microRNA研究进展及其在动物分子育种中的应用 - 图文
更新时间:2023-12-05 13:11:01 阅读量: 教育文库 文档下载
microRNA研究进展及其在动物分子育种中的应用
在整个基因组中,编码蛋白的基因通常只占到2%左右,绝大多数的基因是不直接编码蛋白质的,但是参与生命活动的DNA 都被转录成RNA,还有大量的非编码RNA 的信息没有被揭开“面纱”。RNA 转录组学中microRNA 的研究,从首个microRNA: lin-4 的发现,到大规模microRNA 转录组的测定,再到目前microRNA 通过基因沉默方式调节靶基因表达的机制研究,一共经了三个阶段,尤其是大规模转录组测序后,大量的microRNA 被发现,与之相关的功能性研究正如火如荼的展开。多年来一直被认为是基因组中垃圾成分的非编码RNA 终于越来越得到人们的重视。研究发现,microRNA 对基因表达和生长发育起到了重要的调节功能。近年来,microRNA 参与动物表型调控的报道相继出现。2009 年,发现了果蝇的miR-8 基因在调节果蝇体型方面有重要作用,对miR-8 进行敲除实验发现果蝇体型明显变小,这说明microRNA 通过改变mRNA 的翻译水平能够显著的影响动物的表型。
1 microRNA 简介 1.1 microRNA 的发现
早在1993 年,Lee 等利用遗传分析方法发现了第一个microRNA: lin-4,它是线虫中的一个长度为22 nt的小分子非编码RNA。这种单链通过碱基配对的方式结合到靶mRNAlin-14 的3'末端非翻译区( 3'-untranslational region,3 ' UTR) ,从而抑制lin-14 的翻译,但并不影响其转录。7 年以后,另一个促进线虫幼虫向成虫转变的基因let-7被发现,它的转录产物是长度为21nt 的RNA 分子,作用方式与lin-14 相似,结合在lin-47和lin-57 的3'UTR 来抑制基因的翻译。到目前为止,已经在模式生物中发现了大量miRNA,当然
miRNA的数量远远不止这些,还有更多的miRNA尚未发现。 1.2 microRNA 的产生过程
microRNA( miRNA,miR) 是由约21 ~ 25 个核苷酸组成的分子,通过抑制mRNA 的翻译或者促进其降解而起到负性调控的作用。目前动物细胞中的miRNA多是短序列的非编码蛋白质RNA,不仅在基因位置上保守,并且还具有很高的序列保守性。动物miRNA成熟需要经历两个过程: 在前期长度大约为300 ~ 1 000个碱基的pri-microRNA( miRNA复合体) 先被加工成具有发夹结构的约70 ~ 90 个碱基大小的单链RNA前体
( pre-miRNA) ,然后pre-miRNA在Dicer 酶、ATP 和解旋酶的共同作用下分裂成21 ~ 25bp 的成熟miRNA。 1.3 microRNA的特点
①一般为22nt左右,其3′端允许有1~2nt长度的变化,如存在于拟南芥中26nt的一类RNA也属于miRNA;
②广泛存在于几乎所有的真核生物中,本身不具备开放阅读框(open read frame ORF),不能够编码蛋白质;
③成熟的miRNA5′端为单一磷酸基团,3′端为羟基,它们可以通过不完全互补配对与上游或下游的序列形成茎环结构;
④miRNA基因不是随机排列的,其中一些基因成簇排列且常常协同表达; ⑤miRNA具有保守性,鼠和人类中已知的miRNA有
53%与红鳍东方鲀(河豚)或斑马鱼同源,约12%的miRNA在线虫、果蝇和植物中表现出保守性;
⑥大多数miRNA的表达具有特异性和时序性,在不同的组织中miRNA的表达水平和类型不同,随着机体发育阶段的不同miRNA的表达也发生变化。如miR-3~miR-7在果蝇早期胚胎形成时特异表达,但在其他阶段未检测到表达;miR-212、miR-21和miR-22在幼虫阶
段表达量升高,并在成虫阶段维持较高水平。 1.4 microRNA 的生物学功能
