DNA的方法为二苯胺法将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹

备。

（二）分析DNA中的杂质

本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。 （三）不同实验方法的比较

对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。

提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。

四、练习

（一）选择题

1．制备鸡血细胞液时加入的抗凝剂是 A.NaCl B.柠檬酸钠 C.蒸馏水 D.酒精

2．在提取的细胞核物质的溶液中加入2 mol / L的氯化钠溶液40mL的目的是 A.溶解杂质 B.溶解蛋白质 C.析出DNA D.溶解DNA 3．NaCl的物质的量浓度为多少时，DNA的溶解度最低 A.0.12 mol / L B.0.13 mol / L C.0.14 mol / L D.0.15 mol / L 4．DNA不溶解于

A.NaCl溶液 B.KCl溶液 C.C2H5OH D.MgCl2溶液 5．鉴定DNA的试剂是

A.斐林试剂 B.苏丹Ⅲ染液 C.双缩脲试剂 D.二苯胺试剂 6．在向溶解DNA的氯化钠溶液中，不断加入蒸馏水的目的是 A.加速溶解DNA的速度 B.加速溶解杂质的速度

C.减少DNA的溶解度，加快DNA析出 D.减少杂质的溶解度，加快杂质的析出 7．DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成 A.砖红色 B.红色 C.紫色 D.蓝色 8．从细胞核中提取DNA所用的提取液是 A.氯化钠溶液 B.酒精 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠 9．提取含杂质较少的DNA所用的溶液是

A.氯化钠溶液 B.冷却的酒精的体积分数为90％的溶液

C.加热的酒精的体积分数为95％的溶液 D.冷却的酒精的体积分数为95％的溶液 10．DNA的直径约为 A.20×10

＿20

＿10

＿20

＿10

m B. 20×10 m C. 20×20 m D. 20×20 m

11．本实验中有三次过滤：

（1）过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液 （2）过滤含粘稠物的0.14 mol / L NaCl （3）过滤溶解有DNA的2 mol / L NaCl 以上三次过滤分别为了获得

A.含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液 B.含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA的滤液 C.含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、纱布中的DNA D.含较纯的DNA滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液 12．与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是 A.操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度

B.在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整 C.加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出 D.当丝状粘稠物不再增加时，此时的NaCl浓度相当于0.14 mol / L 选择题答案：BDCCD CCCDB AC

（二）非选择题

1．粗提取DNA的原理是_________________________________________________，纯化粗提取DNA的原理是_________________________________________。

DNA在氯化钠溶液中的溶解度，随着氯化钠的浓度的变化而改变 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液

2．填写本实验中完成下列实验操作所用试剂。

（1）提取鸡血细胞液中核物质：___________________________； （2）溶解核内DNA：_________________________；

（3）析出2 mol / L NaCl的DNA：___________________________； （4）DNA粘稠物的再溶解：__________________________；

（5）提取杂质较少的DNA白色乳状丝状物：__________________________。 （1）蒸馏水 （2）2 mol / L NaCl （3）蒸馏水 （4）2 mol / L NaCl （5）冷却的95％酒精

3．说明不同浓度NaCl在本实验中的作用。

2 mol / L NaCl溶液：___________________________；

0.14 mol / L NaCl溶液：___________________________； 0.015 mol / L NaCl溶液：___________________________。

溶解含DNA的核物质、析出含DNA的丝状粘稠物 析出DNA分子 溶解DNA 4．将制备好的鸡血细胞液5～10mL，注入到50mL烧杯中，向烧杯中加入20mL蒸馏水的目的是__________________________________。

加速血细胞破裂

5．提取鸡血中的DNA时，除去血液中的上清液的目的是_______________________。 上清液是血浆，不含血细胞

6．步骤1加入蒸馏水的目的是_____________________________________，步骤3加入蒸馏水的目的是_____________________________________。

加速血细胞的破裂 析出含DNA的粘稠物

7．DNA的直径约为2nm，实验中出现的丝状物的粗细是否表示一个DNA分子直径的大小？ 。

实验中出现的丝状物是肉眼可以观察到的，这种丝状物的直径要比DNA分子的直径大许多倍，所以实验中出现的丝状物的粗细并不表示一个DNA分子直径的大小。

8．本实验做“DNA的鉴定”时，做如下实验操作： 操作内 试管 容 序号1 2 3 4 实验现象 实验结论

（1）完成表格中空白处的实验内容。

（2）对A试管，完成1、2、3的操作后，溶液颜色如何？________________________。 （3）B试管在实验中作用是________________________________。

（4）A试管中溶液颜色变化的程度主要与____________________________有关。 （1）

实验现象 溶液逐渐变蓝色 溶液不变蓝色 A 0.015 mol / L NaCl 5mL 加丝状物并搅拌 4 mL二苯胺，混匀 沸水浴5 min B 0.015 mol / L NaCl 5mL 4 mL二苯胺，混匀 沸水浴5 min 实验结论

丝状物主要成分是DNA （2）溶液颜色基本无变化（不呈浅蓝色） （3）对照实验 （4）加入试管中（丝状物中）DNA的多少

9．分析下面两个实验记录报告：

（1）经分析，衣藻细胞内DNA含量（％）：染色体为84.0，叶绿体为14.0，线粒体为0.3－1.0，其他为0.9－1.0。

（2）经分析，豌豆染色体的组成（％）等6.0。

请回答：实验（的组成成分主要是染色体

：DNA36.5，RNA9.6，蛋白质1）说明DNA主要分布在 ；实验（ 。

DNA和蛋白质 47.9，夹脂和钙2）说明染色体

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