成熟的miRNA通过与靶基因的特异结合调控基因的表达,这种调控作用机制有两种: ①在形成成熟的miRNA后,其结合到靶基因的3'UTRs( 3'端非翻译区) 来抑制靶基因的翻译过程,从而起到调控的作用。
②它能够像siRNA一样通过碱基互补配对结合到靶基因上,降解掉靶基因序列,以此来对靶基因进行调节。但在哺乳动物中,细胞内还没有发现内源siRNA,外源siRNA所介导的RNAi的抑制作用是一种抵御机制,而miRNAs恰恰在哺乳动物细胞内扮演了siRNA的角色。miRNA与siRNA不仅功能相似,并且从二者的加工过程来看,在前体的加工过程中都依赖相同的Dicer 酶参与。这两种小分子从序列上到它们发挥作用的机制上都存在一定的相似
性,很难从本质上区分。所以,如何在实验中正确区分和鉴别siRNA和miRNA,这还需要进一步的研究。
miRNA作为一种特殊的表观遗传学修饰,成为当下研究的热点与重点。很多研究表明,miRNA参与了生物体的生长增殖、细胞周期进程、凋亡和衰老等生物学过程,并与多种疾病的发生紧密相关。成熟的miRNA能在细胞核和细胞质间穿梭,可直接作用于核内基因。该过程主要由输出蛋白1 调控。研究表明,miR-29b含有六核苷酸元素而能指导其核运输,证明miR-29b主要定位在细胞核。几个miRNA通过结合在一些特异基因的启动子区调控核内基因表达。这些研究说明miRNA能在细胞核内行使功能。一些miRNA在参与双向负反馈环循环调节转录因子的同时,其表达也受到miRNA调控转录因子的反向调控。miRNA-24 在造血干细胞分化过程中表达上调,抑制细胞周期进程,主要是通过直接与转录因子E2F2 mRNA的3'UTR碱基互补配对,下调其表达。同时,研究表明,在细
胞周期的特定阶段,miR-27a会抑制肿瘤抑制因子FBW7的表达,释放对其底物细胞周期蛋白E的负影响,从而促使G1期向S期转换。这些实验都说明miRNA作为一种新的调控因子,对细胞周期过程具有调控作用。miRNA也具有调控心肌细胞和骨骼肌的分化和增殖、视网膜发育、肾发展及红细胞和血管生成[等功能。但miRNA的多样性功能作用机制是研究的难点。
1.5 miRNA的形成及其调控机理
miRNA的编码基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等形式存在于基因组中,通常位于基因间或内含子区域,图1 为几种后生动物的miRNA及其前体。这些miRNA或前体先由miRNA的编码基因转录形成初级miRNA(Pri-miRNA),其长度通常大于100 bp(有时甚至有几百bp),且带有一个或多个茎环结构,经Drosha与DGCR8两种酶剪切后形成带发夹与茎环的miRNA前体结构(pre-miRNA),然后通过Exportin 5 酶将前体运送至核外,接着经Dicer1 酶和TABP2 酶作用剪去发夹环形成双链结构,之后双链解开。其中,一条链即成熟miRNA链,与靶mRNA 的3’非翻译区(UTRs)结合形成双链被称为沉默复合体(RISC);而另一条称为星号链。RISC 诱导靶mRNA 的降解或抑制其翻译成蛋白或两者兼而有之,从而在转录后水平下调靶基因表达,见图2。细胞中miRNA编码基因的拷贝数粗略估计为500,比mRNA 编码基因的拷贝数高。然而拷贝数因物种和细胞种类而异。研究发现,单链miRNA区域在形成成熟链时可生成一系列其他形式的序列,这些序列长度不同,且有着不同的3’及5’末端,被称为miRNA异构体(isomiRs)。检测表明,这些异构体为变异核酸或是3’端附加的非临时核酸序列,也可能同样具备调控功能。miRNA在生理调控方面有许多新奇的潜在价值。它们有着诸多靶标基因且可通过不同的分子途径影响生理进程。
在动物中,microRNA的合成大致可以分为在细胞核内和细胞质内两个阶段:①在细胞核内,首先编码转录microRNA的基因由多聚酶Ⅱ转录生成pri-microRNA,pri-microRNA被
核内RNaseⅢ核酸酶Drosha等一些成分构成的微处理器(microprocessor)复合体加工成发夹结构长度约55~70nt的pre- microRNA,然后在Exportin5和G蛋白因子Ean的帮助下pre- microRNA就从核进入到了胞质内;②在细胞质内,pre- microRNA在Dicer酶与结合蛋白的作用下被切割成21nt~25nt的双链microRNA分子,然后microRNA分子被解链,其中一条降解,另一条则为成熟的单链microRNA,单链microRNA进入一个核糖蛋白复合体miRNP(也叫RNA诱导的基因沉默复合物RISC),microRNA与靶基因的3’UTR区互补配对,从而实现指导miRNP复合体对靶基因mRNA进行切割或翻译抑制。
miRNA在细胞核内DNA 聚合酶Ⅱ作用下由DNA 转录为初级miRNA(pri-miRNA),在核内经RNaseⅢ-Drosha酶加工剪切释放出发夹结构前体pre-miRNA,然后由依赖RNA 的核转运受体家族成员输出蛋白5运到胞浆,在胞浆中通过RNaseⅢDicer二次加工为单链的成熟miRNA,与RNA诱导沉默复合物(RISC)结合,识别靶mRNA并抑制其翻译,或
通过去腺苷酸化和脱帽引起mRNA降解。
miRNA的作用机制研究
动物体内发现的大多数miRNA能与目的基因mRNA 3'UTR形成不完全碱基配对,从而促进翻译抑制或靶基因mRNA 的降解;而植物体内的很多miRNA指导RISC靶向含有能与其完全互补配对序列的mRNA,这种作用通过Argonuate(AGO)核酸内切酶对靶标mRNA的强烈抑制作用完成。miRNA作用机制研究主要集中于以下几点:①miRNA可能通过抑制核糖体的组装或抑制翻译起始复合物的形成或阻止polyA结合蛋白(PABP)结合到mRNA抑制翻译起始;②miRNA可能引起新生多肽链的翻译同步降解或引发大量核糖体脱落及高频次的翻译提前终止来进行翻译起始后的抑制;③一些mRNA 降解酶通过定位于被降解的mRNA 中,介导miRNA衰减mRNA,下调靶mRNA 水平。同时,相关研究发现,miRNA在某些条件下能正调控基因的表达,miR- 10 能结合到核糖体蛋白mRNA5'UTR,促进其翻译,从而促进总蛋白的合成。然而,miRNA究竟以怎样的方式靶向目的基因调控其表达的具体机制仍不得而知。与此同时,与疾病发生过程相关的miRNA表达谱也发展成熟,但如何识别miRNA的直接靶基因成为研究的最大挑战。主要的研究方法包括计算靶标预测、实验靶标的识别及靶基因的验证。前者主要依据mRNA的靶序列与成熟miRNA 5'UTR 种子序列严格互补配对,缩小其可能的靶基因范围,但无法避免假阳性和假阴性预测的发生;后者在前者的基础上,在具体的目标细胞中使用不同的实验方法进行验证。研究发现,可以对RISC 用免疫共沉淀分离miRN-AmRNA复合物,但这种免疫共沉淀方法并不一定要求体内的miRNA-mRNA能相互作用,在细胞裂解过程中人为造成miRNA与mRNA 非特异性关联会对其产生干扰。体内的miRNA-mRNA相互作用太弱也会使免疫共沉淀失败。由于miRNA的调控能改变蛋白表达水平,蛋白质组学也可能为miRNA靶标的发现提供技术支持。氨基酸的稳定同位素标记细胞培养
(SILAC)可能是鉴定受影响蛋白的一种工具。在对靶基因进行验证时,通常使用萤光酶素报告基因系统,此时,设计合适的对照组来检测miRNA-mRNA相互作用的特异性是非常重要的,如靶基因3'UTR mRNA 序列的模拟mRNA 类似序列和突变序列都不能结合在miRNA的互补位点上。 1.6 miRNA 的命名
miRNA 的命名一般按照如下规则:
1) 在命名规则确定之前发现的miRNA,如lin-4 和let-7,则保留原来名字; 2) miRNA 的成熟体简写成miR,miRNA 的前体则用mir表示,再根据其物种名称(采用3~4个字母的缩写来表示) ,以及被发现的先后顺序( 阿拉伯数字表示) ,例如mmu、hsa和rno分别代表小鼠、人和大鼠,如hsa-miR-124 和mmu-miR-124;
3) 高度同源的miRNA在数字后加上英文小写字母( a,b,c,?) ,如hsa-miR-34a、hsa-miR-34b 和has-miR-34c; 4) 通常一个miRNA 的前体长度大约为70~80nt,很可能两个臂会都会产生miRNA。
以前的做法是: 表达水平较低的miRNA 后面加上* 号,而表达水平较高的miRNA 后面不加任何符号,一般认为miRNA* 是没有功能的,但是最近有文章报道它其实是有功能的,甚至在某些组织里miRNA* 的表达量高于miRNA。现在已经逐渐取消了这种命名方式,如今认为,如果一个miRNA 前体的两个臂能够分别加工产生miRNA,则以“-5p”和“-3p”分别命名,分别表示从前体的5'端臂和3'端臂加工而来,如hsa-miR-124-5p 和has-miR-124-3p; 5) 由不同染色体上的DNA 序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的miRNA,则在后面加上阿拉伯数字以区别,如hsamiR-521-1 和hsa-miR-521-2。
2miRNA的鉴定方法 2.1 实验法
小RNA 分子的直接克隆测序仍然是目前鉴定miRNA的主要方法。
第一种方法是将组织RNA经变形聚丙烯凝胶电泳分离,回收19~25 nt的小分子RNA,将这些小分子RNA 的3′和5′连上接头,逆转录后用与接头对应的引物进行PCR扩增,然后将这些片段进行克隆,构建cDNA文库,并对每个克隆进行测序分析。
另一种方法为利用15%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离总RNA中16~28 nt的小片段,poly(A)聚合酶的作用在这些小片段的3′端进行多聚腺苷酸化反应,逆转录得到cDNA,并在cDNA的3′端进行多聚鸟苷酸化反应,后进行PCR扩增、克隆测序分析。 通过实验法直接进行miRNA的克隆,最大的优点是能够精确地确认每一个miRNA,并准确区分开只差一个碱基的家族分子。但是,这种方法也存在着明显的局限性:第一,文库构建时间较长,并且每个文库都需要经过大量的测序反应才能获得足够的数据,耗时、低效且价格昂贵;第二,有些miRNA具有组织特异性或在所研究的组织中可能低丰度表达,另外一些其它内源性非编码RNA和mRNA的降解产物产生的干扰,使该方法很难鉴定组织特异性或低表达的或具有特殊的碱基构成,存在转录后修饰的miRNA。
随着分子生物学技术的不断发展,大规模的测序技术不断涌现。利用高效测序技术,一个标签序列可以一次测出一段序列中的17个核苷酸序列。近年来高通量测序技术(如454,Solid和Solexa等测序平台)的出现使该方法得到了极大的完善,能够一次性获得百万级的高质量小RNA分子,并从全基因组范围内发掘已知和未知,保守和非保守的miRNA,大大的弥补了过去难于鉴定低丰度的miRNA缺点。以深度测序为基础的测序分析技术刚刚兴起,并且每次测序可获得3Gbp的序列需要,因此需要借助生物信息学的技术来处理分析。
2.2 生物信息学分析法
随着全基因组测序工作的完成,生物信息学方法逐渐发展成为鉴定miRNA的有力方法,同时,该方法弥补了直接克隆法的一些不足,大大提高了鉴定miRNA的效率。目前,
科研工作者根据已知miRNA的特征信息及其对靶分子的作用方式建立了多种miRNA的计算机识别方法。第一个预测软件是MiRscan,它能特异性的识别2个物种间的同源序列。该软件是由Lim等依据与已知miRNA相似性开发设计的。并且在线虫和人类中利用该软件共预测到了35和107个新miRNA。
利用已知miRNA的序列和结构的保守性在全基因组范围内搜索miRNA是分子生物学最常用的搜索方法,即通过对miRNA及其成熟序列的一级结构和二级结构的保守性分析寻找新的候选分子。典型的根据同源性搜索而设计的软件srnaloop是由哈佛大学医学院的Grad等利用miRNA的序列保守性及结构相似性设计而成的。该软件是一个类似于BLAST的应用程序,但是该软件支持更短片段并排列成互补的碱基对。该软件已在线虫中预测出214 种新的miRNA。另外,越来越多的研究者利用软件分析发现了新的miRNA,如Wang等开发的计算机方法MiRAlign是一种依靠序列和结构比对来寻找动物中的miRNA的方法。
当利用同源性没有发现新的miRNA时,就需要科研人员寻找其他的方法,如利用靶序列的保守性识别miRNA。在生物体内,同一miRNA可能调控多个靶分子;多个miRNA也可能作用于同一mRNA靶分子。目前,一些研究者利用靶序列中潜在的保守性作为识别miRNA的重要依据。在成熟miRNA中的种子序列(2~8位置的7个核苷酸),他们在与靶mRNA 结合中起着重要的作用。Xie等在mRNA 的3′非翻译区发现了106个保守的基本序列,其中72个与大约一半的已知miRNA5′端相结合组成6~8 bp的种子双螺旋。findMicroRNA软件是Adai等在拟南芥中利用单基因组方法设计的搜索miRNA的软件,该软件主要用于植物miRNA的鉴定。它主要依赖miRNA与其对应的靶序列紧密互补来识别候选miRNA。之后该软件将进一步对这些候选miRNA的成熟序列的相邻序列的互补性进行分析, 使得一个RNA内的茎环结构的组成和已知miRNA前体结构保持一致。拟南芥基因组中有29 399个转录本可以和27 987个特定基因座相对应, 用此软件对其分析可以在基因间隔区内识别潜在的microRNA前体序列。
实验方法和生物信息学方法由于各有优缺点,因此,单一的方法可能不能满足试验的需要,或鉴定不出某些特异性的miRNA序列,因此,需要科研工作者同时结合这两个方法,这样在能在各种物种中准确的找到尽可能多的新的miRNA。
3miRNA的检测方法 3.1 miRNA芯片技术
基因芯片技术是近年来兴起的一种高通量、灵敏度较高的检测基因表达的方法。该方法能够在短时间内同时检测到所有已知miRNA的表达谱。miRNA表达谱的精确分析是研究miRNA在生物体中的功能及其所发挥的作用的基础。目前,有关该技术已经广泛应用于各种生物体的miRNA的表达谱分析,主要包括各种组织miRNA表达谱以及在各种生理和病理状态下的miRNA表达谱。miRNA芯片的制作中关键的步骤就是探针的设计,一般表达谱芯片采用合成的寡核苷酸或cDNA片段作为捕获探针,对转录本的高特异性和高亲和度是理想探针的目标。由于miRNA的杂交温度和成熟序列长度的限制,使得对探针的设计也受到了一定程度的限制。当利用特定的温度标记芯片的miRNA探针时,高Tm值的探针和低Tm值的探针将可能产生不平行或非特异性的信号理论上基因芯片并不能进行定量的测量,由于不同的miRNA具有不同的亲和力,但是基因芯片可以用于不同状态下miRNA表达量的比较分析。因此,通常科研人员会利用增加或减少探针的碱基长度来平衡探针的杂交温度,已获得更精确的芯片分析结果。
Liu等用含有245个人类及模式动物鼠的基因组探针的微芯片筛选miRNA,Chen Jian-Fu等通过基因芯片的方法证实了miR-1与miR-133在肌肉的发育过程中能够起到调节作用。但是,基因芯片的方法也存在着一定的不足之处,主要包括制作和检测均需要昂贵的仪器设备,而且结果的重复性比较差;对于不同的miRNA需要优化不同的杂交条件,因此对于高度相似的miRNA或同一家族中的miRNA很难区分。
最新研究结果显示,一种新的液相芯片将为后基因组时代的科学发展提供一种新的强有力的技术支持。该芯片的体系是由许多不同的小球体为主要基质所构成的,其中每个小球体上固定不同的探针分子,在每一个特定的探针上都具有一个独特的色彩编号以区分不同的探针,将这些小球体悬浮于一个液相体系中,就构成了液相芯片系统。该方法能够对同一个样品的不同分子进行快速定性,定量分析,因此这种方法也成为xMAP技术。这种精确的能够同时定性,定量的分析方法,具有非常广泛的应用前景。 3.2 RNA印迹检测方法
该方法也叫做Northern blot,广泛应用于检测分析miRNA的表达。RNA印迹通过凝胶电泳的方法将不同大小和不同分子量的总RNA进行分离,并将分离得到的RNA 转移至尼龙膜或硝酸纤维素膜上与已知标记的探针进行杂交。所得结果可同时用于miRNA的表达水平的定量检测,和用于区分miRNA前体与成熟体的位置。因此,该方法被誉之miRNA检测的“金标准”。
目前,地高辛(DIG)标记和生物素(BIOTIN)标记等一些无放射性的探针标记方法已被广泛应用。但是该方法灵敏度和特异性不高,鉴于此,科研工作者发展了用锁核酸(LNA)修饰的杂交探针取代传统的方法。渗入LNA可使探针在短时间内获得较高的Tm值,同时渗入LNA的探针与核酸序列杂交具有严格的序列特异性,在每3个碱基中渗入1个LNA,可以达到最好的杂交效果,研究表明,LNA修饰的寡核苷酸探针能够使检测的灵敏度较传统方法提高100倍以上。 3.3 原位杂交检测方法
即miRNA ISH,通过将组织或细胞中的核酸与标记的DNA或RNA核酸探针进行杂交,检测互补DNA或RNA在组织、细胞和亚细胞中位置,这种技术,就叫做原位杂交。特异性的原位杂交可以检测细胞,胚胎以及在福尔马林固定或石蜡包埋组织中miRNA的表达,该方法能更直观的展现miRNA的空间表达模式。该方法可以用来检测细胞水平的miRNA,
还可以检测和比较不同细胞系中的miRNA的表达。但是其主要缺点是技术掌握困难,所用试剂价格昂贵,试验周期长。
LNA 也同样是原位杂交技术中最常用的探针。Wienholds等首次应用LNA探针在斑马鱼中检测了数百个miRNA的空间表达模式。随着科技的发展,原位杂交的技术也得到了改进,Robert等采用RNA探针,利用TMAC的高严谨洗涤及RNaseA处理产生序列特异性的杂交条件来检测成熟的miRNA。应用LNA修饰的miRNA寡聚核苷酸探针的原位杂交目前已经成功用于斑马鱼、小鼠、鸡等物种的胚胎或组织切片研究。 3.4 荧光定量PCR检测方法
成熟的miRNA分子片段较短,常规的RT-PCR无法完成miRNA的定量或半定量检测。茎环状引物以及RNA加尾和引物延伸RT-PCR方法的发明,较好的解决了这一问题。实时定量PCR的最大优点是其检测具有较高的精度及灵敏度,不需要标记,操作简单等。利用茎环状引物所涉及的荧光定量PCR引物,能够在短时间内获得多个结果,检测多个miRNA的表达并且需要的RNA量也相对较少,因此被广泛用于组织miRNA表达谱的构建。
Stem-loop实时定量PCR是miRNA进行实时荧光定量分析的主要检测方法。该方法具有以下几个优点:特异性高,特异的茎环反转录引物能够保证定量反应不受前体的干扰,并可精确辨识高度同源的miR?NA序列;所需样品较少,需要的总RNA量仅1~10 ng左右;定量线性范围较宽和检测灵敏度较高,从几个拷贝到几万个拷贝,定量线性范围可以跨越7个数量级;适用范围广,纯化的RNA、总RNA以及细胞裂解物均可以用于检测miRNA的表达量,同时,还可以进行单细胞的miRNA表达谱分析。Varkonyi-Gasic等利用该技术成功地对拟南芥中多种miRNA进行了差异表达分析。
4 microRNA 对动物表型调控的研究进展
自从1993 年首次在线虫中发现microRNA 以来,越来越多的micoRNA相继被报道,
它们通过与靶mRNA 的特异位点结合,抑制靶蛋白的产生或者降解mRNA,从而调节内源基因表达,miRNA在基因转录组调控网络中扮演了重要的角色。 4.1 miRNA参与动物表型调控
小鼠作为分子生物学研究的模式生物,一直以来都是科学家们研究动物表型性状的良好模型。科学家们通过在肥胖小鼠的肝脏和白色脂肪组织( WAT) 中过表达miR-335,发现小鼠会发生病理性肥胖症,表明miR-335 参与了小鼠肥胖发育的调节,通过过表达miR-143 科学家发现了相同的症状,并且发现miR-143 与脂肪细胞分化marker 基因: PPAR、aP2 的表达量相关。
microRNA 对动物骨骼肌表型的调控作用主要是通过调节肌细胞的增殖与分化来实现的,为了了解microRNA 在肌肉发育中的重要作用,研究者们做了大量工作。miR-155 是一种多功能的microRNA,参与细胞增殖和分化等多种生物学功能,一些研究证明,miR-155 可促进肌肉细胞的增殖和分化。通过分析miR-155 在长白猪(瘦肉型) 和通城猪(脂肪型) 骨骼肌发育过程中的表达变化,发现在长白和通城猪骨骼肌发育过程中其呈现不同的表达模式,这就说明,miR-155能影响猪骨骼肌发育,与猪肌肉的表型有关。同样在哺乳动物中,The Olfactomedin-like 3( OLFML3) 基因对产后骨骼肌的生长发育起调控作用并随着发育下调表达,最终影响其表型,研究发现miR-155 对OLFML3 的表达也起到了调控作用。miR-148a 是一个新发现的肌源性microRNA,参与肌肉分化。过表达miR-148a,促进肌细胞分化,敲低miR-148a,抑制了肌肉分化。通过生物信息学分析,发现了ROCK1 ( rhoassociated coiled-coil containing protein kinase 1) 基因,它对肌细胞生成起抑制作用,进一步的研究发现miR-148a 作用于ROCK1 的3' UTR 区,miR-148a通过与靶基因结合并对其进行降解,解除掉了ROCK1 对肌肉生长的抑制作用,从而促进肌肉分化。miR-1、miR-206、miR-181 以及miR-29也都是通过促进肌细胞分化的形式影响骨骼肌表型的。
4.2 microRNA 敲除对动物表型的影响
科学家们发现,在小鼠中敲除Dicer、Dgcr8基因,会导致成熟的miRNA无法合成,从而小鼠在胚胎早期死于严重的发育缺陷。进一步的研究发现Dicer、Dgcr8、Drosha、Ago2 都参与成熟miRNA的合成,是小鼠生存的必需因子,同时,Dicer 以及miRNA也是形成动物皮肤、脊椎肋骨、肺脏的上皮细胞所必需的关键因子。在家猪的卵母细胞和胚胎中也发现Dicer 酶和miRNA表达,与dicer 酶特异的miRNA比如像miR-24 的表达量随着胚胎发育的不同时期和培养条件在不断变化,这种与dicer 特异的miRNA可以作为评判胚胎质量的标记基因。miR-8是参与调控果蝇体型的microRNA,miR-200s 是从果蝇延伸到哺乳动物研究中的。miR-200 家族有5 个成员: miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429。通过制备基因敲除小鼠,并与转基因小鼠杂交,获得了在脂肪细胞中剔除目的基因的小鼠,对小鼠的生长发育、生理生化和代谢指标及组织形态等多个方面进行表型分析,发现剔除目的基因簇的小鼠无胚胎致死性,并且在4 周龄的时候开始出现生长减缓的现象,体内沉积脂肪量较对照小鼠减少了一半。用生物信息学软件进一步对miR-200 靶基因和互作关系做出预测,结果发现PI3K-Akt-mT0R 等生长发育和脂肪代谢的相关信号通路被抑制是导致基因剔除小鼠山现体重减轻、脂肪减少的主要原因。在果蝇中与miR-200 功能相似的是miR-8,通过对胰岛素信号通路研究发现,果蝇的保守性microRNA miR-8 /miR-200 作用于靶基因USH/FOG2,再通过USH/FOG2 抑制PI3K 的活性来抑制细胞的生长,从而使果蝇的体型发生改变。在2012 年,科学家又发现miR-8 通过调节果蝇发育的成熟度也可以改变其体尺的大小39。miR-1 在肌肉组织中特异表达,对苍蝇敲除miR-1,会造成苍蝇在胚胎发育期死亡,或者在幼虫时期肌肉分化异常。尽管在哺乳动物中,miR-1 存在miR-1-1 和miR-1-2 两种形式,在小鼠中仅仅对miR-1-2 进行敲除,就有50% 的胚胎死于心肌缺陷,这种功能性单倍剂量不足表明miR-1是心肌发育所必需的。
COTYLEDON(CUP)1,2 等的作用,调控分裂组织的边界和胚胎、营养器官和花的形成,miR-164 过量表达会导致花器官或叶子的融合。Brennecke等在果蝇中发现,
microRNA-bantam 作用于基因hid,并负性调节细胞的程序性死亡。Giraldez等在dicer 突变型斑马鱼的胚胎中注射miR-430,有效地改变了大脑畸形,也可在某种程度上调节神经发育。在人类衰老相关性疾病中,如心脑血管性疾病、纤维化疾病、神经退行性疾病等,都存在microRNA 差异性改变。Hebert 等发现,阿兹海默症患者的大脑组织中miR-29 的表达量下调。Persengiev等发现,在人的小脑衰老过程中,miR-144 表达量升高。Drummond 等发现,在人类骨骼肌细胞衰老过程中Let-7b 和Let-7c 的表达量升高。microRNA 的异常表达也与许多疾病相关,如癌症、精神分裂症、肾功能障碍、妥瑞综合症、牛皮癣、原发性肌肉疾病、脆性X 染色体综合症、慢性肝炎、真性红细胞增多、艾滋病和肥胖等。现已证实,microRNA 广泛存在于真核生物体细胞中,是最大的基因家族之一,大约占整个基因组的1%,每个microRNA 都具有上百甚至上千个靶基因,如Calin等证明
miR-15a/16-1 家族能够直接或间接调控白细胞中14%的基因。至今人们已发现人类有1/3 的基因受到microRNA 的调控。
microRNA 在细胞的衰老过程中具有重要的调控作用,而细胞衰老是导致组织和机体衰老的重要因素。如Menghini等发现,microRNA-217 能够同时抑制SIRT1 和FOXO1 的去乙酰化,诱导内皮细胞的衰老。Mudhasani等发现,一些microRNA的缺失能够导致P53 和P19 的表达量升高,使胚胎成纤维细胞衰老。Bai 等发现,miR-34a 和miR-335 在肾脏系膜细胞衰老过程中表达上调,导致细胞线粒体中的活性氧自由基升高,引起细胞的衰老。microRNA 也被证实在胚胎干细胞中,对干细胞的自我更新、多向分化有着重要的调控作用。首次发现的调控分化证据来自小鼠和人类胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)的研究。microRNA 的缺失会导致体外培养的胚胎干细胞增殖和分化能力缺失,而且dicer 酶缺失的小鼠也会在发育早期死亡。研究表明,胚胎干细胞中表达特异的microRNA,如
Morin 等的多项研究证明,在鼠或人的ESC 分化过程中存在一系列的microRNA 差异表达。干细胞中这些microRNA 的表达水平并不是很高,但microRNA 在不同细胞状态动态水平的差异,也间接证明了microRNA 对干细胞特性的调节作用。microRNA 调节基因在转录后的表达水平,而且对于hESC的自我更新能力、干性的维持和分化至关重要。干细胞中的核心转录因子,如Oct4、Sox2 和Nanog能够促进胚胎干细胞中特有的基因表达,并抑制分化,而如果将这些核心转录子导入鼠或人的成体细胞中,则能够将成体细胞重编程为细胞表型、功能都与胚胎干细胞类似的诱导多能干细胞(IPSCs)。而一些microRNA 已经证明与这些核心的转录因子有直接的联系,如miR-145 抑制核心转录因子Oct-4、Sox2、kif4 的3'UTR 端。miR-134、miR-296、和miR-470 靶向抑制小鼠Nanog、Oct-4、Sox2 的DNA 编码序列。成熟的microRNA 在Ago2 等蛋白的引导下,结合到RNA 诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing coplex,RISC),并由RISC 介导,通过microRNAs5' 端第2~7 碱基的8 个核苷酸序列,即“种子序列”(Seed sequence),与靶向mRNA 的3' 端非翻译区(3'untranslate region,3'UTR)结合,对靶基因进行切割或翻译抑制,从而调控基因的表达。实际上,大多数的生物信息学分析软件预测microRNA 的靶基因时,都是遵循这个种子序列配对的原则。大量研究也表明,遵循该种子序列配对方法预测的靶基因大部分是正确的,也就有了“种子规律”这一经典的预测microRNA 干预靶基因的理论方法。但是,也有些microRNA 不遵循此规律,而仍然起到基因沉默的作用。近期的研究表明,microRNA 除了作用于mRNA 的3'UTR 的经典沉默机制,还可以作用于5'UTR、启动子区,甚至是mRNA 的编码区。而且,microRNA 对靶基因的选择并不要求种子序列完全配对。因此,一个microRNA可能同时抑制上百个不同的信使RNA。所以,microRNA 的作用也可视为它对多个靶点抑制的协同作用结果。
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